專利名稱：與小麥抗白粉病基因緊密連鎖的scar分子標記的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業生物技術工程，特別涉及與白粉病抗性基因緊密連鎖的SCAR分子標記及其獲得方法。
背景技術：
由專性寄生真菌小麥白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)引起的小麥白粉病是危害小麥生產的主要病害之一。近年來，隨著矮稈、半矮稈小麥品種的推廣，田間栽培密度的增加以及水肥條件的改善，該病害在我國南北麥區危害程度日趨嚴重，成為當前小麥高產、穩產的主要障礙因素之一。1990年小麥白粉病在全國39％的小麥種植區流行，造成產量損失達4億公斤。目前，小麥白粉病已經成為威脅我國小麥生產的常見病害之一，所以對該病的防治刻不容緩。
盡管實踐中可以采取化學藥劑來防治小麥白粉病，但是，培育抗病品種是最為安全、經濟、有效的措施。70年代初，我國引入具1B/1R的小麥衍生品種做為抗源，曾經一度有90％以上的品種攜有Pm8抗白粉病基因，由于抗性基因的單一性，結果導致小麥白粉病在全國范圍內多次大流行。此后，我國小麥育種家致力于多方引入和轉育具有新抗病基因的品種，但由于有些抗病基因在不同遺傳背景中表達不一致，致使真正用于生產實際的抗白粉病基因很少，在育種中應用的僅有Pm4a、Pm4b、Pm6、Pm8及其組合Pm2+6、Pm2+4等，再加上小麥白粉病菌具有群體大，適應范圍廣，生理小種多且毒力變異快等特點，使得許多花費多年時間培育的抗病品種(系)剛應用不久，有的甚至還未應用，便由于病菌群體毒性的變化而喪失了抗性。“九五”期間，Pm4a、Pm6在全國各地均已開始喪失抗性。二十世紀末，北京地區推出了我國第一個自行轉育成功并定名的Pm21基因。目前，我國小麥育種項目中較為廣泛地利用了該基因，應引起警惕，防止抗源單一現象再次發生，有效地控制白粉病的流行。為此就必須大力挖掘和利用新抗源并不斷地進行抗病基因的累加，培育抗性持久的小麥品種。
為實現上述任務，挖掘新抗源，以往，育種家們大多借助形態學標記和生化標記來輔助育種，但這類標記具有工作量大、標記數量少、易受環境影響等缺點。隨著分子生物學的發展，一類基于DNA變異的分子標記技術已經被國內外許多學者應用于小麥抗白粉病研究。應用分子標記，可以免除傳統育種中繁重的工作程序，跟蹤、檢測外源基因，還可以把多個抗白粉病基因聚合到同一優良品種中，獲得持久抗性。此外，將基因精確定位于高密度的分子圖譜上，以緊密連鎖的分子標記為起點，應用染色體步行(Chromosome Walking)等方法，逐漸逼近目標基因，最終克隆該基因。實踐證明DNA分子標記是進行抗病性鑒定和輔助育種研究的重要工具。
小麥對白粉病的抗性主要由主效基因控制，早期基因符號為M1，正式命名的基因符號為Pm(powdery mildew)。自從1930年澳大利亞學者首次報道了澳大利亞春小麥品種Thew攜帶一個顯性抗白粉病基因以來，至今已鑒定出30個Pm基因位點，除Pm29外，其余主效基因已被定位到染色體或染色體臂上。此外尚有抗病基因未被正式命名，臨時以M1表示。自從90年代初開展小麥抗白粉病基因分子標記研究以來，已有接近一半的抗病基因找到了相應的分子標記，但仍有很多抗白粉病的未知基因，尚未篩選出分子標記。因此，繼續用分子標記的方法，篩選與抗白粉病基因相關的標記，在農業上有重要應用價值。

發明內容
解決的問題本發明是針對上述情況，用分子生物學方法以強抗小麥品種Brock為材料篩選和尋找新的、而且穩定存在與白粉病抗性基因緊密連鎖的分子標記及其方法，用于小麥白粉病輔助選擇育種，從而克服了常規遺傳育種周期長等缺點；由于研究所用材料為對15號生理小種免疫的小麥品種(15號生理小種為混合型生理小種，為華北地區流行的多種白粉病病菌)，其對華北地區白粉病菌具有比較廣普的抗性。因此，根據所得分子標記有望克隆到新的白粉病抗性基因。
技術方案與小麥抗白粉病基因相連鎖的SCAR分子標記，其特征在于所述的分子標記SCAR860、SCAR200，它是用RAPD分子標記方法篩選出S2092972分子標記，再將S2092972轉換成穩定的SCAR標記，該標記是采用下述方法得到的(1)抗病基因供體親本來自英國普通小麥品種Brock，其與感病普通小麥親本015和感病親本京411進行雜交，雜交組合為“Brock/015//京411”，抗病單株是通過雜交、回交和自交，從抗白粉病穩定的高世代株系中得到；(2)用苯酚-氯仿方法提取小麥親本幼苗及雜交后代幼苗DNA；(3)采用RAPD分子標記方法，進行與小麥白粉病抗性相關的分子標記的篩選；(4)篩選出一個RAPD分子標記S2092900，經過連鎖性鑒定，發現該標記與小麥抗白粉病基因相連鎖，與抗性基因的遺傳距離為4.3cM；(5)將S2092900克隆并測序并轉換為SCAR標記，即SCAR860、SCAR200。
采用RAPD分子標記方法，進行與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記，其篩選的具體做法是
·標記篩選利用120個Operon和93個S系列隨機引物(10bp)在抗性親本Brock、感親本京411以及它們的雜交、回交后代抗性單株間進行DNA多態性分析，即用RAPD標記技術篩選，采用10bp寡核苷酸作為隨機引物，在PE-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20ng/μl小麥基因組DNA1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，總體系25μl，反應程序96℃變性1分鐘、35℃退火1分鐘、72℃延伸2分鐘、4個循環，94℃變性45秒、36℃退火1分鐘、72℃延伸90秒、45個循環，72℃補齊10分鐘；產物檢測在含有0.5％μg/μl EB的1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果。
·分子標記的連鎖性鑒定利用Brock×京411 F2群體131株單株為材料進行分子標記與抗病基因間連鎖性分析。小麥雜交后代(131株單株)白粉病抗性鑒定在田間進行，白粉菌接種在孕穗期的小麥苗，將帶菌感病對照株移栽至田間待鑒定的材料旁，通過自然傳播接種，2-3周后調查抗病性，調查級別分0、0；為免疫，1-4級分別表示高強抗、抗、敏感、高度敏感。抗性鑒定表明，101株為抗病，30株為感病，分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用上述同樣的反應體系及程序，用引物S2092進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapmakerEXP3.0b計算標記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。臨界LOD值為3.0，根據Kosambi函數，將重組率轉變成圖距單位厘摩爾(cM)。
·SCAR標記的轉換首先將S2092900克隆在細菌質粒PGEM-T easy Vector上，經雙端測序后，S2092900分子標記的實際長度為972bp(提交GenBank，登錄號為AY324385)，根據該序列設計并合成3個SCAR引物，命名為S2092972A、S2092972B、S2092972C，其A與B為一對、A與C為一對，在Brock、雜交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性單株中分別進行擴增，在抗性單株中均能擴增出預計的兩個SCAR標記SCAR860和SCAR200，為了檢測這兩個SCAR標記的可靠性，我們對Brock×京411的F2分離群體抗感個體進行了分析。結果表明，在F2分離出的抗性個體中都檢測到了這兩個SCAR標記，而感病個體中沒有發現，SCAR標記在抗、感單株中出現的規律與RAPD標記相一致。
上述轉化工作的具體做法如下a)抗性片段的克隆測序參照經典的克隆DNA片段的實驗方法低熔點瓊脂糖純化PCR產物，PGEM-Teasy Vector(Promega)連接，轉化大腸桿菌Jm109，重組質粒經T7、Sp6 PCR電泳檢測，EcoR I酶切鑒定，獲得陽性克隆子，送Sangon測序。將測序結果用生物信息學SMS進行分析，并通過Internet與GenBank國際基因數據庫進行同源性分析。
b)引物設計及SCAR分析用根據S2092972序列設計并合成的上述兩對SCAR引物S2092972A 5’GGTTGTTCCCAAAGAGGTCA 3’S2092972B 5’ATGTTTGAAGCAGGGTGCAG 3’S2092972C 5’TCCTCAATCTGGAGGGACAC 3’，在Brock、雜交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性單株中分別進行擴增，反應條件如下反應體系為25μl，各組分物質的含量分別為template 20ng；10×Buffer 2.5μl；MgCl21.6mM；dNTP 0.15mmol/L；5pmol primer Taq 1.25U，ddH2O補齊25μl，混勻，離心收集，在PTC-150-25上進行反應，反應程序如下94℃變性3min，64℃退火2min，72℃延伸2min，30個循環，72℃ 5min，4℃保存。1.0％瓊脂糖凝膠(含EB)，電泳1小時，紫外反射透射分析儀觀察并照相。
有益效果白粉病是影響小麥生產的一種嚴重病害。本發明是利用分子標記方法得到一個新的與白粉病抗性基因緊密連鎖的RAPD分子標記，并通過克隆、測序、引物設計，又將RAPD標記轉換成穩定的SCAR標記。利用這種方法，不僅克服了常規育種方法所需時間周期長等缺點，而且能夠有目標地將抗病基因在實驗室內選擇得到，還可以有目的地聚合多個抗白粉病基因、培育出具有穩定抗性的小麥新品種，同時也可利用這個新白粉病抗性基因的分子標記克隆抗白粉病基因，并對其進行結構和功能分析，這對于進一步了解小麥抗白粉病的分子遺傳學機理有積極意義。因此，本研究結果在小麥育種實踐及抗病理論研究上都很有價值。其優點具體歸納如下(1)本發明的與白粉病抗性基因緊密連鎖的分子標記，是在對華北地區白粉病菌免疫的小麥品種Brock及其抗性穩定的雜交后代單株中獲得的新的標記，對15號生理小種均有抗性，而且穩定存在，可以用于小麥白粉病品種鑒定和小麥抗病后代的輔助選擇育種。
(2)本研究所用材料為對15號生理小種(為混合型生理小種，為華北地區流行的多種白粉病病菌)免疫的小麥品種，對華北地區白粉病菌具有比較廣普的抗性。因此，根據所得分子標記有望克隆到新的白粉病抗性基因。
(3)本標記為穩定的SCAR標記，并且與抗白粉病基因緊密連鎖(遺傳距離為4.3cM)，可直接用于小麥抗白粉病分子標記的輔助選擇育種，同時為克隆小麥抗白粉病基因、基因序列分析以及轉抗白粉病基因小麥研究奠定了良好基礎。


圖1京411、抗性單株、Brock基因組DNA的RAPD分子標記S2092900
篩選電泳譜帶圖；圖2檢測分子標記S2092900與抗白粉病連鎖的電泳譜帶圖；圖3SCAR860、SCAR200標記譜帶圖；圖4SCAR860和SCAR200標記在抗病親本和抗病單株中的分布譜帶圖；圖1-4中符號分別表示為1感病親本京411；2抗性單株；3抗病品種Brock；MλDNA Hind III/EcoR I Markers；R有特異帶的雜交后代抗病單株；R*沒有特異帶，但表型為抗病的雜交后代單株；S沒有特異帶的雜交后代感病單株；
具體實施例方式(結合附圖具體說明)實施例1用RAPD分子標記方法，得到與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記S2092900.該分子標記的實際長度為972bp，用SCAR方法轉換成SCAR860、SCAR200兩個穩定的分子標記。
具體做法是抗病基因供體親本為英國普通小麥品種Brock，其與感病普通小麥品系015和感病親本京411進行雜交，用京411回交，組合為“Brock/015//京4117”，抗病單株是通過雜交、回交和自交，從抗白粉病穩定的高世代株系中得到的。用于連鎖性鑒定的抗、感單株則是Brock/京411F2中分離得到，包括101個抗性個體和30個感病個體；一、提取DNA取小麥葉片0.2g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取緩沖液(50mMTris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；50mM NaCl)，65℃溫浴15分鐘，其間顛倒混勻2-3次，0℃冰浴10分鐘。3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液，加入等體積Tris-HCl(pH8.0)飽和酚，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入等體積酚、氯仿和異戊醇(25∶24∶1)抽提，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入等體積氯仿，顛倒混勻，3000轉/分鐘離心10分鐘。取上清液，加入兩倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀2個小時，12000轉/分鐘離心20分鐘，傾去上清液，70％乙醇洗滌沉淀兩次，自然涼干后溶于100μl TE中。加入1μl RNase(10mg/ml)，37℃保溫1小時，以除去樣品中的RNA，加入等體積的酚、氯仿抽提一次，3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液，再用等體積的氯仿抽提一次，加入兩倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀2小時以上，12000轉/分鐘離心20分鐘，70％7醇洗滌沉淀兩次，風干后，溶于50μl TE中。紫外分光光度法檢測DNA樣品的濃度，0.7％的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。
二、擴增多態性DNA(RAPD)分析RAPD引物為OP系列120個，購自美國OPERON公司(即10bp寡核苷酸)S系列93個，購自上海生物工程公司，總共213個。
1.PCR擴增(1)反應體系為小麥基因組20ng/μlDNA 1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP 0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，總體系25μl。混勻，瞬間離心收集，美國PE公司PE9700進行反應。
(2)反應程序96℃變性1分鐘，35℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，4個循環；94℃變性45秒，36℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，45個循環；72℃補齊10分鐘。
2電泳檢測取擴增產物8μl，1.4％的瓊脂糖凝膠(含有0.5％μg/μl EB)電泳，紫外燈下觀察并照相。
我們利用213個隨機引物對京411和雜交后代抗病單株進行了RAPD分析，發現只有引物S2092的擴增產物在京411和抗病單株和Brock中表現多態性。圖1是引物S2092的擴增結果，在抗病單株和Brock中能觀察到一條分子量約為900bp的特異帶S2092900，重復實驗三次，此帶仍能穩定出現。如圖1所示1，京411、2，抗病單株、3，Brock。說明這條特異帶可能與小麥抗白粉病特性存在聯系。
三、RAPD分子標記S2092900的連鎖性鑒定小麥雜交后代白粉病抗性鑒定在田間進行，白粉菌接種在孕穗期的小麥苗，將帶菌感病對照株移栽至田間待鑒定的材料旁，通過自然傳播接種，2-3周后調查抗病性，調查級別分為免疫、強抗、抗、感和高感。分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用上述同樣的反應體系及程序，用引物S22092進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapmakerEXP3.0b計算標記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。以S2092對雜交后代群體131個單株進行PCR擴增。結果顯示，101個抗病單株中有95株存在特異帶，6株沒有特異帶；30個感病單株中均沒有特異帶。這一實驗結果表明特異DNA片段S2092900與小麥的抗病性是緊密連鎖的，但在抗病和感病單株中都有一定的交換。如圖2所示R是有S2092900特異帶的雜交后代抗病單株；R*是沒有S2092900特異帶，但表型為抗病的雜交后代單株，表明發生了交換；S是沒有S2092900特異帶的雜交后代感病單株；經計算，S2092900與抗病基因間的遺傳距離為4.3cM。
四、S2092900的克隆、測序與SCAR標記轉換為了將S2092900轉換成穩定的SCAR標記，將S2092900DNA片段用低熔點瓊脂糖凝膠純化，純化的DNA片段與PGEM-T easy Vector(Promega)連接，轉化大腸桿菌Jm109，重組質粒經T7、Sp6 PCR電泳檢測，EcoR I酶切鑒定，獲得陽性克隆子，送Sangon測序。將測序結果用生物信息學SMS進行分析，并通過Internet與GenBank國際基因數據庫進行同源性分析。經雙端測序后，S2092900標記共由972個bp組成。由于從GenBank沒有查詢到相關的基因序列與該片段同源，該片段可以認為是Brock中與抗白粉病基因相連鎖的新的分子標記。
根據克隆片段的DNA序列，我們合成了3個20堿基的SCAR標記引物，并命名為S2092972A、S2092972B、S2092972C，序列如下S2092972A 5’GGTTGTTCCCAAAGAGGTCA 3’S2092972B 5’ATGTTTGAAGCAGGGTGCAG 3’S2092972C 5’TCCTCAATCTGGAGGGACAC 3’其中引物A含有RAPD分子標記S2092的10mer引物序列，并向3’端延伸10個堿基，引物B和C分別根據S2092972序列中堿基設計而成，不含RAPD分子標記S2092的隨機引物序列。用上述引物在Brock、雜交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性單株中分別進行擴增，反應條件為反應體系為25μl，各組分物質的含量分別為template 20ng；10×Buffer 2.5μl；MgCl21.6mM；dNTP0.15mmol/L；5pmol primer；Taq 1.25U，ddH2O補齊25μl，混勻，離心收集，在PTC-150-25上進行反應，反應程序如下94℃變性3min，64℃退火2min，72℃延伸2min，30個循環，72℃ 5min，4℃保存。1.0％瓊脂糖凝膠(含EB)，電泳1小時，紫外反射透射分析儀觀察并照相。擴增結果證明，在Brock、雜交、回交(Brock/015//京4117)后代抗性單株中分別擴增出860bp和200bp兩個特異帶。而在京411中則沒有檢測到這兩條特異帶如圖3所示。在圖3中，M1DL2000Marker，M2λDNA EcoRI/HindIII Marker.1，2SCAR860；3，4SCAR200.
為了檢測這兩個SCAR標記的可靠性，我們對Brock×京411的F2分離群體抗感個體進行了分析。結果表明，在F2分離出的抗性個體中都檢測到了這兩個SCAR標記，而感病個體中沒有發現，如圖4所示。在圖4中，M為λDNAEcoRI/HindIII Marker。
權利要求
1.小麥抗白粉病基因相緊密連鎖的分子標記，其特征在于所述的分子標記SCAR860、SCAR200，是用RAPD分子標記方法篩選出S2092972分子標記，再將S2092972轉換成穩定的SCAR標記，該標記是采用下述方法得到的(1)抗病基因供體親本來自英國普通小麥品種Brock，其與感病普通小麥品系015和感病親本京411進行雜交，雜交組合為“Brock/015//京411”，抗病單株是通過雜交、回交和自交，從抗白粉病穩定的高世代株系中得到；(2)用苯酚-氯仿方法提取小麥親本幼苗及雜交后代幼苗DNA；(3)采用RAPD分子標記方法，進行與小麥白粉病抗性相關的分子標記的篩選；(4)篩選出一個RAPD分子標記S2092900，經過連鎖性鑒定，發現該標記與小麥抗白粉病基因相連鎖，與抗性基因的遺傳距離為4.3cM。(5)將S2092900轉換為SCAR標記，即SCAR860、SCAR200。
2.按照權利要求1所述的與小麥抗白粉病基因緊密連鎖的分子標記，其特征在于采用RAPD分子標記方法，進行與小麥白粉病抗性相關的分子標記，其篩選的具體做法是用10bp隨機引物在抗、感親本以及它們的雜交后代間DNA多態性分析，即用RAPD標記技術篩選，采用美國OPERON公司開發的10bp寡核苷酸作為隨機引物，在PE-9700PCR儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為20ng/μl小麥基因組DNA1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mMdNTP0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，總體系25μl，反應程序96℃變性1分鐘、35℃退火1分鐘、72℃延伸2分鐘、4個循環，94℃變性45秒、36℃退火1分鐘、72℃延伸90秒、45個循環，72℃補齊10分鐘；產物檢測在含有0.5％μg/μl EB的1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相記錄結果；
3.按照權利要求1所述的與小麥抗白粉病基因緊密連鎖的分子標記，其特征在于分子標記的連鎖性鑒定，即小麥雜交后代白粉病抗性鑒定在田間進行，白粉菌接種在孕穗期的小麥苗，將帶菌感病對照株移栽至田間待鑒定的材料旁，通過自然傳播接種，2-3周后調查抗病性，調查級別分為免疫、強抗、抗、感和高感。分別提取抗病、感病單株的總體DNA，用上述同樣的反應體系及程序，用引物S22092進行單株的PCR擴增，統計抗、感單株標記帶的出現頻率和交換類型并計算交換值，用MapmakerEXP3.0b計算標記與抗白粉病基因之間的遺傳距離。
4.按照權利要求1所述的與小麥抗白粉病基因緊密連鎖的分子標記，其特征在于將S2092900轉換成穩定的SCAR標記，是這樣實現的首先將該標記克隆在細菌質粒PGEM-T easy Vector上，經雙端測序后，S2092900分子標記的實際長度為972bp，根據該序列設計并合成3個SCAR引物，命名為S2092972A、S2092972B、S2092972C，其A與B為一對、A與C為一對，在Brock、雜交、回交即Brock/015//京4117后代抗性單株中分別進行擴增，在抗性單株中均能擴增出預計的兩個SCAR標記SCAR860和SCAR200，為了檢測這兩個SCAR標記的可靠性，對Brock×京411的F2分離群體抗感個體進行了分析，其結果在F2分離出的抗性個體中都檢測到了這兩個SCAR標記，而感病個體中沒有。
全文摘要
與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記屬于農業生物技術工程，特別涉及與小麥抗白粉病基因相連鎖的分子標記及其獲得方法。本發明克服常規標記方法工作量大、易受環境影響、育種周期長等缺點。采用RAPD分子標記方法對抗、感小麥親本及抗病雜交后代“Brock/015//京411”進行抗性標記篩選。RAPD標記用10bp寡核苷酸為隨機引物，得到與小麥抗白粉病基因相連鎖的新分子標記S209文檔編號C12Q1/68GK1556218SQ20031012206
公開日2004年12月22日 申請日期2003年12月31日 優先權日2003年12月31日
發明者彭永康, 陳宏 , 王振英 申請人:天津市農業生物技術研究中心