用于輔助Rf基因選擇的分子標記及特異性引物和應用
【專利摘要】本發明涉及分子標記領域，具體涉及用于輔助Rf基因選擇的分子標記及特異性引物和應用。所述分子標記與Rf基因遺傳距離為0.7cM與該基因緊密連鎖，其特異性上下游引物為：MI16的上游引物序列為：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC，MI16的下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。M16標記能夠很快鑒別出甜椒中的Rf基因，更好的補充了甜椒在雄性不育方向的研究。
【專利說明】
用于輔助Rf基因選擇的分子標巧及特異性引物和應用
技術領域
[0001] 本發明設及分子標記領域，具體設及用于輔助Rf基因選擇的分子標記及特異性引 物和應用。
【背景技術】
[0002] 利用細胞質雄性不育（CMS,切toplasmic male sterility)^系配套雜交制種是 省去辣椒制種人工去雄成本的有效方法。由于辣椒生產W果實為收獲對象，若父本雄性不 育恢復系其育性恢復力不強，則會導致果實種子量不足，從而嚴重影響雜交Fi代商品辣椒 果實的外觀和產量。因此細胞質雄性不育強恢復性優良父本(恢復系）的選育是辣椒CMS利 用中關鍵問題之一。
[0003] 辣椒雄性不育恢復性主要受位于辣椒6號染色體上的主效基因 Rf (Fertility restorer)控制，但是辣椒中Rf分布不夠廣泛，在無辣味的辣椒(甜椒）中更不多見，而且傳 統的辣椒CMS恢復系轉育過程中需要測交評價，轉育周期長，限制了辣椒CMS的應用。辣椒強 恢復系的選育和與Rf緊密連鎖分子標記的開發和應用，是解決辣椒CMS育種應用瓶頸的有 效方法。
[0004] 辣椒中已報道了多個與Rf緊密連鎖的不同類型的分子標記，發現與辣椒Rf遺傳距 離更近的共顯性分子標記，對更好利用辣椒CMS進行育種具有重要意義。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種與辣椒Rf基因緊密連鎖的分子標記。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種利用分子標記鑒定辣椒的育性的方法，W提高辣椒 的育種進程和育種效果。
[0007] 根據本發明的可用于輔助Rf基因選擇的分子標記通過W下步驟獲得：
[000引 W辣椒可育親本0601M和不育親本77013A及其構建的：B巧F2群體為試驗材料，研 究輔助辣椒恢復基因的分子標記。利用辣椒基因組重測序結果比對到辣椒CM334基因組信 息6號染色體上化ttp: //passpo;rt. pepper. snu. ac. k;r/?t = PGEN0ME/);獲取已發表的有關 Rf基因標記之間的DM序列并利用其開發標記，共開發233對SSR引物和76對Indel引物，經 過初篩，其中8對在雙親及群體中表現多態性。通過與BC5F2群體育性表型對應，將目標基因 定位在Indel標記MI16旁，遺傳距離為0.7cM。利用此分子標記在新群體中進行辣椒育性的 鑒定，可W有效地用來輔助育種工作。
[0009] MI16上游引物序列為：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCCdMI16的下游引物序列為： GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT
[0010] 隨著分子生物學的發展，分子輔助育種技術在辣椒的品種選育和育性的鑒定中得 到越來越廣泛的應用。利用MI16引物可W在辣椒的苗期通過分子的手段確定辣椒的育性， 為辣椒的育種節約了人力物力。0601M屬于甜椒品系，M16標記能夠很快鑒別出甜椒中的Rf 基因，更好的補充了甜椒在雄性不育方向的研究。通過利用本發明提供的特異性引物采用 PCR和凝膠電泳技術檢測待測辣椒基因組DM:擴增Inde 1標記MI 16，在辣椒不育親本中克隆 得到約13化P的片段，可育親本中得到l(K)bp的片段。由于片段長度較短并且差異較大，通過 凝膠電泳技術能夠很快分辨辣椒植株的育性。MI16引物與Rf基因遺傳距離為0.7cM與該基 因緊密連鎖，能較準確判斷辣椒育性。本發明提供了分子標記在辣椒分子標記輔助育種中 的應用。
【附圖說明】
[00川圖1顯示MI16標記在親本和F1中擴增結果。
[0012] 圖2顯示MI16標記在BC5F2群體部分單株擴增結果。注:M:5化P marke;r;a:與不育 親本77013條帶相同;b:與可育親本0601M條帶相同;h:為雜合樣品與F1相同。
[001引圖3顯示MI16標記與Rf基因連鎖關系。
【具體實施方式】
[0014] W下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明 的范圍。
[001引實施例1
[0016] W辣椒不育親本77013A和可育親本0601M及其F1同77013回交多次構建的BCsF2群 體（（77013AX0601M)X77013)為試驗材料。
[0017] 辣椒Rf基因遺傳群體構建
[001引 W辣椒不育親本77013A(Capsicum annuum L.)及辣椒恢復系材料0601M (Capsicum annmim L.)為雙親，雜交后獲得F1，F1與77013回交多次獲得的BC日F2群體 ((77013AX0601M)X77013)為作圖群體，共741個單株。
[0019] 1、基因組DNA的提取
[0020] 用CTAB法提取BC5F2所有單株、親本及F1的基因組DNA，用Biospec-nano微量分光 光度計測定濃度和質量，將濃度稀釋至l(K)ngAU。
[0021] 2、Inde 1 標記開發
[0022] 利用已知辣椒的標記對應的比對到辣椒CM334和Zunla基因組信息6號染色體上 (http ://passport . pepper . snu . ac . kr/?t = PGEN0ME/；// peppersequence. genomics. cn/page/species/index. jsp)，獲取兩標記之間的DNA序列并 利用其開發標記，設計Indel引物，W親本DNA為模板，對Indel引物進行多態性篩選，共篩選 至化對具有多態性的標記，再W篩選到的多態性的標記對BCsF2群體進行分析，運8對引物均 與Rf基因連鎖。其中Inde 1標記MI16是與辣椒Rf基因連鎖最緊密的分子標記。
[0023] PCR擴增體系（10化）：DNA(100ng/化)0.扣L，10xGreenMix扣L，上游引物（10i^M/ 化)0.化L，下游引物（1 OiiM/iiL) 0.5化，d地20 3.5化。
[0024] PCR擴增程序:94°C預變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，共34個 循環；72°C延伸8min;16°C保存。
[0025] Indel產物檢測采用聚丙締酷胺凝膠電泳檢測。
【主權項】
1. 用于輔助Rf基因選擇的分子標記，其特征在于，所述分子標記與Rf基因遺傳距離為 0.7cM與該基因緊密連鎖，其特異性上下游引物為： MI 16 的上游引物序列為：CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC， MI 16 的下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。2. 用于檢測辣椒育性的特異性引物，其特征在于， 上游引物序列為:CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC， 下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。3. 檢測辣椒育性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下特異性引物進行擴增的 步驟， 上游引物序列為:CCTCGAATATAAACTTATGGTGTCC， 下游引物序列為:GCTTGGCAACCTATTCTTAGAAGTT。
【文檔編號】C12N15/11GK106048012SQ201610394487
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】張正海, 王立浩, 張寶璽, 曹亞從, 朱硯姝
【申請人】中國農業科學院蔬菜花卉研究所