卵巢癌癌組織3d培養方法及其在藥效評價中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物學領域，特別是設及一種卵巢癌癌組織3D培養方法及其在藥效 評價中的應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤是嚴重危害人民身體健康的主要疾病之一，腫瘤的發生機理多樣而復雜，但 目前常規的化療藥物幾乎都是針對增殖能力旺盛細胞的細胞毒藥物，對人體內正常的高增 殖細胞也產生毒副作用。因此，許多藥物研發機構均致力于開發高效、低毒和高特異性的祀 向性抗腫瘤藥物，傳統單一的抗腫瘤藥物篩選方法也已不足W應付抗腫瘤藥物藥效學發展 的需求。
[0003] 伴隨著對腫瘤發病機理認識的不斷深入和腫瘤祀向性藥物的開發，精確化醫療逐 漸成為未來腫瘤醫學研究與應用的趨勢，而精確化治療的關鍵在于腫瘤基因和生物分子標 志物的診斷、微環境對腫瘤進展和療效的影響W及基于前者條件下的抗癌藥物種類和劑量 的個體化選擇。
[0004] 目前抗腫瘤藥物篩選評價的體外方法主要是腫瘤細胞的2D培養系統，體內篩選 評價方法主要使用的是動物模型。
[0005] 2D培養時，腫瘤細胞在形態、分化、擴增、對刺激的代謝反應W及基因蛋白質表達 等方面均與其在體內的狀態存在著很大的不同，許多在腫瘤組織中存在的基因突變，在腫 瘤細胞系中并不存在。2D培養也缺乏腫瘤細胞生存的微環境，而腫瘤細胞生長的微環境對 其生物性狀和信號傳導途徑均有巨大的影響，即使是原代腫瘤細胞的2D培養也不能真實 再現運種相互影響，無法提供與活體腫瘤組織更接近的類器官和新鮮腫瘤組織3D培養所 能提供的強大信息。此外，微環境中的基質成分、血管系統、各類生長因子、免疫刺激因子和 免疫細胞等對細胞的生物性狀和抗腫瘤藥物的敏感性和耐受性也有很大的影響。而目前使 用的動物評價體系，由于與人類存在著較大的種屬差異，也不能完全反映藥物在人體內的 代謝過程、藥效作用和毒副作用。因此，許多在臨床前評價中具有潛力的藥物，在臨床試驗 時卻失敗了，證明了目前使用的體內外評價體系并不能很好地預測藥物在人體內的有效性 和安全隱患。建立能更好地模擬人腫瘤組織的3D培養方法是抗腫瘤藥物發展的迫切需求。
[0006] 不同腫瘤患者對不同化療藥物的敏感性存在著差異，即使是同一種抗腫瘤藥物， 在不同的腫瘤患者個體身上也表現出不同的治療效果和預后。出現運種情況的主要原因與 復雜的腫瘤異質性及腫瘤細胞和微環境的相互作用有關，因此，提供有針對性的精確化診 療已成為腫瘤治療的發展方向。但目前輔助精確化診療實施的主要方法是基因測序和生物 分子的標記；臨床上雖已開展了個體化的藥物評價實驗，但使用的方法主要是從患者腫瘤 組織分離的腫瘤細胞的2D培養和人腫瘤組織在裸鼠體內的評價體系（PDX)，不僅存在著上 述問題，而且耗時、費力，影響對患者采取及時有針對性的治療措施。

【發明內容】

[0007] 本發明主要解決的技術問題是提供一種卵巢癌癌組織3D培養方法及其在藥效評 價中的應用，有望解決目前常規的抗腫瘤藥物的評價方法中存在著種屬差異對評價結果的 影響、不能準確反應藥效、評價時間太長等問題。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種卵巢癌癌組織3D 培養方法，包括步驟為：（〇向孔板中滴加Matrigel膠，室溫或C〇2培養箱內靜置使所述 Matrigel膠凝固； (2) 將浸于第一培養液中的腫瘤組織塊移至凝固后的所述Matrigel膠上，再向所述腫 瘤組織塊上滴加Matrigel膠，室溫或C〇2培養箱內靜置使所述Matrigel膠凝固； (3) 向步驟（1)的孔板中加入第二培養液進行培養，再取出培養后的所述腫瘤組織塊并 固定，其中所述第二培養液包括的組分有高糖DMEM培養液、F12培養液、表皮細胞生長因子 EGF、成纖維細胞生長因子FGF和10X成。
[0009] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（1)和步驟（2)中所述Matrigel膠是用DMEM稀 釋的，所述DMEM與所述Matrigel膠的體積比為1:1-1: 5。
[0010] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（1)和步驟（2)中所述每次滴加稀釋后的 Matrigel膠的量為 10-50yL。
[0011] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（2)中所述腫瘤組織塊的大小為0.5-1mm3,所 述腫瘤組織塊先用緩沖液洗涂后再浸于DMEM培養液中，所述腫瘤組織塊的制作過程在碎 冰上進行。
[0012] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（3)中所述第二培養液是將所述高糖DMEM培養 液、所述F12培養液、所述10XNz按體積比為34:11:5進行混合，形成混合液，所述混合液 再與所述表皮細胞生長因子EGF、所述成纖維細胞生長因子FGF按照體積比為500:1:1進行 混合得到所述第二培養液。
[0013] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（3)中所述培養時間分別為24h、48h和72h， 終止培養后將所述腫瘤組織塊從所述第二培養液里取出，固定于質量百分比為10%的中性 福爾馬林固定液或質量百分比為4%的多聚甲醒固定液中。
[0014] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（3)中還包括對固定的所述腫瘤組織塊進行石 蠟包埋、切片、肥染色和Ki67免疫組化染色，觀察卵巢癌組織結構和細胞形態的變化。
[0015] 在本發明一個較佳實施例中，步驟（3)中還包括向所述第二培養液中加入化療藥 物，繼續培養24h、48h和72h，然后將所述腫瘤組織塊從所述第二培養液里取出，固定于 質量百分比為10%的中性福爾馬林固定液或質量百分比為4%的多聚甲醒固定液中，再對 固定的所述腫瘤組織塊進行石蠟包埋、切片、染色，觀察腫瘤組織組織結構和細胞形態的變 化，計數細胞核崎變數，計算核崎變率，分析核崎變率作為抗腫瘤藥物藥效評價方法和指標 的可行性。
[0016] 在本發明一個較佳實施例中，所述染色為肥染色或Ki67免疫組化染色。
[0017] 本發明的有益效果是：本發明所建立的人卵巢癌組織的3D培養方法，能更快、更 準確地評價抗腫瘤藥物的藥效結果，能彌補2D細胞培養和動物實驗評價技術的薄弱環節， 有望促進我國創新性抗癌藥物的研發和精確化治療的進程。
【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使 用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于 本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可W根據運些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發明中卵巢癌組織在培養0天(A)U天（B)、2天（C)、3天（D) 時的組織結構和細胞形狀，圖中所示是肥染色結果，放大倍數為400X; 圖2是本發明中卵巢癌組織在培養時同時加入多西他賽膠束，繼續培養1 天（A)、2天（B)、3天（C)時的組織結構和細胞形狀的變化，圖中所示是肥染色結果，放 大倍數為400X; 圖3是本發明中卵巢癌組織在培養0天(A)U天（B)、2天（C)、3天（D) 時的組織結構和細胞形狀，圖中所示是Ki67免疫組化染色結果，放大倍數為400X; 圖4是本發明中卵巢癌組織在培養時同時加入多西他賽膠束，繼續培養1 天(A)、2天（B)、3天（C)時的組織結構和細胞形狀的變化，圖中所示是Ki67染色結果， 放大倍數為400X; 圖5是本發明中卵巢癌組織在培養時同時加入多西他賽膠束，然后培養0 天、1天、2天、3天時細胞核發生崎變的比率(百分比)，圖中所示是對Ki67染色的計數 統計結果。
【具體實施方式】
[0019] 下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施 例僅是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通 技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范 圍。 I；0020] 實施例一； 提供一種卵巢癌癌組織3D培養方法，包括步驟為： (1) 腫瘤組織塊的制作 取腫瘤組織，采用眼科手術器械將其剪切成0. 5-1mm3的組織塊，用憐酸鹽緩沖液 (1XPBS)洗涂后浸于DMEM培養液中置冰上備用； (2) 腫瘤組織塊培養 取6孔板、24孔板或96孔板，沿底邊局部滴加10-50yL稀釋后（與DMEM的稀釋比例 為1:1-1:5)的Matrigel膠，室溫或C〇2培養箱中放置10-30min,小屯、將組織塊移至此凝 固的Matrigel上，再在組織塊上滴加10-50yL稀釋后(與DMEM的稀釋比例為1:1-1:5)的 Matrigel膠，置C〇2培養箱中靜置20-30min。 陽02U 取出孔板，小屯、加入0. 4血培養液至24孔板、0. 1血至96孔板或2. 5血至6孔 板進行培養，所述培養液的成份如下表所示，表中是100mL培養液中所含的各種成份