一種d1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及水稻鑒定領域，具體而言，涉及一種D1型水稻細胞質不育系及其雜交 組合的鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 70年代我國應用三系法培育雜交水稻獲得成功，并在生產上大面積推廣種植，實 現了我國水稻單產的第二次飛躍。1976-2005年，我國雜交水稻累計種植面積52. 5億畝，增 收稻谷約6. 5億噸，因此雜交水稻的發展是提高糧食產量、解決糧食安全問題的重要途徑 (袁隆平，2008)。三系雜交水稻利用的基礎是細胞質雄性不育，自從野敗型細胞質雄性不育 系被發現與大面積推廣應用以來，上世紀70年代到80年代中期，育種家培育出多達60多 種細胞質源來源于野敗型、云南滇型OianI和Dianll)、紅蓮型、岡型、K型和馬協型等，盡 管細胞質源和敗育特點有較大差異，可分為孢子體不育和配子體不育兩種類型（朱英國， 2000)。其中，云南滇型、包臺型和紅蓮型為配子體不育系，野敗型、D型、K型和岡型等為孢 子體敗育類型，大部分的配子體敗育恢保關系一致，而大部分孢子體敗育類型的恢保關系 一致，配子體敗育和孢子體敗育類型的恢保關系相反。
[0003] 在配子體細胞質雄性不育系中，已經克隆驗證了包臺型細胞質雄性不育基因 〇"79和紅蓮型細胞質雄性不育基因(^紐79，兩個不育基因為等位變異，有97%的序列同 源性（Wangetal.2006;Pengetal.2010)，滇型不育系也鑒定到orf79等位變異基因。對 于孢子體型細胞質雄性不育系，羅蕩平等用全線粒體基因組表達分析的方法鑒定出野敗型 不育基因WA352,該基因由3個線粒體基因組片段和一個來源不明片段組成，其他孢子體細 胞質不育類型，如印水型、矮敗型、岡型、爪哇型、馬協型、K型均含有不育基因WA352(Luoet al. 2013) 〇
[0004]目前，國際公認細胞質雄性不育類型主要為野敗、紅蓮、包臺三種類型，其中前面 兩種不育細胞質都來源于普通野生稻。20世紀70年代，國內外育種家還利用普通野生稻為 細胞質供體培育了其他13種細胞質類型，如崖城野生稻細胞質、田東野生稻細胞質等（朱 英國，2000)，因此，從野生稻中挖掘細胞質是培育新型細胞質雄性不育系的一個重要途徑。 東鄉野生稻為多年生野生稻，是迄今為止發現的世界上分布最北的野生稻，被國內外譽為 "野生植物大熊貓"（黃依南等，2012)。
[0005] 上世紀80年代，江西省農科院水稻所利用東鄉野生稻作為細胞質供體培育出雄 性不育系國際油粘A，但一直沒有找到對該新型不育系育性恢復良好的恢復源，因此，沒有 得到推廣和利用。近年來，江西省超級水稻研宄發展中心與宜春農科所合作，以東鄉野生稻 為細胞質供體培育了新型東野不育系D1A，新型東野不育系D1A的具體培育方法見申請號 為201410190251. 0所述；新型東野不育系D1A分別與培矮64和天豐B雜交得到新型東野 不育系DPA和DTA。D1A、DPA和DTA均為孢子體不育系，分子標記鑒定該類型不育系不含有 已克隆的孢子體不育基因WA352。無花粉敗育，敗育徹底，育性極易穩定，且保持譜廣，絕大 多數栽培品種可為其保持系，只在同質野生稻中找到恢復系，并實現同質野生稻恢復系恢 復基因的栽培稻轉育，最高恢復率達到85. 1%。因此，它的敗育特點、分子機理和恢保關系 與目前推廣的其他不育系完全不同，為一種新型孢子體不育類型，暫命名為D1型水稻細胞 質不育系。該不育系的研宄及應用推廣對于豐富雜交水稻類型，促進雜交水稻的可持續發 展具有重要價值。
[0006] 植物線粒體基因組由于線粒體基因組高頻率的基因重組導致植物線粒體基因組 序列差異很大，存在各自特異的序列，比較分析任何兩個物種的線粒體基因組的基因間區， 發現大部分基因間區都不是保守的，甚至是同源物種的比較（KuboandMikami, 2007)。 如，將小麥Ks3和Km3的線粒體基因組進行比較，只有85. 2 %的序列為保守序列，與 NCBI數據庫比較，7. 3 %Ks3序列為新序列，且大部分特異序列位于進化速率快的基因間 區（Liuetal.，2011);目前，水稻已完成了 7個線粒體基因組的測序，分別是水稻品種 Nipponbare、N、9311、CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、RT98C。其中，Nipponbare是一個典型的粳 稻品種，9311為典型的秈稻品種，WA-CMS和CW-CMS細胞質來源于中國普通野生稻（Oryza rufipogon)，LD-CMS細胞質來源于秈稻品種緬甸的Lead水稻。水稻線粒體基因組最大 的為CW(559, 045bp)，而LD只有 434, 745bp，通過比較水稻CW-CMS、LD-CMS、WA-CMS、N和 Nipponbare線粒體基因組獲得57個大小在102-5745bp的線粒體基因組特異序列，這些特 異序列占到水稻線粒體基因組14. 5%，通過比較分析獲得了 3個在所分析的14個不育系中 均能擴出條帶的分子標記，3個在所分析的7個配子體不育系均能擴出條帶的分子標記，9 個在所分析的7個孢子體不育系均能擴出條帶的分子標記，沒有鑒定到單個不育系所特異 的分子標記（xieetal.，2014)。
[0007] D1型水稻細胞質不育系為一種以東鄉野生稻為細胞質來源的孢子體不育系，與推 廣應用的其他孢子體不育系類型完全不一樣，目前，還沒有開發出相應的特異分子標記能 夠快速鑒定該不育類型。
[0008] 有鑒于此，特提出本發明。

【發明內容】

[0009] 本發明的第一目的在于提供一種D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的鑒定方 法，能快速、準確、高效、靈敏地檢測出D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合；并且該鑒定 方法操作簡便、穩定可靠。
[0010] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0011] 一種D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的鑒定方法，以堿基序列SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示中的任一種或多種設計引物進行基因擴增鑒定。
[0012] 本發明提供的D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的鑒定方法，是以水稻線粒 體基因組遺傳變異為基礎，先將D1型水稻細胞質不育系的線粒體提取并測序，然后與其他 水稻品種進行基因組學分析，篩選出3個特異性強的東野型不育系D1A線粒體特異序列，即 為序列表中的SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示的序列；以該序列設計引物， 然后通過分子檢測手段，來鑒定是否為D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合特異的標記。 該鑒定方法能快速、準確、高效、靈敏地檢測出D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合；并且 該鑒定方法操作簡便、穩定可靠。
[0013] 進一步地，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一種或多種；
[0014] 其中，所述引物DM-1為：
【主權項】
1. 一種D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的鑒定方法，其特征在于，W堿基序列 SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3所示中的任一種或多種設計引物進行基因擴增 鑒定。
2. 根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任一種或多種； 其中，所述引物DM-1為： F ;5' -GGAGTTGCTGTAGGGTCG-3' R;5' -CAAGTTGGCTTTGCTGAT-3'; 所述引物DM-2為： F ;5' -CTCGCTTTAGTAGTGGTG-3' R;5' -CTTCGCTAGTGTAGGTGC-3'; 所述引物DM-3為： F ;5' -ACTTCTACGGCCTTACGA-3' R ;5' -GTGGACCTGGGATGACTA-3'。
3. 根據權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任一種。
4. 根據權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2、引 物DM-3中的任兩種。
5. 根據權利要求2所述的鑒定方法，其特征在于，所述引物為引物DM-1、引物DM-2和 引物DM-3。
6. 根據權利要求2-5任一項所述的鑒定方法，其特征在于，所述基因擴增的模板為所 述D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的總基因組。
7. 根據權利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，所述總基因組采用CTAB法提取。
8. 根據權利要求6所述的鑒定方法，其特征在于，所述總基因組的提取材料為D1型水 稻細胞質不育系及其雜交組合生長至兩葉一屯、的幼苗。
9. 根據權利要求8所述的鑒定方法，其特征在于，基因擴增時所用的體系中，所述總基 因組的終濃度為8-15ng/ y 1。
10. 權利要求2所述的引物DM-1、引物DM-2、引物DM-3中的任一種或多種在D1型水稻 細胞質不育系及其雜交組合種子純度鑒定的應用。
【專利摘要】本發明涉及水稻鑒定領域，特別涉及一種D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合的鑒定方法，以堿基序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示中的任一種或多種設計引物進行基因擴增鑒定。該鑒定方法是以水稻線粒體基因組遺傳變異為基礎，先將D1型水稻細胞質不育系的線粒體提取并測序，然后與其他水稻品種進行基因組學分析，篩選出3個特異性強的東野型不育系D1A線粒體特異序列；以該序列設計引物，然后通過分子檢測手段，來鑒定是否為D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合特異的標記。該鑒定方法能快速、準確、高效、靈敏地檢測出D1型水稻細胞質不育系及其雜交組合；并且該鑒定方法操作簡便、穩定可靠。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104531886
【申請號】CN201510018679
【發明人】謝紅衛, 蔡耀輝, 蔡怡聰, 李永輝, 錢明娟, 毛凌華, 顏龍安
【申請人】江西省超級水稻研究發展中心
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月14日