專利名稱：一種基于基因芯片進行抗腫瘤藥物篩選的方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤藥物的篩選方法。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康、導致死亡最為嚴重的疾病之一。在我國，每年約有90萬腫瘤病人死亡，并且近年來死亡人數呈逐年遞增的趨勢。因此，世界各國都投入巨資研究開發抗腫瘤藥物。
盡管到目前為止已有數十種化療或輔助抗腫瘤藥物可以用于臨床治療，但大多數藥物只能使病情緩解，無法達到治愈的目的。尤其是大多數死亡率很高而又很常見的癌癥，如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌藥物。因此，迫切需要新的、具有明顯療效的抗癌藥物的研究和開發。
篩選模型和篩選技術是創新藥發展階段的主要環節。全世界每年新增可供篩選的合成化合物和從動植物中提取的天然化合物數以萬計，從中篩選藥物的主要障礙在于篩選通量、效率和成本。只有通過先進的篩選模型與技術才能快速有效地發現具有特異性生物活性的后選藥物。其中主要包括分子、亞細胞結構、細胞、離體器官及整體動物等一系列篩選模型及篩選技術。目前臨床使用的大部分抗腫瘤藥物是通過體外細胞篩選系統、動物體內腫瘤模型或者近年發展起來的人腫瘤移植瘤篩選得到的。
隨著人類基因測序工作的大規模展開，使人類掌握了大量基因組信息，獲得人類疾病的相關基因。關鍵疾病基因的確定，為藥物作用提供了大量的新靶點。隨著分子腫瘤學、分子藥理學的發展，越來越多的證據表明，抗腫瘤藥物發揮作用的機理均通過影響腫瘤細胞基因表達而進一步引起細胞和瘤體表型的改變。藥物作用后細胞內基因表達變化特征與細胞和瘤體表型改變呈現內在規律，根據這種規律，可以在未觀察到細胞表型變化之前就推測藥物的作用機理。
藥物引發的基因表達變化非常復雜，呈現基因相互作用和調控后的級聯反應。因此，根據個別基因的變化來推測藥物最終引起的表型變化往往有失偏頗。而通過觀察基因群的變化，雖復雜但能反映藥物作用的內在規律。傳統的分子生物學技術均無法在同一時間內分析大量的基因表達變化，而基因表達譜芯片集成了成千上萬種基因，因此使在同一時間內分析大量的基因表達變化成為可能。

發明內容
本發明所解決的技術問題是提供了一種基于基因芯片的抗腫瘤藥物篩選方法，在國內外首次建立了基于基因芯片的抗腫瘤藥物篩選模型，使大規模、高通量篩選抗腫瘤藥物成為可能。
本發明的主要思路是1)將已知四大類細胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物的藥物反應基因和已知的腫瘤相關基因克隆，合并另外已有的待篩選基因作為待檢靶基因；2)選擇臨床使用的、作用機理較為明確的四大類細胞毒抗腫瘤藥物中具有代表性的藥物作為工具藥物；3)選擇若干種常用的篩選抗腫瘤藥物的細胞株作為細胞模型；4)用上述工具藥分別作用各種細胞后，篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，然后用基因表達譜芯片檢測藥物作用的早期反應基因；5)應用計算機分析軟件對藥物反應基因進行統計和分類，得到藥物標志基因和特異性腫瘤基因；6)依據藥物標志基因和特異性腫瘤基因的變化規律驗證2種化合物的抗瘤活性，進一步在細胞水平上加以確證。
本發明采用的篩選抗腫瘤藥物的細胞株是目前常用的腫瘤細胞株，它們可以是早幼細胞白血病HL-60、慢性髓細胞性白血病K-562、神經母細胞瘤SK-N-SH、肝癌QGY-7703、胃腺癌SGC7903、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌H08910和宮頸癌Hela等。
本發明采用四大類細胞毒抗腫瘤藥物中已知具有代表性的、臨床有效的藥物，它們可以是甲氨喋呤、喜樹堿、鬼臼素、放線菌素D、紫杉醇、秋水仙堿和高三尖酯堿等。
用四唑氮鹽(MTT)比色法檢測抗腫瘤藥物對上述腫瘤細胞株的藥物細胞毒作用。處于快速增殖期的細胞(貼壁細胞用胰酶消化后)計數后接種于96孔酶標板上(貼壁細胞預培養24小時)，加入藥物或無藥溶劑對照培養24小時后，加入MTT20ul的DMSO后避光，振蕩15分鐘后，在酶聯免疫檢測儀上測定570nm波長的OD值，五個復孔取平均值，按下式計算不同藥物作用下的腫瘤細胞的抑制率，采用曲線專家1.3將藥物濃度以抑制率畫圖并求出半抑制濃度值IC50。獲得敏感腫瘤細胞系藥物的IC50值(見圖1)。
抑制率(％)＝(對照組OD值-用藥組OD值)/對照組OD值×100用上述細胞藥物毒性實驗獲得的藥物IC50濃度處理相應腫瘤細胞系，然后用芯片雜交技術檢測藥物作用下基因表達水平變化。
腫瘤細胞用藥物相應的IC50濃度或藥物溶劑對照處理0.5小時或1小時后，抽提細胞總RNA，再用OligotexmRNAMidi Kit純化mRNA。藥物及溶劑對照組mRNA分別用cDNA一鏈合成摻入熒光標記dUTP(Cy 3-dUTP/Cy5-dUTP)的方法制備cDNA探針，混合后在密封倉內與表達譜芯片42℃雜交16小時。雜交結束后按BioDoor洗片技術進行洗滌和晾干。再用ScanArray3000掃描芯片，用ImaGene軟件分析Cy3，Cy5兩種熒光信號的強度和比值。每個芯片雜交重復三次。
三次芯片雜交所得的Cy3/Cy5比值取均值后，均值大于等于2或小于等0.5標準作為判定藥物作用下腫瘤細胞系基因表達差異標準，把所有差異表達的基因定為藥物反應基因。用自編軟件聚類分析藥物反應基因，篩選確定藥物篩選共用標志基因(Common Marker Genes，CMG)以及特異性腫瘤基因(Specific Tumor Genes，STG)。
藥物篩選共同標志基因分成3級I級CMG為對7個藥物的共同反應基因；II級CMG為對6個藥物的共同反應基因；III級CMG為對5個藥物的共同反應基因。
特異性腫瘤基因(STG)為各個腫瘤細胞系所特有的藥物反應基因。
在計算機輔助下運用聚類分析方法對實驗所得藥物反應基因進行分析，得到一定數量的抗腫瘤藥物標志基因和特異性腫瘤基因。將這些抗腫瘤藥物標志基因和特異性腫瘤基因進行基因芯片制作，制備成抗腫瘤藥物篩選芯片。
用鬼臼素分別處理藥物敏感細胞系，各個細胞株可以分別抽提mRNA，然后等量RNA混合后進行芯片雜交。也可用鬼臼素分別處理了藥物敏感細胞系后合并所有細胞同時抽提mRNA，再進行芯片雜交。
另外，本發明的發明人還利用表達譜芯片檢測了非IC50濃度的細胞毒抗腫瘤藥物處理藥物敏感細胞株的藥物反應基因的表達水平。結果表明，非IC50濃度的藥物出來不會影響芯片對藥物的顯性篩選結果。因此在實際篩選中，可以選擇較高的藥物濃度進行細胞刺激。
為了進一步驗證抗腫瘤藥物基因芯片技術的可行性，本發明的發明人還采用雙盲法，利用腫瘤細胞株用抗腫瘤藥物篩選芯片篩選了兩個樣品，然后用細胞毒實驗驗證有效藥物的抗腫瘤作用瘤譜。
基因表達譜芯片集成了成千上萬種基因，使在同一時間內分析大量的基因表達變化成為可能，克服了傳統的分子生物學技術的缺陷。因此，本發明的利用基因芯片的抗腫瘤藥物篩選方法具有更高的篩選效率，并且可以在基因調控水平上部分闡明藥物的作用機理，為大規模、高通量篩選腫瘤藥物提供了技術手段，同時也為篩選其他類型的藥物提供了理論依據和技術思路。


附圖1 抗腫瘤藥物對8種腫瘤細胞系半數抑制濃度IC50附圖2 腫瘤細胞的抗腫瘤藥物反應基因的表達水平具體實施方式
實施例1 腫瘤藥物標志基因和特異性基因的篩選將已知四大類細胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物的藥物反應基因和已知的腫瘤相關基因克隆，合并另外已有的12000余種基因作為待檢靶基因。
使用7個代表性藥物作為工具藥物，它們分別是甲氨喋呤、喜樹堿、鬼臼素、放線菌素D、紫杉醇、秋水仙堿和高三尖酯堿。
選擇8種常用的篩選抗腫瘤藥物的細胞株作為細胞模型，它們分別是早幼細胞白血病HL-60、慢性髓細胞性白血病K-562、神經母細胞瘤SK-N-SH、肝癌QGY-7703、胃腺癌SGC7903、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌H08910和宮頸癌Hela。
用四唑氮鹽(MTT)比色法檢測了7種臨床有效的抗腫瘤藥物對8株腫瘤細胞系的藥物細胞毒作用，得到敏感腫瘤細胞系藥物半數抑制濃度(IC50)32個，結果見圖1。
用上述細胞藥物毒性實驗獲得的藥物IC50濃度處理相應腫瘤細胞系，然后用芯片雜交技術檢測藥物作用下基因表達水平變化，結果見圖2。
在計算機輔助下運用聚類分析方法對實驗所得藥物反應基因進行分析，得到569個抗腫瘤藥物標志基因和50個特異性腫瘤基因。將這些569個抗腫瘤藥物標志基因和50個特異性腫瘤基因進行基因芯片制作，制備成抗腫瘤藥物篩選芯片。
其中，I類抗腫瘤標志基因為34個；II類抗腫瘤標志基因為160個；III類抗腫瘤標志基因為375個。神經母細胞瘤特異性基因6條；人急性早幼粒白血病細胞特異性基因4條；慢性髓細胞性白血病特異性基因4條；肝細胞特異性基因4條；胃腺癌特異性基因9條；乳腺癌特異性基因4條；卵巢癌特異性基因9條和宮頸癌細胞特異性基因13條。
I級抗腫瘤標志基因為藥物敏感細胞株對7類藥物的共同反應基因。在得到的34個I類抗腫瘤標志基因中，33條基因在抗腫瘤藥物作用下表達下調，僅一條表達上調。
表達下調的為長插入元件反轉錄轉坐因子(LINE RETROTRANSPOSABLE 1；LRE1)，是哺乳動物基因組中高度保守序列，與基因組進化、染色體異常密切相關，并且參加凋亡早期的DNA片段化形成。在本實驗中其表達上調可能與化療造成的染色體不穩定和凋亡有關。
其余的33條基因在抗腫瘤藥物作用下均表達下調，根據文獻分析其功能涉及能量代謝、蛋白質合成、結構蛋白、信號轉導和腫瘤相關等五個方面。實施例2 兩種混合法的比較本發明的發明人摸索了鬼臼素分別處理7株藥物敏感腫瘤細胞系，各個細胞系分別抽提mRNA，然后等量RNA混合后芯片雜交的方法，以及鬼臼素分別處理7株敏感細胞系后合并所有細胞同時抽提mRNA，再進行芯片雜交的方法。
把這兩種方法與多種細胞系同步單獨處理方法相比較，其結果表明，用RNA混合或細胞混合后再提取RNA的方法仍能反映藥物作用后基因表達的特征變化規律。因此作為一種優選方式，將細胞混合后再提取RNA的方法更為快捷、簡便和經濟。實施例3 IC50的濃度處理的比較在建立抗腫瘤藥物基因芯片的技術路線中，本發明的發明人采用了IC50的藥物處理濃度。而如果應用抗腫瘤藥物篩選芯片直接篩選未知藥物，我們將面對藥效以及半數抑制濃度未知的狀況。因此，我們用表達譜芯片檢測了非IC50濃度(450μl)的鬼臼素處理7株藥物敏感細胞株的藥物反應基因的表達水平。結果表明，非IC50濃度的藥物處理不會影響芯片對藥物的顯性篩選結果。因此，在實際藥物篩選中可以選擇較高的藥物濃度進行細胞刺激，使本方法具有經濟方便快捷的特點。實施例4 雙盲法抗腫瘤藥物的篩選采用雙盲法利用8種腫瘤細胞株用抗腫瘤藥物篩選芯片篩選了兩個樣品，然后用細胞毒實驗驗證有效藥物的抗腫瘤作用瘤譜。
化合物1(128mol/l)和化合物2(128mol/l)分別刺激8種腫瘤細胞系后，進行基因芯片的雜交，結果表明，化合物2作用下，抗腫瘤藥物標志基因和瘤譜基因表達變化，說明化合物2具有抗瘤活性，對SK-N-SH、Hela、SGC7901、HL-60和H08910有效。細胞毒實驗驗證，化合物2呈濃度依賴抑制上述細胞系生長，對K562細胞生長也有抑制作用，對Bcap37GY7703細胞生長抑制作用則較弱。
化合物1作用下，藥物標志基因和瘤譜基因表達無變化，表明該化合物無抗瘤活性。細胞毒實驗表明，化合物1對8種細胞生長無抑制作用。
解盲結果揭示，化合物1為乙醇(藥物溶劑)，化合物2為鬼臼乙叉苷(鬼臼素類似物)。
權利要求
1.一種抗腫瘤藥物的篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟1)使用若干細胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物作為工具藥物，使用若干種常用的篩選抗腫瘤藥物的細胞系作為細胞模型，獲得腫瘤細胞的藥物敏感性參數；2)用上述工具藥分別作用各種細胞后，篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，抽提mRNA，與表達譜芯片雜交，檢測藥物作用的早期反應基因；3)應用計算機分析軟件對藥物反應基因進行統計和分類，得到藥物標志基因和特異性瘤譜基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的工具藥物是已知四大類細胞毒抗腫瘤藥物中臨床使用的、作用機理較為明確的的藥物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用四唑氮鹽比色法檢測工具藥物對腫瘤細胞系的藥物細胞毒作用，得到敏感腫瘤細胞系藥物半數抑制濃度，刺激相應的腫瘤細胞系。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，還可選擇高于半數抑制濃度的藥物濃度進行細胞刺激。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，可采用多種細胞系同步藥物處理后分別抽提mRNA，然后等量混合后與表達譜芯片雜交。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，可采用多種細胞系同步藥物處理后合并所有細胞，然后抽提mRNA，與表達譜芯片雜交。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用聚類分析方法對藥物反應基因進行統計和分類。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，可應用雙盲法，在基因芯片和細胞水平上二級驗證基于基因芯片的藥物篩選模型進行抗腫瘤藥物篩選的準確性。
全文摘要
本發明提供了一種基于基因芯片的抗腫瘤藥物篩選方法，它包括步驟1)使用若干細胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物作為工具藥物，使用若干種常用的篩選抗腫瘤藥物的細胞系作為細胞模型，獲得腫瘤細胞的藥物敏感性參數；2)用上述工具藥分別作用各種細胞后，篩選出各工具藥物相應的敏感細胞系，抽提mRNA，與表達譜芯片雜交，檢測藥物作用的早期反應基因；3)應用計算機分析軟件對藥物反應基因進行統計和分類，得到藥物標志基因和特異性瘤譜基因。該方法具有更高的抗腫瘤藥物篩選效率，并且可以在基因調控水平上部分闡明藥物的作用機理，為大規模、高通量篩選腫瘤藥物提供了技術手段。
文檔編號C12Q1/68GK1408883SQ0112694
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月30日 優先權日2001年9月30日
發明者毛裕民, 謝毅, 張俊平, 應康, 郭學青, 陳哨輝, 陳穎 申請人:上海博德基因開發有限公司