專利名稱：與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記及其用法的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物分子育種技術領域，具體涉及一種與小麥抗白粉病基因PmLK906 和Pm4連鎖的PCR標記及其用法。
背景技術：
小麥是世界上第二大糧食作物，是我國最重要的農作物，僅河南省每年播種面積 就達7000萬畝以上。病害是造成小麥減產的主要原因之一，小麥銹病、紋枯病、赤霉病、黑 穗病、黃矮病等在黃淮麥區均有發生，而白粉病則是發病最早、持續時間最長、危害最嚴重 的病害，其發病范圍廣、危害嚴重，呈上升趨勢。1990年白粉病發病面積達1800萬ha2，約 占我國小麥面積的1/2，為1981年的3. 6倍。白粉病一般可造成13% 34%的產量損失， 嚴重年份減產高達30% 50%，并嚴重影響小麥的品質。從2009年4月初開始，白粉病在 河南省大面積流行，嚴重程度為近年罕見。而大面積推廣品種均感白粉病，無法控制白粉病 流行。雖然藥物對小麥白粉病有一定的防治作用，但藥物治療主要存在以下不足首先 是藥物防治不能杜絕病害流行；第二是白粉病發病周期短，僅5 7天，在小麥白粉病流行 期間要控制發病程度需要噴灑藥物3 4次；第三是藥物防治增加成本，按3次施藥，每畝 要增加人力、藥物投入約50元；第四是藥物防治影響小麥品質；第五是藥物殘留不利于環 境保護和小麥的綠色生產。2009年在豫北麥區調查結果表明，藥物防治白粉病效果下降。目前，國際上已經正式命名了 39個小麥抗白粉病基因，但大多已喪失抗性，因 此，尋找有效抗病基因，培育抗病小麥新品種是小麥育種家的重要任務之一。小麥“蘭 考90(6)，，是沈天民研究員選育的抗白粉病品系(王祖華，牛吉山，郭天財，張麗娜，沈天 民.2004.小麥主栽品種中的IRS分布和蘭考90(6)系列白粉病新抗源.西北植物學 報，24:1216-1220)。我們的研究表明，“蘭考90 (6) ”攜帶1對隱性抗白粉病基因，命名 為PmLK906，是目前我國少數有效的抗白粉病基因之一(牛吉山，王映紅，周益林，段霞 瑜，沈天民.2006.普通小麥“蘭考90(6)”品系白粉病抗性遺傳.植物病理學報，36 (6) 528-533)。Pm4是1個顯性復等位抗白粉病基因位點，包括Pm4a和Pm4b，在我國的一些地 區仍具有抗性。抗白粉病基因PmLK906和Pm4均位于小麥的2AL染色體臂上，緊密連鎖。

發明內容
本發明的目的在于提供一種與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記
及其用法。為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下一種與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記，命名為 XTaAetra5-467，是由SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列和SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列組 成的一對引物擴增。
與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記的用法以待測小麥基因組 DNA作為模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作為引物1，以SEQID No. 2所示的核苷酸 序列作為引物2進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有467bp片段特異帶，能擴增出467bp 片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴增出467bp片段特異帶的單株不攜帶抗 病基因PmLK906。所述PCR擴增反應體系PCR試劑組成為H2O13. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ LdNTP(25mmol/L)1. 6μ L引物 l(10ymol/L)0. 8 μ L引物 2(10ymol/L)0. 8 μ LTaq 酶(20u/yL)0. 16 μ L模板DNA (50ng/ μ L) l.OyL總體積20.0yL，PCR擴增程序為先在94°C預變性4分鐘；接35個循環的94°C變性30秒，52°C復 性45秒，72°C延伸1分鐘；最后在72°C延伸10分鐘。擴增結束后將樣品取出置于4°C保存 待檢測。所述檢測擴增產物方法為擴增產物在的瓊脂糖凝膠電泳上進行分離，然后用 EB進行顯色。本專利通過抗病品系“蘭考90 (6) ”與感病品種“中國春”雜交建立了 F3代分離群 體，用分池法建立抗、感cDNA池，通過小麥基因芯片雜交、cDNA-PCR擴增獲得了 1個與抗病 基因PmLK906和Pm4連鎖的基因全長cDNA克隆，在此基礎上發展出能在不同小麥遺傳背景 下跟蹤檢測PmLK906和Pm4的STS分子標記輔助選擇技術。本發明與現有技術相比較的優點及有益效果如下本發明提供了小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記XTaAetra5_467， 該標記與PmLK906基因和Pm4基因緊密連鎖，PmLK906基因是目前我國少數有效的抗白粉 病基因之一，Pm4是1個顯性復等位抗白粉病基因位點，可以對抗病基因PmLK906和Pm4進 行分子標記輔助選擇，從而實現與其它有效抗病基因的累加，延長品種的抗病性。利用這種 方法，不僅克服了常規育種方法所需時間周期長等缺點，有目標地將抗病基因快速轉入感 病品種，而且可有目的地聚合多個有效抗白粉病基因，培育出具有穩定、持久抗性的小麥新 品種。


圖 1 是用引物 AtPR5-F 和 AtPR5-R 在“中國春” (CS)和“蘭考 90 (6) 21-12” (906) cDNA中的擴增結果。結果表明TaAetPR5基因僅存在于抗病小麥“蘭考90 (6) 21-12”中。圖2是引物對P9-7pl、P9_7p2在抗、感親本，抗、感DNA池及F3分離群體中的擴增 結果。其中，1 中國春；2 蘭考90 (6) 21-12 ；3 感病DNA池；4 抗病DNA池；S 感病植株； R 抗病植株。R/S 雜合植株。圖3標記XTaAetPR5_467 (TaAetPR5)與抗病基因的連鎖圖；其中a :TaAetPR5和
4PmLK906在2AL染色體上的連鎖圖；b :TaAetPR5和Pm4a在2AL染色體上的連鎖圖。圖4標記XTaAetra5-467檢測回交轉育抗病品系后代；其中，1 白硬冬2號；2 “蘭考90(6)21-12” ；3-10、12、13 抗病植株；11 感病植株。
具體實施例方式1.標記篩選過程(1)植物材料感病親本“中國春”，抗病親本“蘭考90(6)21-12”。配置雜交組合 “中國春” / “蘭考90 (6) 21-12”，獲得F1代、F2代分離群體和139個F2:3家系分離群體。同 時還配置了“蘭考90 (6)” X “豫麥21”、“蘭考90 (6)” X “濮麥9號”、“蘭考90 (6) ” X “白 硬冬2號”等抗、感小麥雜交組合，獲得了不同組合的F1代、F2代、F2:3家系，用于標記驗證。(2)白粉病抗性鑒定采用離體葉段培養法接種小麥白粉病菌鑒定親本及雜交后 代材料的抗病性。選用合適的培養皿，放置一層中性濾紙，用40mg/L的6-芐氨基腺嘌呤 (6-Benzylaminopurine 6-BA)充分濕潤濾紙。待幼苗第一片葉完全展開后，截取3 4cm 葉段，按編號放在濾紙上。接種小麥白粉病菌，用本實驗室通過連續單孢子堆分離純化的 2個白粉病菌株，采用輕拂法人工接種，24小時后再重復接種1次。在光照培養箱內培養， 18°C，每天光照12小時，在感病對照充分發病的情況下(7 10天)按照0 4級反應型 記錄白粉病發病情況，48小時后再重復觀察一次。(3)抗、感病cDNA池構建和基因芯片雜交通過抗性鑒定選擇10個F3純合抗病家 系和10個純合感病家系建立抗、感池。用TRIzol 試劑(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA) 提取總RNA。本試驗所用基因芯片為Affymetrix 公司(SantaClara，CA，USA)推出的小麥 基因芯片。該芯片包含普通小麥、一粒小麥(Triticummonococcum)、二粒小麥(Triticum turgidum)和粗山羊草(Aegilops tauschii)的探針共61127個，代表55052個轉錄子。基 因芯片雜交和數據處理在上海國家基因芯片工程中心完成。(4)基因克隆根據基因芯片雜交結果提示的序列信息設計了一對引物，引物 AtPR5-F的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，引物Atra5-R的核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所示。該引物用來在蘭考90(6)21-12中克隆基因。RNA提取、cDNA合成、擴增等按以前報 告的方法進行(牛吉山，王映紅，周益林，段霞瑜，沈天民.2006.普通小麥“蘭考90(6)”品 系白粉病抗性遺傳.植物病理學報，36(6) :528-533)。擴增程序為95°C 3min ;5個循環的 940C 30s, 500C lmin，72°C 3min ；27 個循環的 94°C 30s, 47°C lmin，72°C 3min ；最后在 72°C 延伸7min。擴增產物回收后插入PMD19-T，測序(TaKaRa公司，大連)。獲得了 1個新基因 并命名為TaAetra5。基因克隆同時在感病品種“中國春”中進行，結果表明該基因僅存在于 抗病小麥“蘭考90 (6) 21-12”中，而不存在于感病小麥“中國春”(圖1)。(5) STS標記引物設計及與PmLK906基因的連鎖分析根據克隆的TaAetPR5基 因cDNA序列設計了一對引物P9-7pl 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，P9_7p2核苷酸 序列如SEQ ID No. 2所示。用該引物在139個株系組成的F3分離群體中進行擴增(圖2， 表 1)。擴增程序為 95°C 3min ；35 個循環的 94°C 30s, 50°C lmin，72°C Imin ；最后在 72°C 延伸7min。擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳檢測。特異性擴增片段長度是467bp。用 JoinMap Version 3. 0進行連鎖分析。獲得了與PmLK906抗白粉病基因連鎖的STS分子標 記，命名為 XTaAetPR5-467 (圖 3a)。
(6)分子標記XTaAetPR5-467與Pm4a的連鎖分析用引物對P9_7p 1、P9_7p2 在“Chancellor”/ “Cl 14124” 雜交構建的 Pm4a 分離群體(Ma Z Q, Wei J B, ChengS H.PCR-based markers for the powdery mildew resistance gene Pm4a in wheat. Theoretical and Applied Genetics，2004，109，140-145)中進行擴增和連鎖分析，證明標 記 XTaAetPR5-467 與 Pm4a 共分離(圖 3b)。(7)通過研究獲得1個顯性STS標記XTaAetfR5-467，與小麥抗白粉病基因 PmLK906和Pm4連鎖，可以在不同小麥遺傳背景下檢測這2個抗白粉病基因位點。表IF3分離群體的白粉病反應型和P9-7pl、P9_7p2引物擴增結果
權利要求
一種與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記，命名為XTaAetPR5 467，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的一對引物擴增。
2.權利要求1所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記的用法，其 特征在于以待測小麥基因組DNA作為模板，以SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列作為引物1， 以SEQ ID No.2所示的核苷酸序列作為引物2進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有467bp 片段特異帶，能擴增出467bp片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴增出467bp 片段特異帶的單株不攜帶抗病基因PmLK906。
3.根據權利要求2所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記的用 法，其特征在于所述PCR擴增反應體系PCR試劑組成為H2013. 64 μ L10 X buffer (含 Mg2+) 2. 0 μ L dNTP(25mmol/L) 1. 6μ L 引物 l(10ymol/L) 0. 8 μ L 引物 2(10ymol/L) 0. 8 μ L Taq 酶(20u/ μ L) 0. 16 μ L 模板 DNA (50ng/ μ L) l.OyL 總體積20. OyL，PCR擴增程序為先在94°C預變性4分鐘；接35個循環的94°C變性30秒，52°C復性45 秒，72°C延伸1分鐘；最后在72°C延伸10分鐘。擴增結束后將樣品取出置于4°C保存待檢 測。
4.根據權利要求2或3所述的與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記的 用法，其特征在于所述檢測擴增產物方法為擴增產物在的瓊脂糖凝膠電泳上進行分 離，然后用EB進行顯色。全文摘要
一種與小麥抗白粉病基因PmLK906和Pm4連鎖的STS標記及其用法，屬于植物分子育種技術領域。該標記命名為XTaAetPR5-467，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列組成的一對引物。其用法為以待測小麥基因組DNA作為模板，以標記XTaAetPR5-467的引物進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有467bp片段特異帶，能擴增出467bp片段特異帶的單株攜帶抗病基因PmLK906，不能擴增出467bp片段特異帶的單株不攜帶抗病基因PmLK906。所述的分子標記可以在不同小麥遺傳背景中準確檢測PmLK906和Pm4基因的存在。該技術可以加快PmLK906和Pm4基因向小麥生產品種中的轉育速度。
文檔編號C12N15/11GK101955985SQ20091006542
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優先權日2009年7月14日
發明者倪永靜, 尹鈞, 牛吉山, 王保勤, 賈海燕, 馬正強 申請人:河南農業大學