一種Ogura型蘿卜雄性不育細胞質及其選育方法
【專利摘要】本發明涉及作物育種技術領域，特別涉及一種Ogura型蘿卜雄性不育細胞質及其選育方法。該Ogura型蘿卜雄性不育細胞質，其特征在于：具有所述不育細胞質的雄性不育系雄蕊退化徹底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發育正常，低溫下花蕾不黃化，其育性的保持與恢復與原Ogura型雄性不育系有差異。本發明雄性不育細胞質的發現，既可以作為正常的雄性不育材料進行作物雜交育種，拓寬了保持系的選擇范圍，又可利用它進一步揭示orf138不育基因的作用機理，對蘿卜細胞質雄性不育的深層次研究具有十分重要的意義。CCTCC NO：P200
【專利說明】一種Ogura型蘿K隹性不育細胞質及其選育方法
[0001] ( - )技術領域 本發明涉及作物育種技術領域，特別涉及一種Ogura型蘿卜雄性不育細胞質及其選育方法。
[0002] (二)【背景技術】 植物雄性不育是指植物在花器發育上，雌蕊發育正常，能夠正常的接受花粉，形成胚， 最后發育成種子;而雄蕊的花粉、花粉囊等由于受基因型、環境條件等因素的影響，不能產 生具有功能作用的花粉的現象。
[0003] 由基因型造成的雄性不育，又分為兩種類型：一種核基因控制的雄性不育，它又分 為顯性核雄性不育和隱性核雄性不育，核基因控制的雄性不育系所選出的保持系，只有50% 的保持率，在其后代中有一半可育株和一半不育株，在生產中不結合其它措施很難直接應 用。另一種是細胞質基因控制的雄性不育，又稱細胞質雄性不育，其本質是細胞核和細胞質 基因互作形成的雄性不育，就是雄性不育株必須帶有具有雄性不育基因的細胞質，同時，在 核基因中不能含有該不育基因的恢復基因。這里所說的"恢復基因"是指能夠恢復不育系育 性的基因，當雄性不育株含有該恢復基因后，不育株的雄性育性就恢復正常。當一個同類的 個體在細胞質中既不含有不育基因，在細胞核中又不含有恢復基因，該個體就是這個不育 系的保持系，它的保持率是100%。在作物的雄性不育系育種中絕大多數都利用細胞質雄性 不育的這個特性來進行品種選育的。如水稻、玉米、蘿卜、甘藍、油菜、菜花、洋蔥等。
[0004] 蘿卜雄性不育同樣表現為花藥退化，或不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發育 正常。生產上使用的蘿卜雄性不育系是由細胞質基因和細胞核基因共同互作，形成的一種雄 性不育現象。蘿卜細胞質雄性不育基因存在于線粒體DNA上，主要是由于線粒體基因組分子 內或分子間頻繁重組所形成的異常嵌合基因造成的。研究發現，蘿卜雄性不育的主控基因為 〇rf!38與線粒體基因組中具有正常功能的基因共轉錄，產生異常轉錄本和翻譯產物，從而 在花藥發育的某個時期干擾線粒體的正常功能發揮，最終導致雄性不育現象的發生。線粒 體基因組的轉錄和翻譯產物雖然只占整個細胞質基因組產物的很少部分，但其轉錄和翻譯 情況比較復雜。
[0005] 至今為止，在蘿卜雄性不育基因類型中，Ogura雄性不育是導入率和穩定性最佳的 不育材料，也是目前研究最為深入的一種雄性不育材料，日本學者Yamagishi通過對野生 種、栽培種等不育材料的〇rf!38基因進行測序分析，發現Ogura雄性不育基因 〇rf!38可以分 為九個變異類型（如下表），已經明確導致雄性不育的有A、B、D、F、H型，A型通稱為Ogura型，F 型稱為Kosena型，有人研究，A型和F型的保持和恢復關系是一致的。其它類型之間的育性恢 復和保持關系尚不確定，不同類型間除〇rf!38基因以外線粒體DNA變異對細胞質雄性不育 的影響也不明確。
[0006] Ogura雄性不育基因 orf 138的九個類型一覽表
注:表中Δ a欄的"+"為基因中缺失39個堿基對。Orfl38類型中A為最早發現的測序的序 列。其它欄中為與A型沒有變化。
[0007] 目前蘿卜育種和生產中普遍使用的是Ogura型細胞質雄性不育系，由于有的材料因 含有純合恢復基因選不出保持系，限制了不育系的使用，在蘿卜育種和生產上迫切需要多種 類型的不育材料，拓展保持系的選擇范圍，提高雄性不育育種的成功率。
[0008] (三)
【發明內容】
本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種Ogura型蘿卜雄性不育細胞質及其選育方法。
[0009] 本發明是通過如下技術方案實現的： 一種Ogura型蘿卜雄性不育細胞質，其特征在于:具有所述不育細胞質的雄性不育系雄 蕊退化徹底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發育正常，低溫下花蕾不黃化，其育性 的保持與恢復與原Ogura型雄性不育系有差異;其保藏號為CCTCC No:P201520，分類命名 為:蘿卜雄性不育系R64A Raphanus sativus L.;保藏單位是中國典型培養物保藏中心，地 址湖北省武漢市武漢大學校內，保藏日期為20151120。
[0010]本發明所述的Ogura型蘿卜雄性不育細胞質的選育方法，包括如下步驟： (1) 選擇檢測后的具有Ogura A型雄性不育細胞質的可育純合植株作為父本，以其他非 Ogura A型細胞質的雄性不育材料作母本，進行雜交篩選； (2) 在雜交后代中表現為全部不育的，即表示該不育材料與Ogura A型細胞質雄性不育 存在育性的差別，經多代雜交驗證之后，明確兩者確實存在育性保持與恢復上的差異； (3) 將獲得的具有新型蘿卜雄性不育細胞質的材料進行orfl38基因的PCR分子標記與片 段測序，比較兩者之間在〇rfl38基因上的序列差異； (4) 對新型不育系細胞質線粒體DNA進行測序、組裝； (5) 比較新的不育細胞質與Ogura A型不育細胞質在線粒體DNA上的差異。
[0011]本發明的更優技術方案為： 步驟（1)中，用Ogura特異引物：0RF-F 5 ' -TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3 ' 和0RF-R 5 ' - GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對新型蘿卜細胞質雄性不育材料及可育純合植株進行PCR分 子標記。
[0012] 本發明由于采用以上技術方案，具有以下優點： (1) 拓寬了Ogura型蘿卜雄性不育保持系的選育范圍，原來只是從具有非Ogura細胞質類 型的材料中選育保持系，通過該方法，同樣可以從具有Ogura細胞質類型的材料中選育保持 系，有效解決了一些性狀優良的具有Ogura細胞質材料的三系利用問題;特別是隨著雄性不 育系制種的不斷增加，該類型材料將會越來越多； (2) 本發明涉及的一種新型Ogura雄性不育細胞質，對進一步研究Ogura細胞質雄性不 育機理提供一個十分重要的材料； (3) 本發明涉及的雄性不育細胞質同樣具有一般雄性不育系的功能，能夠進行雜交種 的配制與選育。
[0013] 本發明打破了傳統保持系的選育范圍和方法，以新發現的雄性不育系為不育材 料，從具有〇gura-A細胞質類型的可育蘿卜植株中選育出了雄性不育系的保持系。通過對兩 個材料細胞質線粒體進行測序、組裝，兩者的線粒體DNA除在orfl38基因中的第165574和 165613處有兩個堿基上的差異外，在整個線粒體DNA中還有53個堿基的變異和插入與缺失。 兩者雖然同為Ogura細胞質雄性不育系，但它們的育性有著明顯的差別，證明本發明所采用 的新雄性不育系與傳統的Ogura-A型雄性不育系有所不同，是一個新的不育材料，具有新的 不育型細胞質。
[0014] 該雄性不育細胞質的發現，既可以作為正常的雄性不育進行作物雜交育種，拓寬 了保持系的選擇范圍，又可利用它進一步揭示〇rf!38不育基因的作用機理，對蘿卜細胞質雄 性不育的深層次研究具有十分重要的意義。
[0015] (四）【附圖說明】 下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0016]圖1為本發明的選育技術路線圖； 圖2為對不育系和保持系各選取5株，用Ogura特異引物進行PCR分子標記，在1000bp處 出現一條一致的明亮條帶，標明兩者都含有〇rf!38基因的示意圖；注：1，2,3，，4,5SR64A， 6,7,8,9，l〇SHF17-5-1-l;]\C%marker ; 圖3為不育系R64A與保持系HF17-5-1-1測序結果比較示意圖； 圖4為R64A與日本測序的Ogura-Α型雄性不育材料線粒體DNA Blast比對結果示意圖。 [0017](五)【具體實施方式】 下面結合附圖和實施實例對本發明進行詳細的描述。
[0018] 首先選擇雄性不育材料和具有Ogura型雄性不育細胞質的純合可育材料，本發明 選用的雄性不育材料有5個，5個不育材料均來自國內地方品種，具有Ogura型雄性不育細胞 質的純合可育材料為山東地方品種棗莊大紅袍，棗莊大紅袍為紅皮白心蘿卜。
[0019] 先對純合可育材料進行純合性檢測，將純合可育材料進行自交，獲得F1代種子，取 300粒F1代種子，用35 °C的溫水浸泡3小時，然后放入紙基培養皿中，待種子萌動后，放入2-4 °(：的冰箱中進行春化處理25天(該過程稱為種子春化處理），通過春化處理后的種子播種于 隔離網室中，待開花后，對雜交后代的育性情況進行觀察統計。如果全部為可育株，說明該 材料是純合的，如果出現一定比例的不育株，該可育材料則為雜合體，不能用于對不育材料 的篩選。
[0020] 以檢測后的純合可育材料為父本，分別與雄性不育材料進行雜交，取每個雜交組 合的F1代種子各100粒，進行春化處理，將通過春化處理的種子播種于隔離網室中，待開花 后，對雜交后代的育性情況進行觀察統計。在5個不育材料的后代中，發現3號材料(R64A)后 代全部為不育，證明該可育材料能夠保持R64A的不育性，即為R64A的保持系，同時也說明該 雄性不育材料與Ogura A型雄性不育存在育性上的差別。
[0021] 對R64A和Ogura A型純合可育株進行細胞質類型的PCR分子標記與片段測序。用 Ogura 特異弓| 物：0RF-F 5 ' - T T C A A A T C C T G T C C C CG C A C C - 3 ' 和 0 RF - R 5 '-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對不育材料R64A及純合可育材料進行PCR分子標記，為防止 出現取樣錯誤，每份材料取5株，1、2、3、4、5為不育材料R64A，6、7、8、9、10為純合可育材料 HF17-5-1-l，PCR標記結果如圖2，10個樣本都在大約100(^?處出現了一條明亮、清晰的條 帶，說明兩者皆為Ogura細胞質類型。對圖2中的4、5、6、7四份樣品，通過對PCR瓊脂糖凝膠割 膠回收，進行分子測序。
[0023] 不育材料R64A和純合可育材料HF17-5-1-1在orfl38區段的第61和第99個堿基上 出現差異（圖3)，不育材料R64A在第61個堿基由A變為C(A-C)，第99個堿基由A變為G(A- G)〇
[0024] 進一步對不育材料R64A進行細胞質線粒體DNA序列測序、組裝。
[0025]將R64A種植于課題組試驗田，田間管理按常規方法進行，待植株發育至10片葉時， 取健康單株的頂部嫩葉l〇〇g。按5mL/g(鮮重)加入勻漿緩沖液，用預冷的高速組織搗碎器在 4°C下搗碎組織，四層紗布過濾，收集濾液。濾液經2000g離心15min后，取上清，17000g離心 lOmin，取沉淀，后兩步重復兩次，即為粗提線粒體和葉綠體。
[0026] 利用蔗糖襯墊法純化線粒體和葉綠體，將粗提線粒體和葉綠體懸液小心鋪在裝 有Shelf緩沖液的離心管中，經17000g，離心15min，棄上清，此法重復兩次，所得沉淀即為純 化的線粒體葉綠體。
[0027] 在純化后的線粒體和葉綠體沉淀中加入裂解緩沖液，混勻沉淀，再加入蛋白酶K 和10%的SDS溶液，37°C保溫2h以上。裂解液經等體積酚-氯仿-異戊醇、氯仿各抽提1次后， 12000g離心取上清，再加入乙酸鈉和等體積的預冷異丙醇，-20°C沉淀0.5h以上，12000g離 心lOmin，收集沉淀，70%乙醇洗滌1-2次，溶于適當體積的TE緩沖液中，于-20°C保存備用。 [0028] 測序采用11 lumina二代高通量測序，讀長90bp，測序得到400M的讀段數據。
[0029] 原始數據經去除測序重復，由Trimmomatic 3.0進行Clean處理后，用Fastqc對讀 段進行質控檢測、過濾。
[0030]對過濾的數據分別進行Kmer分析，確定適合組裝的mer值，并預測測序深度及目標 基因組的大小。基因組大小的估測方法根據Marai的方法。
[0031]用Velvet軟件對過濾后的各樣品數據進行組裝，選擇mer值為21，Insert Size為 320,標準誤sd為10,截止覆蓋度參數則根據預計覆蓋度進行設置。
[0032]根據組裝得到的Contigs序列設計引物，以提取的DNA樣品為模板進行PCR擴增，并 對擴增產物用Sanger法測序。
[0033] 根據Velvet組裝得到的每個樣品Contigs序列及擴增產物經Sanger測序后得到的 序列進行疊加，從而得到線粒體和葉綠體完整的全長基因組序列并用Mitofy軟件進行基因 注釋。
[0034] 將R64A線粒體DNA序列與日本公布的Ogura-Α型DNA序列（GeneBank AB694744.1) 進行Blast比較（見圖4)，R64A的DNA全長為258462個堿基，AB694744.1為258426個堿基。兩 者的一致性（Identities)為 258414/258471 (99%);插入與缺失（Gaps)為 54/258471。說明兩 者除在orfl38基因內的兩個堿基的差異外，在整個DNA序列中還存在其它的差異(見下表）， 在DNA水平和育性上兩者都有明顯差異的，R64A所具有的雄性不育細胞質是一個新的不育 類型。
[0035] R64A與Ogura-Α在線粒體DNA上的差異
【主權項】
1. 一種Ogura型蘿卜雄性不育細胞質，其特征在于:具有所述不育細胞質的雄性不育系 雄蕊退化徹底，不能形成具有正常功能的花粉，而雌蕊發育正常，低溫下花蕾不黃化，其育 性的保持與恢復與原Ogura型雄性不育系有差異；其保藏號為CCTCC P201520，保藏單位是 中國典型培養物保藏中心，地址湖北省武漢市武漢大學校內，保藏日期為20151120。2. 根據權利要求1所述的Ogura型蘿卜雄性不育細胞質的選育方法，其特征為，包括如下 步驟：（1)選擇檢測后的具有Ogura A型雄性不育細胞質的可育純合植株作為父本，以其他 非Ogura A型細胞質的雄性不育材料作母本，進行雜交篩選；（2)在雜交后代中表現為全部 不育的，即表示該不育材料與Ogura A型細胞質雄性不育存在育性的差別，經多代雜交驗證 之后，明確兩者確實存在育性保持與恢復上的差異；（3)將獲得的新型蘿卜細胞質雄性不育 材料進行〇rfl38基因的PCR分子標記與片段測序，比較兩者之間在orfl38基因上的序列差 異；（4)對新型不育系細胞質線粒體DNA進行測序、組裝；（5 )比較新的不育細胞質與Ogura A 型不育細胞質線粒體DNA序列的差異。3. 根據權利要求2所述的Ogura型蘿卜雄性不育細胞質的選育方法，其特征在于：步驟 (1)中，用Ogura特異引物：0RF-F 5'-TTCAAATCCTGTCCCCGCACC-3'和0RF-R 5'-GCCTTACACCATTGGGATACTTC-3 '，對新型蘿卜細胞質雄性不育材料及可育純合植株進行PCR分 子標記。
【文檔編號】A01H1/02GK105830906SQ201510934624
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年12月15日
【發明人】王效睦, 白靜, 段乃彬, 王俊峰, 謝坤
【申請人】山東省農作物種質資源中心