麻風樹屬植物的直接和間接器官發生的制作方法
【專利說明】麻風樹屬植物的直接和間接器官發生
[0001] 交叉引用相關申請
[0002] 本申請涉及提交于2012年11月16日的美國臨時專利申請序列號61/727, 319,并 要求其優先權。此申請在此以其整體并入本文。
【背景技術】
[0003] 本發明大體上與植物生物技術相關。更具體來說，本發明涉及用于麻風樹屬植物， 如麻風樹（Jatropha curcas)的高效的直接器官發生和間接器官發生的方法和培養基組 成。
[0004] 文中用于說明本發明的背景或者提供關于實踐的額外細節的出版物和其他材料 以引用方式并入，并且為方便起見，分別分組于參考書目中。
[0005] 麻瘋樹屬于大戟科。麻風樹屬是一個包括超過170個物種的大屬。植物麻風樹近 來作為熱帶能源植物引起特別關注。將種子粉碎，可以加工得到的油以產生可在一個標準 的柴油汽車使用的高品質的生物柴油。該植物每公頃的燃料產量可能是大豆的四倍多，玉 米的十倍多。一公頃麻風樹屬植物據稱生產1892升的燃料（//en.wikipedia.org/ wiki/Jatropha_oil)。麻風樹主要通過種子繁殖，通過種子培育的植株中觀察到種子產量 和油含量變化顯著（Kumar&Reddy 2010，Pant et al.，2006;Jha et al.，2007)。因此，通 過種子的常規繁殖是不可靠的，以及通過枝插（stem cutting)無性繁殖不足以滿足需求 (Heller, 1996 ;0penshaw，2000) 〇
[0006] 體外再生技術提供了用于種質資源保存、純系植物質量增加和遺傳轉化的強 大的工具。過去二十年，為用不同的培養基組成開發麻風樹的高效再生付出了相當 大的努力。這些報道包括下胚軸器官發生（He et al.，2009;Sharma et al.，2011;Sahoo et al·，2011)、上胚軸器官發生（Wei et al·，2004)、葉柄器官發生（Kumar and Reddy, 2010a, b, Dubey et al.，2010, Kumar et al·，2011a)、莖器官發生（Singh et al.，2010)、葉外植體器官發生（Sujatha and Mukta, 1996 ;Sujatha et al.，2005 ;Deore and Johnson, 2007 ;Kumar et al·，2010a, b;Kumar et al·，2011a)、莖尖和結外植體器官 發生（1^」〇代&1^1:四（2005);3代611；[￥383(31131'，2007;031^3 6七31 2007)、子葉盤器官發生 (Li et al.，2008)和體細胞胚胎發生（Jha et al. 2007)。以往的研宄開發的系統缺乏效 率和可重復性以及需要大量外植體作為起始材料。
[0007] 想要開發從麻風樹的外植體薄切片開始的高效再生系統。

【發明內容】

[0008] 本發明大體上與植物生物技術相關。更具體來說，本發明涉及用于麻風樹屬植物， 如麻風樹（Jatropha curcas)的高效的直接器官發生和間接器官發生的方法和培養基組 成。
[0009] 因此，本發明提供了通過從麻風樹屬植物，如麻風樹，獲得的外植體器官發生生產 植物的方法。根據本發明，外植體從健康的植物獲得。在一個實施方式中，所述健康的植物 扦插繁殖并保持在溫室中。在另一個實施方式中，所述健康的植物從田間獲得。根據本發 明，外植體從從葉柄、花梗花序梗和花序軸外植體的薄切片獲得。
[0010] 一方面，該方法是麻風樹屬植物的直接器官發生的方法。按照該方面，該方法包 括：(a)將本文描述的外植體的薄切片在固體枝芽（shoot bud)誘導培養基上培養以誘導 枝芽的形成，（b)將枝芽在固體枝芽增殖發育培養基上培養以使枝芽增殖和發育，（C)將從 發育的枝芽衍生而來的枝芽叢在固體芽伸長培養基上培養，以使芽（shoot)伸長，（d)將從 枝芽叢分離出的伸長的芽在固體芽成熟培養基上培養，以使芽成熟，（e)將成熟的芽浸入液 體生長調節劑溶液，將浸過的芽轉移到土里以使麻風樹屬植物生長。
[0011] 在第二方面的實施方式中，該方法是麻風樹屬植物的間接器官發生的方法。按照 該方面，該方法包括：(a)將本文描述的外植體的薄切片在固體愈傷組織誘導培養基上培 養以誘導器官發生性愈傷組織形成，（b)將器官發生性愈傷組織在固體枝芽誘導培養基上 培養以誘導枝芽的形成，（c)將枝芽在固體枝芽增殖發育培養基上培養以使枝芽增殖和發 育，（d)將從發育的枝芽衍生而來的枝芽叢在固體芽伸長培養基上培養，以使芽伸長，（e) 將從枝芽叢分離出的伸長的芽在固體芽成熟培養基上培養，以使芽成熟，（f)將成熟的芽浸 入液體生長調節劑溶液，將浸過的芽轉移到土里以使麻風樹屬植物生長。
[0012] 在一個實施方式中，固體枝芽誘導培養基包含MS基本鹽（Murashige and Skoog，1962)、B5維生素 （Gamborg et al.，1968)、植物激素、硫代硫酸銀（STS)以及酪蛋白 水解物。在一個實施方式中，植物激素是生長素和細胞分裂素的混合物。在另一個實施方 式中，生長素是吲哚-3-丁酸（IBA)。在進一步的實施方式中，細胞分裂素是噻苯隆（TDZ) 和6-芐基氨基嘌呤（BA)。在一個實施方式中，培養基含有碳源，如蔗糖和固化劑，如瓊脂。 在另一個實施方式中，培養在光/暗周期完成。
[0013] 在一個實施方式中，固體枝芽增殖和發育培養基包含MS基礎鹽、B5維生素、植物 激素、硫酸腺嘌呤（AdSO4)和酪蛋白水解物。在一個實施方式中，植物激素是生長素和細胞 分裂素的混合物。在另一個實施方式中，生長素是吲哚-3-丁酸（IBA)。在進一步的實施方 式中，細胞分裂素是TDZ、BA和玉米素（Zn)。在一個實施方式中，培養基含有碳源，如蔗糖 和固化劑，如瓊脂。在另一個實施方式中，培養在光/暗周期完成。
[0014] 在一個實施方式中，固體芽伸長培養基包含MS基礎鹽、B5維生素、植物激素、硫酸 腺嘌呤（AdSO4)和酪蛋白水解物。在一個實施方式中，植物激素是赤霉酸（GA3)和細胞分裂 素的混合物。在另一個實施方式中，細胞分裂素是BA和激動素（Kn)。在一個實施方式中， 培養基含有碳源，如蔗糖和固化劑，如瓊脂。在另一個實施方式中，培養在光/暗周期完成。
[0015] 在一個實施方式中，液體生長調節劑溶液包含MS基礎鹽、B5維生素和生長素激 素。在一個實施方式中，生長素是IBA。在另一個實施方式中，麻風樹屬植物的生長在光/ 暗周期完成。
[0016] 在一個實施方式中，固體愈傷組織誘導培養基包括MS基礎鹽、B5維生素、植物激 素和脯氨酸。在一個實施方式中，植物激素是生長素和細胞分裂素的混合物。在另一個實 施方式中，生長素是2, 4-二氯苯氧基乙酸（2, 4-D)和IBA。在進一步的實施方式中，細胞分 裂素是TDZ和BA。在一個實施方式中，培養基含有碳源，如蔗糖和固化劑，如瓊脂。在另一 個實施方式中，培養在光/暗周期完成。
【附圖說明】
[0017] 圖Ia顯示從麻瘋樹的葉柄、花梗和花序軸組織衍生而來的外植體來源圖解說明。
[0018] 圖Ib顯示從麻瘋樹的花序梗組織衍生而來的外植體來源圖解說明。
[0019] 圖2a-f顯示從外植體（葉柄、花梗、花序梗和花序軸）的薄切片直接器官發生的 代表性階段。圖2a :接種到芽誘導培養基上的外植體，顯示2周后芽的最初形成。圖2b :4 周后顯示發育良好的枝芽的培養物。圖2c:從枝芽形成微芽。圖2d:芽的伸長。圖2e:芽 的成熟。圖2f :伸長的芽的離體生根。
[0020] 圖3a-f顯示從外植體（葉柄、花梗、花序梗和花序軸）的薄切片間接器官發生的 代表性階段。圖3a :外植體，如葉柄外植體，接種到愈傷組織誘導培養基，一個星期內顯示 膨脹。圖3b :2周后在芽誘導培養基里形成致密的愈傷組織。圖3c :4周后枝芽誘導。圖 3d:從枝芽發育出微芽。圖3e:芽的成熟。圖3f:芽的離體生根。
[0021] 發明詳述
[0022] 本發明大體上與植物生物技術相關。更具體來說，本發明涉及用于麻風樹屬植物， 如麻風樹（Jatropha curcas)的高效的直接器官發生和間接器官發生的方法和培養基組 成。
[0023] 因此，本發明提供了通過從麻風樹屬植物，如麻風樹，獲得的外植體器官發生生產 植物的方法。根據本發明，外植體從健康的植物獲得。在一個實施方式中，健康的植物扦插 繁殖并保持在溫室中。在另一個實施方式中，健康的植物從田間獲得。根據本發明，外植體 從葉柄、花梗、花序梗和花序軸外植體的薄切片獲得（圖Ia和圖lb)。在一個實施方式中， 所述外植體是來自第2到第4葉的葉柄。在另一個實施方式中，外植體是來自開花前的花 序的花梗、花序梗、和花序軸。在一個實施方式中，外植體的切片被水平地切成約〇. 5mm至 約1.0 mm厚的薄切片，優選小于約1.0 mm厚。在進一步的實施方式中，外植體在流動的自來 水中洗絳約3min至約7min，優選約5min。外植體隨后在氯已定外科洗液（100ml蒸餾水中 2滴）洗約8min至12min，優選約lOmin，以去除粘附表面的顆粒。然后將外植體用0. 1% 氯化采表面滅菌約8min至約12min，優選約lOmin，接著用無菌蒸餾水洗絳數次，如三次。
[0024] 一方面，該方法是麻風樹屬植物的直接器官發生的方法。按照該方面，該方法包 括：(a)將本文描述的外植體的薄切片在固體枝芽誘導培養基上培養以誘導枝芽的形成， (b)將枝芽在固體枝芽增殖發育培養基上培養以使枝芽增殖和發育，（c)將從發育的枝芽 衍生而來的枝芽叢在固體芽伸長培養基上培養，以使芽伸長，（d)將從枝芽叢分離出的伸長 的芽在固體芽成熟培養基上培養，以使芽成熟，（e)將成熟的芽浸入液體生長調節劑溶液， 將浸過的芽轉移到土里以使麻風樹屬植物生長。
[0025] 在第二方面的實施方式中，該方法是麻風樹屬植物的間接器官生成的方法。按 照該方面，該方法包括：(a)將在此描述的外植體的薄切片在固體愈傷組織誘導培養基上 培養以誘導器官發生性愈傷組織形成，（b)將器官發生性愈傷組織在固體枝芽誘導培養基 上培養以誘導枝芽的形成，（c)將枝芽在固體芽增殖發育培養基上培養以使芽增殖和發育 ⑷將從發育的枝芽衍生而來的枝芽叢在固體芽伸長培養基上培養，以使芽伸長，（e)將從 枝芽叢分離出的伸長的芽在固體芽成熟培養基上培養，以使芽成熟，（f)將成熟的芽浸入液 體生長調節劑溶液，將浸過的芽轉移到土里以使麻風樹屬植物生長。
[0026] 在一個實施方式中，固體枝芽誘導培養基含有MS基本鹽（Murashige and Skoog，1962)、B5維生素 （Gamborg et al.，1968)、植物激素、硫代硫酸銀（STS)以及酪蛋白 水解物。在一個實施方式中，植物激素是生長素和細胞分裂素的混合物。在另一個實施方 式中，生長素是吲哚-3-丁酸（IBA)。在進一步的實施方式中，細胞分裂素是噻苯隆（TDZ) 和6-芐基氨基嘌呤（BA)。在一個實施方式中，培養基含有約0. 05 μ M至約4. 90 μ M，優選約 0. 25 μ M至約3. 67 μ Μ，更優選約0. 98 μ ΜΙΒΑ。在另一個實施方式中，培養基含有約0. 05 μ M 至約2. 27 μ Μ，優選約0. 09 μ M至約1. 82 μ Μ，更優選約0. 45 μ M TDZ。在進一步的實施方式 中，培養基含有約〇. 02 μ M至約4. 44 μ Μ，優選約0. 04 μ M至約3. 33 μ Μ，更優選約0. 22 μ M BA。在一個實施方式中，培養基含有約0. 10 μΜ至約20. ΟμΜ，優選約1.0 μΜ至約10 μΜ， 更優選約4. ΟμΜ STS。在另一個實施方式中，培養基含有約5mg/l至約200mg/l，優選約 10mg/l至約150mg/l，更優選約100mg/l酪蛋白水解物。在一個實施方式中，培養基含有碳 源，如蔗糖和固化劑，如瓊脂。在此培養基中可以使用本領域技術人員所熟知的任何合適 的碳源和合適的固化劑。在一個實施方式中，蔗糖為約〇. 5%至約10%，優選為約1%至約 6%，更優選約3%。在另一個實施方式中，瓊脂為約0. 5%至約1. 0%，優選為約0. 6%至約 0.9%，更優選約0.8%。在另外的實施方式中，培養是在光/暗周期完成。在進一步的實施 方式中，光周期為16小時光照/8小時黑暗，光強150 UEnT2s'培養溫度25±2°C。
[0027] 在一個實施方式中，固體枝芽增殖和發育培養基包括M