專利名稱：長川霉素農用殺菌劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明是關于以長川霉素為有效成份的農業園藝殺菌劑和其制備方法，以及該殺菌劑的應用。
本發明人為了尋找比以往更有效的殺菌劑，從多種土壤中分離出微生物來制取微生物代謝產物，然后對這些代謝產物分別進行精制、鑒定和開發應用。在此過程中，本發明人發現由屬于鏈霉菌屬的一種菌種所產生的代謝產物對多種作物病害有優良的防治效果，經對有效成份的精制、鑒定，命名為長川霉素。經鑒定對照發現長川霉素平面結構與文獻報道的子囊霉素(Ascomycin)相同，圖譜分析及數據比較見圖3-10。據1964年的Journal of antibiotic第15期第231頁報道，子囊霉素由鏈霉菌KKS317(S.Sp.)經發酵產生，是一個大環內酯類抗生素，具有防治分枝桿菌607、黑根霉、米曲霉、白色假絲酵母、趾間發癬霉、須發癬霉等皮膚真菌病的作用。
長川霉素農用殺菌劑的制備方法一.使用的微生物用來得到本發明所述的長川霉素的微生物是一種屬于鏈霉菌屬的菌種，具有生產該抗生素的能力。1987年7月從我國廣西梧州地區的土壤中分離而得的生黑孢鏈霉菌廣西變種SPRI 98520菌株就具有上述特性，適用于生產本發明所述的長川霉素。SPRI 98520菌株于2001年9月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為(CGMCC NO.0638)。該菌株的形態特征、培養特征、生理生化特征及菌種分類結果如下1.形態特征在高氏合成一號瓊脂，葡萄糖天門冬素瓊脂上插片培養7-15天后，SPRI 98520菌種的基內菌絲體無橫隔、不斷裂、無分生孢子，氣生菌絲體分支較多，孢子絲波曲至初級螺旋(1-2圈)時常形成吸水斑，孢子似形成橫隔分裂，表面粗糙，有疣狀突起物(見

圖1和圖2)。
2.培養特征SPRI 98520菌株在八種培養基上的生長結果(見表1)表1.SPRI 98520菌株的培養特征

3.生理生化特征(見表2)生長溫度范圍 17-36℃最適生長溫度 24-36℃PH生長范圍PH5～10最適PHPH5～9表2.SPRI 98520菌株的生理生化特征

4.化學分類(1)菌株SPRI 98520含有LL-DAP(LL-Diaminopimelic acid二氨基庚二酸)、甘氨酸、糖型C(無特征性糖)，細胞壁化學組份屬于I型。(2)SPRI 98520菌株含有磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酸類脂屬于II型。(3)醌的測定醌是位于細胞膜上的電子傳遞體，放線菌細胞膜上的醌主要為甲基奈醌(MK)。SPRI 98520菌株含有MK9(H4、6、8)，其中MK9(H6)含量少。5.菌種鑒定結果根據形態與化學分類定屬原則，SPRI 98520菌株基內菌絲體無橫格、不斷裂、無分生孢子，氣生菌絲體生長良好，分支好，孢子絲有波曲至初級螺旋，生長15天后形成濕黑吸水斑，孢子表面有疣狀物，細胞壁化學組份為I型，磷酸類脂為II型，甲基奈醌MK9(H4、6、8)，屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。
根據多項分類結合培養特征和生理生化特性定種的原則，SPRI-250菌株的氣生菌絲體及孢子絲均有濕黑吸水斑，基內菌絲體無色或黃褐色，無可溶性色素，屬于鏈霉菌吸水類群(StreptomycesHygroscopicus)。我們與已知子囊霉素產生菌比較，結果見表3、表4，從比較結果可看出，SPRI 98520菌株與子囊霉素產生菌差異很大，雖然同屬鏈霉菌屬吸水類群，但從形態特征、培養特征及生理生化特征比較有很大差異。但是SPRI 98520菌株的形態特征、培養特征及生理生化特征均與已知種生黑孢鏈霉菌很相似(表5)，因此SPRI98520菌株定名為生黑孢鏈霉菌廣西變種(Streptomycesmelanosporofaciens var.guangxicus)。
表3.SPRI 98520菌株和子囊霉素產生菌種形態及培養特征比較

表4.SPRI 98520與菌株和子囊霉素產生菌生理生化特征比較

表5.SPRI 98520菌株與生黑孢鏈霉菌(S.melanosporus)形態特征、培養特征及生理生化特征比較

二.微生物培養及長川霉素制備用鏈菌屬的上述產生菌，通過常規的抗生素生產方法，可以經菌種及種子培養得SPRI 98520菌株，在玻璃瓶中在24-30℃振蕩培養36-40小時，作為種子，又通過發酵培養及分離培養及分離提取制得本發明所述的長川霉素。培養方法既可為深層液體培養，也可為固體培養。為了有利于工業性的培養，宜將上述生產菌的孢子懸浮液接種到培養基上，并進行通氣攪拌。
對培養基中的營養源并無特殊的規定，可使培養基中含有常用于微生物培養的碳源、氮源及其他營養源。其中碳源可為淀粉、糊精、葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇等，氮源可為肉胨、黃豆餅粉、花生粉、酵母、肉膏、米糠、玉米漿、麥皮、銨鹽、尿素、硝酸鹽以及其他有機或無機含氮化合物。其他營養源可適當添加一些無機鹽類，例如食鹽、磷酸鹽及鉀、鈣、錳、鐵等金屬鹽。必要時可添加一些動、植、礦物油等作為消泡劑。
培養的種子以5-20％的比例接種于培養基組成的發酵培養液中，對溫度、PH、時間等發酵培養條件并無嚴格的限制，以適于產生菌的生產為準，并以選擇長川霉素產量最高的條件為好。例如，培養基的PH范圍可為6-8，以接近中性為好；培養溫度在24-30℃，培養時間90-96小時，通氣比(每分鐘通過培養液的空氣體積與培養液體積之比)可采用1∶0.3-4，并保證罐壓為0.02-0.1Mpa。這些培養基的組份、PH、培養溫度、培養時間、通氣條件等均應根據實際情況進行適當的調整，以獲得最好的效果。
由上述所得的培養物出發，通過一些適當的方法就能制得長川霉素。例如，可利用長川霉素與雜質在溶解度、離子結合力、分配系數、吸附親和力及分子量等方面的差異進行提取精制。這些方法可單獨使用，也可適當配合或反復使用。具體地講，長川霉素同時存在于發酵液和菌絲體中，將菌絲體丙酮、乙醇等有機溶劑破壁提取，所用有機溶劑與菌絲體重量比為2-3∶1，與發酵液合并后，通過大孔吸附樹脂吸附，然后用丙酮或乙醇等有機溶劑解吸，解吸液經濃縮后得到粗提物(含長川霉素20％左右)；粗提物再經過硅膠層析，就可得到淡黃色的半精制品(含長川霉素85％左右)。最后利用長川霉素與少量雜質在不同溶劑中的溶解度不同，進行重結晶，即可得到長川霉素純品，純度可達98-99％。得到的長川霉素純品具有如下理化性質1.外觀無色至淡黃色粉末狀結晶；2.熔點148-152℃；3.溶解性可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙腈等，微溶于正己烷、汽油等，不溶于水；4.紫外吸收末端吸收，圖譜見圖3；5.質譜(MS，FAB+)表明分子量為791，圖譜見圖4；6.氫譜(1HNMR)圖譜見圖5，7.碳譜(13CNMR)δ(ppm，CDCl3)213.04(s) 196.21(s) 169.07(s) 164.92(s) 138.67(s) 132.46(s)193.23(s) 168.85(s) 165.97(s) 139.53(s) 131.96(s)130.20(d) 123.42(d) 97.28(s) 84.37(d)77.80(d) 75.53(d)130.08(d) 123.59(d) 98.75(s) 78.24(d) 76.98(d)73.92(d) 73.69(d) 73.11(d) 70.11(d)57.02(q) 56.60(q)72.72(d) 69.21(d) 57.43(q)56.23(d) 56.72(d) 55.10(d) 48.90(d)40.19(d) 27.67(t)55.98(d) 52.92(d) 54.98(d) 48.57(d)40.63(d) 26.32(t)26.51(d) 24.60(t) 21.19(t) 20.47(q)16.21(q) 15.83(q)26.44(d) 20.86(t) 19.75(q)15.97(q) 15.94(q)14.04(q) 11.68(q) 9.64(q)14.16(q) 9.93(q)圖譜見圖6；根據紫外光譜(UV)、質譜(MS)、氫譜(1HNMR)、碳譜(13CNMR)以及其他數據及譜圖，確定該化合物分子式為C43H69NO12，推定該化合物平面結構如下 經檢索，與文獻報道的子囊霉素平面結構相同。子囊霉素的紫外、質譜、氫譜、碳譜分別見圖7到圖10。
三.農業園藝殺菌劑制備本發明所述的長川霉素農用殺菌劑是一種對因病原菌引起的植物病害，特別是各類灰霉病、玉米小斑病、水稻稻瘟病、瓜類炭疽病等有效的殺菌劑。它對作物的病害具有預防和治療作用，而且還具有低毒、安全、對光穩定等性能。在制造本發明所述的以長川霉素為有效成份的農用殺菌劑時，可同樣使用該技術領域已知農藥所通用的固相、液相及乳化分散劑等各種載體和助劑，并能配制成顆粒劑、粉劑、乳劑、可濕性粉劑、片劑、微膠囊劑、油劑、噴霧劑、膠懸劑等任意的劑型。同時，在各種制劑中一般可適當添加一些輔助劑，如分散劑、乳化劑、潤濕劑、滲透劑、展著劑、粘著劑、消泡劑、發泡劑、增粘劑、穩定劑等，但不能加入堿性輔助劑。
各種制劑中有效成份的含量，可根據不同的使用目的而適當增減。一般來說，粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑、片劑的有效成份范圍通常在1-70重量％，乳劑、油劑、膠懸劑、噴霧劑的有效成份范圍在0.2-30重量％，微膠囊劑在10-80重量％。
本發明長川霉素農用殺菌劑的使用方法是將其各種制劑按對不同作物病害和作物的防治要求稀釋成一定濃度，采用噴霧器均勻噴灑在作物上即可。
長川霉素農用殺菌劑可防治多種植物病害，具體來說，可防治灰霉病(Botrytis cinerea)、抗性灰霉病(Botrytis cinerea resistance)、玉米小斑病(Helminthosporium maydis)、瓜類炭疽病(Colletotrichumlagenarium)、水稻白葉枯病(Xanthomonas oryzae)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum，f.vasinfectum)、水稻稻瘟病(Pyriculariaoryzae)、水稻胡麻斑病(Helminthosporium oryzae)、小麥赤霉病(Gibberella zeae)、水稻紋枯病(Rhizoctonia solani)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum)、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、黃瓜霜霉病(PseudoPeronosporacubensis)、瓜白粉病(Sphaerotheca fuliginea)、早疫病菌(Alternaria solani)、梨輪紋病(Physalospora piricoraNose)、蠟葉枝孢霉(Cladosporium herbarum M-44)、土曲霉(Aspergillus terreus)、棕曲霉(Aspergillus ochraceus M-130)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans M-266)、變色曲霉(Aspergillus versicolor M-41)、球毛殼霉(Chaetomiumglobosum M-70)、擬青霉(Paecilomyces sp.M-43)、繩狀青霉(Penicillum funiculosum M-184)、根霉(Rhizopus sp.M-59)、毛霉(Actinomucor elegans M-211)、綠色木霉(Trichoderma viride)、交鏈孢霉(Alternaria sp)、小球藻(Chlorella vulgaris)、大腸桿菌(Eshchcrichia coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)。
下面實施例7至實施例13的結果表明，以本發明所述的以長川霉素為有效成份的藥劑是一種新型的農用殺菌劑，該藥劑特別對防治作物灰霉病、玉米小斑病等多種病害有卓越的效果。與現有藥劑相比，本發明所述的長川霉素具有高效用量少(在同等防治效果時，每畝用量長川霉素僅為3-12.5克，而其它現有藥劑需20-500克)、農民使用成本低(長川霉素每畝使用成本為4元左右，而其它現有藥劑需8元左右)、使用范圍廣(長川霉素可防治灰霉病抗性菌和敏感菌以及其它31種病害，而目前常用藥劑往往只能防治少數幾個病害)等優點，而且穩定性好，安全低毒。此外，利用本發明制備長川霉素農用殺菌劑時，可充分利用黃豆餅粉、玉米粉、羽毛粉等農副產品，變廢為寶，使長川霉素殺霉菌劑生產成本降低。
通過以下附圖及實施例將對本發明作進一步闡明，但并不限制本發明內容。
圖2是SPRI 98520菌株的孢子表面特征，電子顯微鏡照片(100,000x)。
圖3是長川霉素的紫外光譜圖。
圖4是長川霉素的質譜圖(FAB-MS)。
圖5是長川霉素的1HNMR譜圖。
圖6是長川霉素的13CNMR譜圖。
圖7是子囊霉素的紫外光譜圖。
圖8是子囊霉素的質譜圖(FAB-MS)m/z830(M+K)、814(M+Na)、714(M-OH)、756(M-OH-H2O)。
圖9是子囊霉素的1HNMR譜圖。
圖10是子囊霉素的13CNMR譜圖。
實施例2 長川霉素可濕性粉劑制備取實施例1中得到的I或II、或III40份與2份木質素磺酸鈉、4份拉開粉、2份浸潤劑LS以及52份硅藻土混合、粉碎，即得100份所需含量的可濕性粉劑。
實施例3 長川霉素乳劑制備將實施例1中得到的I或II、或III28份與10份乙二醇、20份二甲基甲酰胺、10份二甲苯及32份乙醇混合，即得100份所需含量的乳劑。
實施例4 長川霉素粉劑制備將實施例1中得到的I或II、或III2份與5份硬脂酸鈣、50份滑石粉及43份陶土混合粉碎，即得100份所需含量的粉劑。
實施例5 長川霉素膠懸劑制備將實施例1中得到的I或II、或III20份與0.15份拉開粉、0.15份苯酚、1.2份十八烷基硫酸鈉、1.2份司盤、0.1份吐溫、0.6份乙二醇以及76.6份水混合均勻，即得100份所需含量的膠懸劑。
實施例6 長川霉素顆粒劑制備根據所需要的含量，取實施例1中得到的I或II、或III10份與15份淀粉、72份皂土粉及3份硫酸十二烷基酯的鈉鹽混合、粉碎，即得100份所需含量的顆粒劑。
實施例7 應用長川霉素預防灰霉病將按實施例1所制備的I、II、III或實施例2、3、4、5、6所制備的長川霉素制劑稀釋至所預定濃度，均勻噴灑在一張真葉期黃瓜苗上，待藥液干后在黃瓜葉片中央接種灰霉病病菌，在20℃下保濕72小時，檢查發病情況，計算預防效果。試驗結果表明24毫克/升的長川霉素就可達到100％的預防效果。試驗結果見表6。
表6.長川霉素預防黃瓜灰霉病效果

實施例8 應用于防治番茄灰霉病將按實施例2、3、4、5、6所制備的長川霉素制劑稀釋至所預定的濃度(有效成份分別為25、50、100毫克/升)，同時以50％速克靈可濕粉300毫克/升作對照藥劑，清水作空白對照。采用噴霧器均勻噴霧，藥液量每畝50升。試驗結果表明，每畝用長川霉素有效成分2.5克左右，就可達到70％以上的防治效果，而目前常用藥劑每畝需150克以上才能達到相似防治效果。試驗結果如表7。
表7.長川霉素防治番茄灰霉病試驗結果

實施例9 應用于防治玉米小斑病在玉米苗長到大喇叭期(13葉1心)時，用玉米小斑病菌孢子懸浮液進行噴霧接種，接種后1小時，將按實施例2、3、4、5、6所制備的長川霉素制劑稀釋至所預定濃度，分別進行噴霧處理，將葉片正反面噴濕，葉片上形成水層，直到葉面上有多余的液體下滴為止。以甲基托布津做對照藥劑，清水做空白對照，每個處理設3個重復，15天后調查防治結果。試驗結果表明，防治玉米小斑病時畝用長川霉素12.5克，就可達到80％以上的防治效果，可顯著優于對照藥劑50克/畝的防效。試驗結果見表8。
表8.長川霉素防治玉米小斑病結果

實施例10 應用于防治草莓、茄子灰霉病將按實施例2、3、4、5、6所制備的長川霉素制劑稀釋至所預定濃度，用進口藥劑速克靈做對照藥劑，清水做空白對照，在草莓和茄子灰霉病發病初期噴藥，每隔7天噴1次，共噴3次，畝用藥液量70公斤。最后一次噴藥后7天調查發病率、病情指數及防治效果。試驗結果表明畝用長川霉素7克左右，就可有效防治草莓和茄子的灰霉病。試驗結果見表9。
表9.應用長川霉素防治草莓、茄子灰霉病

實施例11 防治其他作物病害將按實施例1所制備的I、II、III或實施例2、3、4、5、6所制備的長川霉素制劑稀釋至所預定濃度，在室內采用培養皿法(除水稻白葉枯病、黃瓜霜霉病、瓜類白粉病用盆栽法外)作試驗，同時以清水作空白對照，結果如表10。
表10.長川霉素可的防治病害

實施例12 長川霉素對多菌靈抗性菌株、敏感菌株的作用在長川霉素處理過的黃瓜苗上，分別接種灰霉病菌、多菌靈抗性菌和敏感菌，一周后調查發病情況。試驗結果表明，長川霉素對多菌靈抗性菌和敏感菌都有良好的防治效果。試驗結果見表11。
表11，長川霉素對多菌靈抗性菌株、敏感菌株的作用

實施例13 太陽光照射穩定性試驗用100、50、25毫克/升的長川霉素藥液在一張真葉期的盆栽黃瓜苗上分別噴藥，置于太陽光下直接照射6小時(光照強度為800-1000燭光/平方米)，然后用灰霉病菌接種，20℃下保濕72小時，檢查發病情況，計算防治效果。試驗結果表明，長川霉素對光照穩定，太陽光照6小時后，防效仍達到100％。結果見表12。
表12.太陽光照射對長川霉素藥效的影響

權利要求
1.一種農用殺菌劑，其特征在于它是以長川霉素為有效成份的殺菌劑。
2.按權利要求1所述的農用殺菌劑，其特征在于所述殺菌劑的劑型是乳劑、油劑、膠懸劑、噴霧劑時，則其中長川霉素有效成份的含量為0.2-30重量％。
3.按權利要求1所述的農用殺菌劑，其特征在于所述殺菌劑的劑型是粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑、片劑時，則其中長川霉素有效成份的含量為1-70重量％。
4.按權利要求1所述的農用殺菌劑，其特征在于所述殺菌劑的劑型是微膠囊劑時，則其中長川霉素有效成分的含量為10-80重量％。
5.權利要求1所述農用殺菌劑的制備方法，其特征在于包括先培養生黑孢鏈霉菌廣西變種SPRI 98520 CGMCC No.0638，再將發酵培養物進行分離提取，用丙酮或乙醇將菌絲體破壁后，與發酵液合并，經樹脂交換分離，并用丙酮或乙醇解吸，解吸液濃縮或進而純化得長川霉素，再添加載體和助劑配制而得。
6.按權利要求5所述農用殺菌劑的制備方法，其特征在于所述殺菌劑可配制成顆粒劑、粉劑、乳劑、可濕性粉劑、片劑、微膠囊劑、油劑、噴霧劑、膠懸劑的劑型。
7.按權利要求1所述農用殺菌劑的應用，其特征在于所述殺菌劑可防治下列作物病害灰霉病、抗性灰霉病、玉米小斑病、瓜類炭疽病、水稻白葉枯病、棉花枯萎病、水稻稻瘟病、水稻胡麻斑病、小麥赤霉病、水稻紋枯病、油菜菌核病、馬鈴薯晚疫病菌、黃瓜霜霉病、瓜白粉病、早疫病菌、梨輪紋病、蠟葉枝孢霉、土曲霉、棕曲霉、出芽短梗霉、變色曲霉、黑曲霉、球毛殼霉、擬青霉、繩狀青霉、根霉、毛霉、綠色木霉、交鏈孢霉、小球藻、大腸桿菌、枯草桿菌。
全文摘要
本發明提供一種以長川霉素為有效成分的農用殺菌劑及其制備方法和應用。該殺菌劑的制備方法包括先培養生黑孢鏈霉菌長川變種SPRI 98520 CGMCC No.0638;再將發酵培養物進行分離提取,用丙酮或乙醇將菌絲體破壁后與發酵液合并,經樹脂交換分離,并用丙酮或乙醇解吸,解吸液濃縮或進而純化得長川霉素;再添加助劑配制而得。試驗結果表明,該殺菌劑特別對防治作物灰霉病、玉米小斑病等多種病害有卓越的效果。與現有藥劑相比,具有用量少,農民使用成本低、使用范圍廣等優點,而且穩定性好,安全低毒。
文檔編號C12N1/20GK1364414SQ01126969
公開日2002年8月21日 申請日期2001年10月8日 優先權日2001年10月8日
發明者陶黎明, 倪長春, 沈寅初, 張云樺, 顧學斌, 徐文平, 吳霞, 王磊, 祁秀明, 沈宙, 顧必文 申請人:上海市農藥研究所