專利名稱：一種油菜雄性不育恢復基因分子標記的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于油菜育種和分子生物學領域，更具體地涉及一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記的制備方法，同時還涉及一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記在油菜雜交種親本選育中的應用。
背景技術：
目前，雜交油菜的推廣面積已占油菜生產總面積的60%以上。細胞質雄性不育是生產油菜雜交種的主要授粉控制系統。我國生產上使用的雜油菜有70%左右為細胞質雄性不育雜種，基本上是華中農業大學1972年從引進品種“波里馬”中發現的波里馬細胞質雄性不育(Pol CMS)配制的。Pol CMS的育性易受溫度影響，低溫下產生微量花粉，不育株可以自我繁殖，導致配制雜交種時一定比例的不育株存在，使雜種純度下降，其中的不育株結實率低，影響雜交種產量潛力的發揮，增加雜交油菜利用的風險性。我國目前研究和應用的其他雄性不育細胞質有陜2A CMS、MI CMS、Nca CMS等，這些不育細胞質均是在蕓薹屬栽培種中經自然變異或種間雜交鑒定出來的，屬于同源雄性不育胞質，均有育性不夠穩定的缺點，應用時存在雜種純度難以保證的問題，且其完全保持系和完全恢復系都不容易篩選， 大多數油菜品種都是不恢不保的類型(李殿榮.甘藍型油菜三系選育初報.陜西農業科學，1980，(1) :26-29;傅壽仲，戚存扣，唐繼紅.甘藍型油菜細胞質雄性不育系MI CMS的選育·作物學報，1989，17 (2) 151-156.劉貴華，蔡明，盛曉燕.甘藍型油菜NCa雄性不育材料的選育及其在甘藍型油菜中的恢保關系.中國農業科學，1997，30 (3) :61-65)。國外通過轉移蘿卜不育細胞質得到的育性較為穩定的蘿卜質雄性不育材料(Barmerot H,Boulidard L，Cauderon Y andTempe J. Transfer of cytoplasmic male sterility from Raphanus sativus to Brassicaoleracea. Proc. Eucarpia Meeting Cruciferae :1974,52-54)， {i. 在利用過程中出現恢復系難找、恢復基因與不良品質性狀連鎖的問題，使得該不育系的 禾中禾Ufflii禾呈■個曼(Delourme R. ， Foisset N. ， Horvais R. ， Barret P. ， Champagne G.， Cheung W. Y. , Landry B. S. , Renard Μ.Characterisation of the radish introgression carrying the Rforestorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassicanapus L.). 1998, Theor Appl Genet 97:129-134)。從 1974 年不育系創建成功，到1999年打破恢復基因與不良品質性狀的連鎖，直至2000年以后才不斷育成雙低雜交油菜品種，實際應用進程花了將近30年的時間(Primard-Brisset C, Poupard JP, Horvais R, Eber F, Pelletier G, Renard M, Delourme R, A new recombined double lowrestorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed(Brassica napus L.). Theor ApplGenet. 2005 ；111 (4) :736_46)。生產上大面積應用單一細胞質生產雜交油菜存在流行性病害發生的危險，利用新的細胞質雄性不育系統對保障雜交油菜的可持續性發展具有重要意義。中國通過甘藍型油菜與新疆野芥的體細胞雜交，創建了油菜異源細胞質雄性不育系統-野芥細胞質雄性不育系統(Nsa CMS)，與同源細胞質雄性不育系統相比，其
4不育性更為穩定(胡瓊，李云昌，梅德圣，方小平，Lise N. Hansen, SvenB. Andersen屬間體細胞雜交創建甘藍型油菜細胞質雄性不育及其鑒定。中國農業科學，2004，37 (3) 333-338)。通過廣泛與同一體細胞雜交組合的雜交后代株系測交，獲得了該不育系統的恢復系，實現了三系配套(胡瓊、李云昌、梅德圣、李英德、徐育松，利用野芥不育細胞質制備油菜及十字花科蔬菜雜種的方法，ZL200710052080. 5，2010年授權)。進一步研究表明， 該不育系統的恢復系是一個二體附加系，除了含有甘藍型油菜的38條染色體之外，還含有野芥的2條染色體，且恢復基因位于附加染色體上(Wenhui Wei，Yunchang Li, Lijun Wang, Shengyi Liu, Xiaohong Yan, Desheng Mei, Yinde Li, Yusong Xu, Pengfei Peng, Qiong Hu. Development of a novel Sinapis arvensis disomic addition line in Brassicanapus containing the restorer gene for Nsa CMS and improved resistance toSclerotinia sclerotiorum and pod shattering. TAG,2009, Theor Appl Genet TAG, 2010，120(6) :1089-97)。這使得本來就是非常麻煩的恢復系的選育更加麻煩，因為選育雄性不育系的恢復系時，一個篩選出的單株或者株系是否具有恢復性能，往往需要與不育系進行測交，直到測交下一代的開花期才能進行鑒定。而當恢復系是附加系，恢復基因又位于附加染色體上時，通過雜交很容易使附加染色體丟失，因此恢復基因也易丟失，選擇和培育出新的恢復系難度加大。利用恢復基因的分子標記進行輔助篩選，將顯著提高恢復系的選育效率。目前國內外尚沒有開發鑒定出Nsa CMS恢復基因分子標記的報道。在此背景下， 我們根據恢復基因編碼的蛋白大多具有三角狀五肽重復區(Pentatricop印tide repeat, PPR)的序列特征，開發出一種Nsa CMS恢復基因的分子標記，可用于恢復系的分子標記輔助選育。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記的制備方法，方法易行，操作性強，其特點是特異性強，擴增重復性好，可以確定植株或品系中是否有恢復基因的存在，從而在早期鑒定油菜植株或品系對Nsa CMS的恢復性能。本發明的另一個目的是在于提供了一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記在油菜雜交種親本選育中的應用。通過分子標記輔助選擇，鑒定和篩選恢復材料速度快，極大減輕了恢復性能鑒定必需經過測交及后代種植觀察的工作量，有效提高了選擇的效率和準確性。從而大大提高了油菜異源細胞質雄性不育系恢復系選育的速度與鑒定效率，加快了雜交種選育的進程。根據本發明提供的方法并使用本發明提供的實驗步驟可實現上述目的。一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記的制備方法，其步驟是A、從美國國家生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)數據庫中(//www. ncbi. nlm. nih. rov/)選取擬南芥PPR基因AT1G126209、AT1G63070、蘿卜細胞質雄性不育(Ogu CMS)的恢復基因RfO， 提取各自蛋白序列，送至歐洲生物信息學研究所網站(//www. ebi. ac. uk/Tools/msa/ clustalw2/)分析工具軟件(ebi clustalff)進行多序列比對，采取保守氨基酸位點兼顧簡并度最小原則設計兼并引物。引物序列為；其正向引物為TTY GTN AAG GAR GGN AAG CT, 反向引物為 DAT RAGNGT RTT RTA NGT AAC。
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B、用 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB total DNA isolation. In :Hewitt G M, Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy. Berlin Springer-Verlag，1991. P283-293)抽取油菜異源細胞質雄性不育恢復系的葉片DNA，采用降落PCR程序進行擴增，PCR擴增體系為TaqMIX 10 μ 1 (購自GeneStar, DNA模板1 μ 1， 正反向引物各 2. 5μ l(10ym/l)，ddH20 4μ1。降落(touchdown) PCR 程序為95 °C 2min, (94 °C 30s, 55 °C -40 °C 45s, 72 °C 2min)，14 個循環，然后(95 °C 30s, 40 °C 45s, 72 °C 2min)，25個循環。PCR擴增產物用2% (g/v，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后檢測。 C、PCR產物回收、轉化及測序使用 Ε. Z. N. A GEL extraction kit 試劑盒(Omega, D2501-01)回收目標片斷，用PGEM-T vecter試劑盒(購自Promega，A3600)連接后于16°C 過夜，轉化大腸桿菌DH5(購自寶生物工程有限公司)感受態細胞，通過籃白斑篩選獲得陽性克隆。挑選3-5個陽性克隆繁殖后，菌液送至上海INVITR0GEN公司測序。D、特異片段DNA序列分析將從恢復系DNA中擴增得到的差異片段測序，獲得長度為309bp的序列。將特異片段的DNA序列送至美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數據庫中(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)進行基因序列檢索，結果獲得了三個高度同源的基因序列，其中同源性最高的是一個具有油菜波里馬CMS(pol CMS)育性恢復性狀的一個白菜型油菜的克隆，在該區段上的一致性達85%，是一個1953bp的表達基因序列，編碼含有十六個PI3R基序的蛋白。與美國國家生物技術信息中心數據庫(//www, ncbi. nlm. nih. rov/)中的擬南芥一號染色體臂上的PI3R基因AT1G12300 —致性達79%，與多個擬南芥的PI3R基因同源性都超過了 70%以上。 與蘿卜CMS的恢復基因族上恢復基因位點RfO (PPR B)的同源性達69%。E、特異片段可能編碼的氨基酸序列及蛋白基序分析使用歐洲生物信息學研究所網站(//www. ebi.ac.uk/Tools/emboss/)翻譯序列分析工具軟件(EBItranseq)將此長度為309bp的片段翻譯成蛋白質序列，結果表明該片段編碼103個氨基酸殘基。將這 103個氨基酸序列提交至Smart進行結構域預測，發現其含有兩個PI3R蛋白基序，各基序為35個氨基酸，屬于PI3R基因家族的P亞族。其中第一個Pra基序位于27-61個氨基酸區域，緊接著第二個位于62-96個氨基酸區域，兩個Pra基序的預測值分別為4. OOe-IO和 6. 60e-12。將這103個氨基酸序列提交NCBI進行BLAST同源性搜索，獲得的同源序列除了擬南芥的PI3R基因之外，全部是與植物CMS恢復基因相關的序列，包括蘿卜及甘藍型油菜蘿
卜細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)、甘藍型油菜波里馬細胞質雄性不育(pol CMS)、水稻CMS和矮牽牛CMS的恢復基因，說明包含這一序列的基因很可能與異源細胞質雄性不育的恢復基因相關。F、含特異片段的全長cDNA的獲得根據差異DNA片段設計引物，使用SMARTRACE CDNA AMP I CAT I ON KIT (購自 CL0NTECH)，分別進行 5，RACE 與 3，RACE (圖 1)。設計的 RACE 引物序列如下3，RACE 基因特異性引物5，GGCTAAGCAGATGATGGACCTGATGGCTAGCAAGGG3，， 5，RACE 基因特異性引物5，ATGTCCACGAGAGGGGTGGTTGCCAATACA3，。將擴增得到的 RACE 片段分別回收測序，測序結果經 SEQMAN 軟件(http //www, dnastar. com/t-sub-products-la sergene-seqmanpro. aspx)拼接，獲得全長 cDNA ·歹Ij ；G、根據拼接好的全長cDNA序列在其5，端非翻譯區域(untranslatedregion，
6UTR)與3’ UTR區設計引物，使用該基因特異引物分別對與新分離群體的可育株與不育株進行PCR擴增，并對異源細胞質雄性不育的恢復系、保持系、不育系、以及同源細胞質雄性不育的恢復系的基因組DNA進行擴增。PCR擴增體系及程序為TaqMIX IOyL(購自 GeneStar, Al 12-20)，DNA 模板 1 μ L，正反向引物各 1.5 μ L(IOyM), ddH20 6μ L0 PCR 擴增程序為 95°C 5m, 94°C 30s，64°C 45s，72°C 3min)，共 34 個循環，然后 75°C IOmin, PCR 擴增產物用1.5% (g/v)瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后檢測。結果在異源細胞質雄性不育的恢復系中有2. Ikb的擴增產物，而在其它材料中均無擴增產物；因此上述根據全長 cDNA序列5’ UTR與3’ UTR區設計的特異引物在具有異源細胞質雄性不育恢復性狀的材料中擴增出來的2. Ikb的特異DNA片段可作為油菜野芥細胞質雄性不育恢復基因的分子標記。從而獲得了一種油菜野芥細胞質雄性不育恢復基因的分子標記，其正向引物的序列為 TACGCGGGGAGAGAAGCTTGTCTCG,反向引物的序列為CACATCATAACACACTAACCAGGACTTTGTCTC， 擴增產物長度為2. Ikb。2、一種異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記在油菜雜交種親本選育中的應用，其步驟是A、提取油菜育種群體中不同高世代品系的葉片總DNA作為模板；B、采用上述油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的特異引物對待檢測的不同品系的DNA進行PCR擴增；C、擴增產物在(g/v)的瓊脂糖膠上進行電泳分離，查看分子量約為2. Ikb的特異片段條帶出現情況；D、當該約2. Ikb的特異性片段條帶出現時，表明油菜品系基因組中含有野芥細胞質雄性不育恢復基因；當該約2. Ikb的特異性條帶缺失時，表明油菜品系基因組中不含有野芥細胞質雄性不育恢復基因，可用于野芥細胞質雄性不育恢復系的早期輔助選擇。本發明通過恢復基因的同源性設計引物，獲得異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記，并利用分子標記輔助選擇恢復系，其特點是特異性強，擴增重復性好，方法易行，操作性強，可以確定植株或品系中是否有恢復基因的存在，從而可以在早期鑒定油菜植株或品系對細胞質雄性不育的恢復性能。通過分子標記輔助選擇，極大減輕了恢復性能鑒定必需經過測交及后代種植觀察的工作量，有效解決了常規育種方法中存在的恢復基因測交鑒定工作量大、周期長等缺點，可以大大提高Nsa CMS恢復系選育的速度與鑒定效率，有效提高了選擇的效率和準確性，有助于加快Nsa恢復系的遺傳改良步伐。


圖1為一種簡并引物特異性片斷的擴增效果示意圖。 1育性分離群體中的可育株，2育性分離群體中的不育株，3野芥，4甘藍型油菜親本中雙4號，5不育系。箭頭所指為擴增目的片斷。圖2為一種特異DNA擴增片斷序列經SMART預測的PI3R基序圖3為一種3’ race與5’ race的擴增情況。圖4為一種Nsa CMS恢復基因特異分子標記在育性分離群體可育株中特異擴增示意圖。F為育性分離群體中的可育株cDNA，S為育性分離群體中的不育株cDNA。
圖5為一種Nsa CMS恢復基因特異分子標記在Nsa恢復系及野芥中的特異擴增示意圖。F為Nsa恢復系，S為Nsa不育系，M為Nsa保持系，Y為野芥。圖6為一種Nsa CMS恢復基因分子標記在Nsa恢復系中的特異擴增示意圖。泳道 1-3為三個不同的Nsa恢復系，泳道4-8為其他類型CMS恢復系。圖7為一種Nsa CMS恢復基因分子標記在F2育性分離群體中的檢測效果示意圖。圖左邊1-8泳道為不育單株的DNA，右邊第9_18泳道為可育單株的DNA。圖8為一種Nsa CMS恢復基因分子標記在高世代株系中的檢測效果示意圖。圖9為一種Nsa CMS恢復基因分子標記在高世代純合株系不同單株中的檢測效果示意圖。圖10為一種Nsa CMS恢復基因分子標記在高世代雜合株系不同單株中的檢測效果示意圖。圖11為利用一種Nsa CMS恢復基因分子標記輔助選擇選育出的新恢復系田間長勢示意圖。
具體實施例方式實施實例1 一種油菜雄性不育恢復基因分子標記的制備方法，具體步驟為1、油菜野芥細胞質雄性不育恢復基因相關片段的獲得A、實驗材料及群體構建野芥細胞質雄性不育(Nsa CMS)的不育系(均為與甘藍型油菜的自交或回交后代，細胞核中不含野芥染色體)、中雙4號(為Nsa CMS的保持系，也是體細胞雜交所用的原始甘藍型油菜親本)、野油18 (為體細胞雜交所用的原始野芥親本) 及Nsa CMS的不育系與1號恢復系(恢1)雜交獲得的可育Fl代單株，再與保持系雜交后， 從復交Fl中選可育株與保持系連續回交4代后獲得的育性分離群體中的可育株與不育株。B、簡并引物設計基于多數植物細胞質雄性不育的育性恢復基因編碼PPR蛋白及其進化特點，選用美國國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI)數據庫中(http //www, ncbi. nlm. nih. rov/)的擬南芥的 PI3R 基因 AT1G126209、AT1G63070，蘿卜細胞質雄性不育(Ogu CMS)的恢復基因(RfO)，從I數據庫中獲取各自蛋白序列，送至歐洲生物信息學研究所網站(//www, ebi. ac. uk/Tools/msa/ clustalw2/)分析工具軟件(ebi clustalff)進行多序列比對，比對后發現，該三個基因在約200bp長的區段上的同源性較高，選取保守氨基酸位點兼顧簡并度最小原則設計兼并引物，共獲得3條正向引物和3條反向引物，簡并度變幅為64-768 (表1)。引物序列交由上海生工合成。表1簡并引物序列及簡并度
權利要求
1. 一種油菜雄性不育恢復基因分子標記的制備方法，其步驟是A、選取擬南芥1號染色體臂PI3R基因AT1G126209，AT1G63070,蘿卜細胞質雄性不育的恢復基因RfO，從美國國家生物技術信息中心數據庫中提取各基因的蛋白質序列，進行多序列比對，在保守氨基酸位點處兼顧簡并度最小原則設計間并引物，正向引物序列為TTY GTN AAG GAR GGN AAG CT，反向引物序列為 DAT RAG NGT RTT RTA NGT AAC ；B、用CTAB法抽取油菜異源細胞質雄性不育恢復系的葉片DNA，采用降落PCR程序進行擴增，PCR擴增體系為=TaqMIX 10μ1, DNA模板 μ ,正反向引物各2. 5μ1, ddH20 4μ1，降落 PCR 程序為95°C 2 min，14 個循環，然后 95°C 30 s, 40°C 45 s, 72°C 2 min，25 個循環， PCR擴增產物用2% g/v瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后檢測；C、PCR產物回收、轉化及測序使用E.Z.N. A GEL extraction kit試劑盒回收目標片斷，用PGEM-T vecter試劑盒連接后于16°C過夜，轉化大腸桿菌DH5感受態細胞，通過籃白斑篩選獲得陽性克隆，挑選3-5個陽性克隆繁殖后，菌液送樣測序；D、特異片段DNA序列分析將從恢復系DNA中擴增得到的特異片段測序，獲得長度為 309 bp的序列，將特異片段的DNA序列送至NCBI基因序列庫進行BLAST檢索，獲得了三個高度同源的基因序列，其中一個是從具有油菜波里馬CMS育性恢復性狀的一個白菜型油菜材料中得到的克隆，在該區段上的一致性達85%，是一個1953bp的表達基因序列，編碼含有 16個PI3R基序的蛋白，與擬南芥1號染色體臂上的PI3R基因AT1G12300的同源性在70%以上；E、特異片段可能編碼的氨基酸序列及蛋白基序分析使用EBItranseq將此長度為 309 bp的片段翻譯成蛋白質序列，結果表明該片段編碼103個氨基酸殘基，將這103個氨基酸序列提交至Smart進行結構域預測，發現其含有兩個PI3R蛋白基序，各基序為35個氨基酸，屬于PI3R基因家族的P亞族，其中第一個PI3R基序位于27-61個氨基酸區域，接著第二個位于62-96個氨基酸區域，兩個PPR基序的預測值分別為4. OOe-IO和6. 60e_12，將這 103個氨基酸序列提交NCBI進行BLAST同源性搜索，獲得的同源序列除了擬南芥的PI3R基因之外，全部是與植物CMS恢復基因相關的序列，包括蘿卜及甘藍型油菜蘿卜質CMS、甘藍型油菜波里馬CMS、水稻CMS和矮牽牛CMS的恢復基因；F、含特異片段的全長cDNA的獲得根據所得的DNA片段設計引物，使用SMARTRACE CDNA AMP I CAT I ON KIT,分別進行5，RACE與3，RACE，設計的RACE引物序列如下3' RACE GSP 5' GGCTAAGCAGATGATGGACCTGATGGCTAGCAAGGG3'，5’ RACE GSP 5’ ATGTCCACGAGAGGGGTGGTTGCCAATACA3’ ；將擴增得到的RACE片段分別回收測序，測序結果經SEQMAN軟件拼接，獲得全長cDNA 序列；G、根據拼接好的全長cDNA序列在其5’UTR與3’ UTR區設計引物，使用該基因特異引物分別對育性分離群體中可育株與不育株進行RT_PCR擴增，并對異源細胞質雄性不育系統的恢復系、保持系、不育系以及同源細胞質雄性不育系統的恢復系基因組DNA進行擴增， PCR擴增體系及程序為=TaqMIX ΙΟμ ，DNA模板 μ ，正反向引物各1. 5μ , ddH20 6PL，PCR 擴增程序為 95°C 5min, 94°C 30 s, 64°C 45s, 72°C 3 min,共 34個循環，然后 75°C IOmin, PCR擴增產物用1. 5%g/v瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后檢測，在異源細胞質雄性不育恢復系中有分子量約2. Ikb的擴增產物，在不育系、保持系及同源細胞質雄性不育恢復系中都無擴增產物，因此，根據全長cDNA序列5’ UTR與3’ UTR區設計的特異引物，其正向引物的序列為TACGCGGGGAGAGAAGCTTGTCTCG，反向引物的序列為CACATCATAACACACTAACCAGGAC TTTGTCTC，擴增出的長度約為2. Ikb的DNA片段作為油菜野芥細胞質雄性不育恢復基因的分子標記，獲得了一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記。
2.權利要求1所述的一種油菜異源細胞質雄性不育恢復基因的分子標記在油菜雜交種親本選育中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種油菜雄性不育恢復基因分子標記的制備方法及應用，步驟是A、根據PPR基因保守氨基酸位點設計兼并引物；B、用CTAB法抽取油菜細胞質雄性不育恢復系的葉片DNA，采用降落PCR擴增出特異的恢復基因候選片斷；C、PCR產物回收、轉化、測序及序列分析；D、進行5’RACE與3’RACE，將測序結果拼接，獲得全長cDNA序列；E、根據拼接好的全長cDNA序列在其5’UTR與3’UTR區設計特異引物，獲得分子標記。同時公開了一種恢復基因的分子標記在油菜雜交種親本選育中的應用方法，提高了恢復系選育的速度與鑒定效率，方法易行，操作性強，鑒定恢復材料速度快，極大減輕了恢復性鑒定必需經過測交及后代種植觀察的工作量，提高了雜交種選育的效率。
文檔編號C12N15/10GK102220316SQ201110099608
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年4月20日
發明者付麗, 徐育松, 李云昌, 李英德, 梅德圣, 胡瓊, 郝建軼 申請人:中國農業科學院油料作物研究所