烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法
【專利摘要】本發明公開了一種烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟：他莫昔芬喂養料的配備、投喂他莫昔芬喂養料、熱休克處理、雌激素抑制劑溶液的配制、用雌激素抑制劑溶液均勻噴霧等。通過此方法，可獲得100%的烏龜雄性四倍體純系，不僅有效地育成烏龜的四倍體，而且提高了四倍體的育成率與出苗率；為生產三倍體不育烏龜奠定了堅實的基礎。
【專利說明】
烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及烏龜的多倍體繁育方法，具體涉及一種烏龜雄性四倍體純系高效育成 的方法。
【背景技術】
[0002] 烏龜隸屬爬行綱、龜鱉目、龜科，是現存古老的爬行動物，常見的為二倍體，身上長 有非常堅固的甲殼，雌龜生長速度為一領齡龜體重在15克左右，二齡龜50克，三齡龜100克， 四齡龜200克，無齡龜250克，雄龜生長慢，性成熟最大個體一般為250克以下。因三倍體的不 育特征，使烏龜在生長速度、抗病性、肉質等方面表現出更為顯著的優勢。現有技術中，要獲 得三倍體不育烏龜，最快捷有效的方式是通過四倍體烏龜與二倍體烏龜倍間雜交獲得，那 么就需要建立遺傳穩定、純度極高的四倍體烏龜體系。但在烏龜的遺傳育種中，目前為止還 未見烏龜雄性四倍體高效育成的報道。

【發明內容】

[0003] 針對上述現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種方法穩定、種群純度高 達1 〇〇%的烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法。
[0004] 為達到上述目的，本發明的技術方案如下： 烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規飼養 飼料中，制成喂養料，其中他莫昔芬含量為10~16g/500g喂養料，待用； (2) 投喂:在母龜產蛋前5~10天，按常規飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養 料，每天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂20~30g，下午6:00每100g烏龜投喂10~15g，直至 產蛋； (3 )熱休克處理:把步驟(2 )的受精蛋放入溫度為27~34 °C、濕度為50~90%的恒溫孵化 器中，在一次卵裂前2~3min，把溫度快速升至39~42°C，保持3~5min;然后溫度降至29~ 33。。； (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180~250mg/l，睪 酮的濃度為100~150mg/l; (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)處理后的受精蛋 進行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為10~20ml，保持孵化器的溫度29~33°C、濕度50~ 90%，進行孵化;從而獲得100%烏龜雄性四倍體純系。
[0005] 本發明的優點：1、本發明中對母本進行添加他莫昔芬飼料投喂，起到抑制DNA分裂 和促雄性的雙重作用的同時，將受精蛋第一次卵裂的時間推遲了 3~5min，并提高所有受精 蛋第一次卵裂的同步程度(可達99%)，為操作下一步提供時間保障和奠定染色體加倍基礎； 2、采用熱休克短時間處理受精蛋，不僅有效減少對受精卵的不良影響，提高受精卵的成活 率;而且進一步加強了四倍體的形成機率;3、雌激素抑制劑溶液噴灑，再一次強化與保證其 雄性的轉化率。因而通過此方法，可獲得100%的烏龜雄性四倍體純系。此方法，不僅有效地 育成烏龜的四倍體，而且提高了四倍體的育成率與出苗率;為生產三倍體不育烏龜奠定了 堅實的基礎。
【具體實施方式】
[0006] 現結合具體實施例，對本發明作進一步描述。
[0007] 實施例一 烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規飼養 飼料中，制成喂養料，其中他莫昔芬含量為16g/500g喂養料，待用； (2) 投喂:在母龜產蛋前5天，按常規飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養料，每 天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂30g喂養料，下午6:00每100g烏龜投喂15g喂養料，直至產 蛋； (3) 熱休克處理:把步驟(2)的受精蛋放入溫度為27°C、濕度為80%的恒溫孵化器中，在 一次卵裂前3min，把溫度快速升至39°C，保持5min;然后溫度降至29°C ; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180mg/l，睪酮的濃度為 100mg/l； (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)中的受精蛋進行 均勻噴霧，用量每100只受精蛋為15ml，保持孵化器的溫度29°C、濕度80%，進行孵化;從而獲 得1 〇〇%烏龜雄性四倍體純系。
[0008] 實施例二 烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規飼養 飼料中，制成喂養料，其中他莫昔芬含量為16g/500g喂養料，待用； (2) 投喂:在母龜產蛋前10天，按常規飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養料， 每天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂25g，下午6:00每100g烏龜投喂15g，直至產蛋； (3) 熱休克處理:把步驟(2)的受精蛋放入溫度為34°C、濕度為70%的恒溫孵化器中，在 一次卵裂前2min，把溫度快速升至40°C，保持3min，然后溫度降至33°C ; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為230mg/l，睪酮的濃度為 140mg/l； (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)中的受精蛋進行 均勻噴霧，用量每100只受精蛋為20ml，保持孵化器的溫度33°C、濕度70%，進行孵化;從而獲 得1 〇〇%烏龜雄性四倍體純系。
[0009] 上述兩個實施例僅為本發明的優選方案之二，并不能限制本發明的保護范圍，任 意與本發明等同或相似的技術手段視為本發明的保護范圍。以下附上本發明部分處理方式 及結果統計。
[0010]附:烏龜雄性四倍體育成結果統計
注：上述結果是母龜產蛋前10天投喂他莫昔芬喂養料，一次卵裂前2min熱休克保持 3min所取得的結果。
【主權項】
1.烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規飼養 飼料中，制成喂養料，其中他莫昔芬含量為10~16g/500g喂養料，待用； (2) 投喂：在母龜產蛋前5~10天，按常規飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養 料，每天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂20~30g，下午6:00每100g烏龜投喂10~15g，直至 產蛋； (3) 熱休克處理:把步驟(2)的受精蛋放入溫度為27~34°C、濕度為50~90%的恒溫孵化 器中，在一次卵裂前2~3min，把溫度快速升至39~42°C，保持3~5min;然后溫度降至29~ 33。。； (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180~250mg/l，睪 酮的濃度為100~150mg/l; (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)處理后的受精蛋 進行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為10~20ml，保持孵化器的溫度29~33°C、濕度50~ 90%，進行孵化;從而獲得100%烏龜雄性四倍體純系。
【文檔編號】A01K67/027GK106035234SQ201610499224
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發明人】楊品紅, 韓慶, 黃春紅
【申請人】湖南文理學院