專利名稱：麻風樹基因的功能分析的制作方法
麻風樹基因的功能分析相關申請的交叉引用本發明要求于2009年1月9日提交的美國臨時專利申請第61/143，484號的優先權，該臨時專利申請通過引用并入本文。
背景技術：
本發明涉及基因組規模的麻風樹屬(Jatropha)基因功能分析領域。更具體地，本發明涉及一種利用病毒誘導性基因沉默來進行基因組規模的麻風樹(Jatropha curcas)基因高通量功能分析的方法。本文中用于說明本發明背景或提供有關實施的補充細節的出版物和其他材料并入本文作為參考，并且為了方便起見分別在文獻目錄中分組。世界面臨著化石燃料供給日益減少和溫室作用不斷惡化的問題。亟需增加可再生能源的產生和消耗。對于許多國家尋找替代能源來說，生物燃料已經公認為國家的優先項目以滿足它們的能源安全需要，同時有助于減少造成溫室作用的(X)2排放。對生物燃料的需要導致食物生產的壓力增加。例如，為了滿足德國政府要求的德國2017年的生物燃料需求，該國的全部農用土地都將用于生長生物能作物，而沒有留下土地用于食物生產。為了減輕對土地的這種競爭并滿足我們對可再生燃料的需要，亟需利用邊緣土地來進行生物能產生。麻風樹是屬于大戟科的小木本植物。麻風樹的數種獨特性質使其成為用于生物柴油生產的理想植物。這些性質包括其迅速生長、容易繁殖、種子的低成本、高含油量、短孕育期、廣泛的適應性、干旱耐受性和在退化土壤上茁壯成長的能力。此外，其植株大小使種子的收集非常方便(Jones, 1991 ；Sujatha et al. ,2008) 但是，麻風樹具有幾個缺點，這限制了它的廣泛應用。植物的產量受到不利的雄花與雌花比的限制，并且其含油量沒有通過育種進行優化。該植物對生物應激如病毒 (Narayanna et al.，2007)、真菌和細菌病原體，和非生物應激特別是寒冷和干旱也是敏感的(http colon www dot jatropha dot org)。在植物的種子和葉子中存在數種毒性組分 (例如蛋白毒素、麻風樹毒蛋白和致癌劑佛波酯)給麻風樹產業的農民和生物加工工人帶來健康危害。改善麻風樹的農藝和質量性狀的一種重要方法是通過遺傳修飾。可以產生表達同源或異源基因序列的轉基因麻風樹屬植物。在許多情況下，期望一個或多個確定功能的同源基因的過量表達或通過RNAi沉默。麻風樹屬的基因序列可以通過cDNA和基因組文庫獲得，基因的功能可以通過與其他已知功能的植物基因的序列同源性來初步確定。然而，這種確定充其量只是暫時和初步的。功能確定常常由于成員序列高度相關的基因家族的存在而混淆。基因功能可以通過轉基因植物中候選基因的過量表達或RNAi介導的沉默來更準確地確定；然而，這樣的方法費力費時并且不適用于基因組規模的高通量分析。因此，期望開發基因組規模的麻風樹基因高通量功能分析的方法。發明概述本發明涉及基因組規模的麻風樹屬基因功能分析領域。更具體地，本發明涉及一種利用病毒誘導性基因沉默來進行基因組規模的麻風樹基因高通量功能分析的方法。本發明涉及利用病毒誘導性基因沉默(VKS)可靠而迅速，并且以高通量的方式來評價麻風樹中的基因功能。在一方面，本發明提供了用于麻風樹(J.curcas)中的VIGS 的有效且可重復的系統和方法。在一實施方案中，本發明提供了 DCL4的共沉默以提高VIGS 效率。在另一實施方案中，本發明提供了整個煙草脆裂病毒(TRV)病毒基因組的進一步再合成。在另一實施方案中，本發明證實這些載體具有與原始載體相似的效率。在另一實施方案中，本發明提供了 TRV VIGS系統在克隆和功能性鑒定幾種重要的脂肪酸生物發生途徑基因中的用途。這些重要的基因可以用于改善生物柴油的燃料特性，如低溫流動特性、氧化穩定性和NOx排放。因此在第一方面，本發明提供了一種麻風樹屬中的病毒誘導性基因沉默(VIGS) 的方法。根據本發明，所述方法包括(a)將包含待沉默的第一期望基因的序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的載體以產生修飾的TRV RNA2載體；(b)制備土壤桿菌(Agrobacterium)的混合培養物，所述混合培養物包含土壤桿菌，其含有包含TRV RNAl序列的載體；以及土壤桿菌，其含有所述修飾的TRV RNA2載體；(c)將所述土壤桿菌的混合培養物通過真空滲入引入麻風樹屬的植物組織以產生感染的植物；以及(d)使所述感染的植物生長足夠的時間以誘導所述期望基因的基因沉默。在一實施方案中，包含TRV RNA2的載體和包含TRV RNAl的載體為合成植物載體。在另一實施方案中，第一期望基因的序列為所述基因的有義鏈的序列。在另一實施方案中，第一期望基因的序列為所述基因的反義鏈的序列。在另一實施方案中， 核酸還包含待沉默的第二期望基因的序列。在一實施方案中，第二期望基因為抗病毒 (virus resistance)基因。在另一實施方案中，抗病毒基因選自核糖核酸酶III切酶樣(RNase III Dicer-like) 4 (DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶樣2 (DCL2)基因、核糖核酸酶 III 切酶樣 3 (DCL3)基因、ARG0NAUTE1 (AGOl)、ARGONA UTE71 (AG07)、依賴于 RNA 的 RNA聚合酶1 (RDRl)、依賴于RNA的RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因(Suppressor of gene silencing) 1 (SGSl)、基因沉默阻抑基因 3 (SGS3)和沉默缺陷(Silencing defective) 3 (SDE3)。在另一實施方案中，核酸包含多于兩個待沉默的期望基因的序列。在一些實施方案中，期望基因為脂肪酸生物合成中的候選基因，如β -酮酰基-酰基載體蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基載體蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶(SAD)基因和脂肪酸去飽和酶(FAD)基因。在其他實施方案中，期望基因為候選轉錄因子基因。在一實施方案中，期望基因為小RNA(smRNA)生物合成中的候選基因。在另一實施方案中，期望基因為毒性物質(toxic agent)生物合成中的候選基因。因此在第一方面，本發明提供了一種在麻風樹屬中分析基因功能的方法。根據本發明，所述方法包括(a)將包含待沉默的候選基因的序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的載體以產生修飾的TRV RNA2載體；(b)制備土壤桿菌的混合培養物，所述混合培養物包含土壤桿菌，其含有包含 TRV RNAl序列的載體；以及土壤桿菌，其含有所述修飾的TRV
5
RNA2 載體；(c)將所述土壤桿菌的混合培養物通過真空滲入引入麻風樹屬的植物組織以產生感染的植物；(d)使所述感染的植物生長足夠的時間以誘導所述候選基因的基因沉默；以及在所述感染的植物上分析所述沉默的候選基因的表型效果。在一實施方案中，包含TRV RNA2的載體和包含TRV RNAl的載體為合成植物載體。 在另一實施方案中，第一期望基因的序列為所述基因的有義鏈的序列。在另一實施方案中， 第一期望基因的序列為所述基因的反義鏈的序列。在另一實施方案中，核酸還包含待沉默的第二期望基因的序列。在一實施方案中，第二期望基因為抗病毒基因。在另一實施方案中，抗病毒基因選自核糖核酸酶III切酶樣4(DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶樣2(DCL2) 基因、核糖核酸酶 III 切酶樣 3 (DCL3)基因、ARGONA UTEl (AGOl)、ARG0NAUTE71 (AG07)、依賴于RNA的RNA聚合酶1 (RDRl)、依賴于RNA的RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因 1 (SGSl)、基因沉默阻抑基因3(SGS3)和沉默缺陷3(SDE3)。在另一實施方案中，核酸包含多于兩個待沉默的期望基因的序列。在一些實施方案中，期望基因為脂肪酸生物合成中的候選基因，如β -酮酰基-酰基載體蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基載體蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶(SAD)基因和脂肪酸去飽和酶(FAD)基因。在其他實施方案中，期望基因為候選轉錄因子基因。在一實施方案中，期望基因為smRNA生物合成中的候選基因。在另一實施方案中，期望基因為毒性物質生物合成中的候選基因。


圖1示例了本發明的用于麻風樹病毒誘導性基因沉默(VIGS)的方法。圖2A-2E示出對CH42基因的VIGS效果和CH42基因插入長度效果。將攜帶pTRVl 或pTRV2 (圖2A中的載體、圖2B中的TRV2-CH42-440和圖2C中的TRV2-CH42-680)的根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)株的培養物按照1 1比例混合。用Iml無針注射器將混合培養物注射入處于2-3葉期植物的麻風樹屬植物中。CH42酶負責在葉綠素生物合成時將Mg加入卟啉環中。CH42基因的沉默阻斷了新出現的葉子中葉綠素的合成，該葉子失去其綠色但因為類胡蘿卜素的存在而出現黃色。注意，因為預先形成的葉綠素的穩定性，接種的葉子仍保持綠色。TRV2-CH42S和TRV2-CH42L分別含有440bp和689bp的CH42 基因片段的插入物(insert)。圖2D 沉默信號可以從接種的葉子(通過黑色箭頭指示)向下移動而在新出現的側葉(通過白色箭頭指示)中產生基因沉默效果。圖2E =RT-PCR分析以確定在較長CH42插入TRV-CH42L感染(泳道1)、短CH42插入TRV-CH42S感染(泳道 2-3)和載體對照感染(泳道CK)的已感染麻風樹植物上部葉子中麻風樹CH42RNA水平。第一鏈cDNA利用寡聚(dT)引物和反轉錄酶從分離自沉默和非沉默植物的總RNA產生。第一鏈cDNA用于使用基因特異性引物的PCR反應中。溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠示出了 30個循環后的RT-PCR產物。用rbcL基因轉錄物的PCR產物作為加樣對照。圖3A和:3B示出合成TRV載體的沉默與原始TRV載體效率相似。圖3A 使用原始 TRV載體的CH42沉默。圖;3B 使用合成TRV載體的CH42沉默。圖4A-4G示出了麻風樹PDS基因的沉默。用單獨的重組TRV(圖4A)或攜帶麻風樹PDS基因片段的TRV(圖4B、4C、4D)感染麻風樹植物。TRV2-PDS-300和TRV2-PDS-700 指將大小為300bp和700bp的PDS基因插入TRV2載體中。感染TRV-PDS-300 (圖4C)和 TRV-PDS-700(圖4B、4D)使麻風樹植物中的內源PDS基因沉默，而類胡蘿卜素生物合成的抑制導致了各種光漂白表型。利用費時的土壤桿菌注射(agro-injection)方法，僅小區域 (葉脈)表現出光漂白表型。本文描述的真空滲入方法顯著提高了沉默效率(比較圖4B和 4D)。此外，處理時間減少為土壤桿菌注射所用時間的1/5。圖4E 定量PT-PCR分析以示出圖4C和圖4D中沉默的麻風樹葉子的相對PDS RNA水平。三個獨立重復的平均值與誤差線一起示出。**表示用TRV-PDS-600沉默的植物與用TRV-PDS-300沉默的植物相比PDS RNA 水平更低。真空滲入在CH42基因沉默中有助于更好的沉默效率(將圖4F中土壤桿菌注射的數據與圖4G中真空滲入的數據比較)。圖5A-5E示出了一個載體中兩個基因的共沉默。分生組織特異性基因PCNA單獨沉默(圖5A)以及CH42和PCNA共沉默(圖5B和5C 葉子的近軸側；以及圖5D 葉子的遠軸側)。重組TRV-PCNA或TRV-PCNAco-CH42通過真空滲入感染麻風樹植物。TRV-PCNAco-CH42 攜帶含有麻風樹PCNA和CH42基因片段的插入物。通過真空滲入的沉默表現出比基于注射器的土壤桿菌注射沉默更好的沉默效果。圖5E 定量RT-PCR分析以示出沉默的麻風樹葉子的相對PCNA和CH42 RNA水平。三個獨立實驗的平均值與誤差線一起示出。圖6A-6C示出了 DCL4和CH42的共沉默以提高VIGS效率。CH42基因單獨沉默 (圖6A)以及DCL4和CH42的共沉默(圖6B)。圖6C 定量RT-PCR分析以示出沉默的麻風樹葉子的相對DCL4和CH42 RNA水平。三個獨立實驗的平均值和誤差線一起示出。^"表示CH42和DCL4基因共沉默的葉子中的沉默效率與CH42基因單獨沉默的葉子相比更高(ρ < 0. 01)。圖7A-7C示出了編碼β-酮酰基-酰基載體蛋白合酶II的麻風樹屬KASII基因通過TRV VIGS的沉默。圖7Α =TRV滲入18天后感染不同TRV構建體的沉默的麻風樹植物的表型。圖(a) 用空TRV載體處理的麻風樹植物。圖(b)感染TRV:KASII的麻風樹植物，其具有輕度微黃色表型。圖(c)和(d)感染TRV:KASII的麻風樹植物，其具有重度表型。處理的植物表現出新出現的葉子向下卷曲、葉片褐色以及枝條延伸減少。圖(e)和(f):麻風樹FATBl基因和 KASII基因的拮抗效果。FATIB基因編碼酰基-ACP硫酯酶。我們用載體，TRVKASIICo-FATB 1 以共沉默麻風樹屬KASII和FATBl。感染的植物的葉子顯示出沿葉脈的微黃色表型，這與僅感染TRV:KASII的葉子中發現的輕度表型非常相似。比例尺=10mm。圖7B 沉默的麻風樹葉子中KASII和FATB基因表達水平的定量RT-PCR分析。圖 (a)載體對照。圖(b) =KASII表達沉默的植物。圖(c)圖2A中具有重度表型的KASII表達沉默的植物。圖⑷與圖(b)相同，除了注射的植物表現出重度表型。圖(e)和(f)來自KASII和FATB基因表達共沉默的植物的葉子。KASII和FATB的轉錄水平通過利用基因特異性引物的擴增來定量。未發現載體對照植物與KASII沉默的植物之間FATB基因表達水平有顯著差異。圖7C:來自沉默的麻風樹葉子的脂肪酸甲酯的氣相色譜圖載體，載體對照； KASII-輕度，來自KASII表達沉默的顯示出輕度表型的植物的葉子。這些植物表現出輕度微黃色表型和16:0積累的適度增加(KASII輕度)；KASII-重度，KASII表達沉默但具有重
7度表型的植物，注意16:0積累的顯著增加(KAS11重度)；KASII CO FATB, KASII和FATBl 基因表達共沉默的植物。標記了甲酯16:0(峰1)、16:13(峰2)、順(cis)-16:l9(峰3)、 16:3 (峰4)、18:0(峰5)、順-18:1 Δ9(峰6)、18:1 Δ 11 (峰 7)、順-18:29’12(峰8)和順-18:39,
12’15(峰 9)。圖8A-8C示出麻風樹中通過TRV VIGS系統的幾種去飽和酶表達的沉默。圖8A 硬脂酰-ACP去飽和酶(SAD)基因家族單個成員表達沉默的麻風樹植物的表型。在滲入18天后分析TRV構建體滲入的植物。圖(a):空載體處理的麻風樹植物。圖 (b)-(d)感染TRV:SAD1的麻風樹植物在早期(12dpi)表現出重度表型，(圖(b))中示出的向下卷曲、窄葉片和褐色葉脈；以及晚期(18dpi)，示于(圖(c)和⑷)中。圖(e) TRV:SAD2處理未產生任何明顯的表型。圖(f)和(g) :TRV:SAD3引起比感染TRV:SAD1的植物弱得多的表型。比例尺=10mm。圖8B 感染的麻風樹植物中SAD基因表達水平的實時RT-PCR定量。TRV: SADl早期樣品(SADl-E)中相對SADl基因轉錄水平。圖8C 脂肪酸甲酯的氣相色譜圖，其來自三個SAD基因家族成員和三個油酸去飽和酶基因表達沉默的麻風樹屬植物的葉子樣品載體，空載體對照；SAD1-E，來自TRV:SADl 感染早期植物的樣品。植物的葉子表型在圖3A中示出；SAD1-L，來自TRV:SAD1感染晚期植物的樣品；FAD2-1，來自TRV-FAD2-1處理的植物的樣品；FAD2-2，來自TRV-FAD2-2處理的植物的樣品；FAD6，來自TRV-FAD6處理的植物的樣品。注意FAD6位于ER中。標記了甲酯 16 0 (峰 1)、16 I3 (峰 2)、順-16 I9 (峰 3)、16 3 (峰 4)、18 0 (峰 5)、順-18 1 Δ9 (峰 6)、 順-18:29'12 (峰7)和順-18:39’12’15 (峰8)。未知峰標注為峰9。圖9A-9I示出了調控植物發育的關鍵基因沉默的麻風樹植物。圖9A 感染TRV VIGS構建體的麻風樹植物在27dpi時的表型，除了 i和j是在 42dpi時拍攝的。圖(a)-(d)感染TRV:AS1的麻風樹植物。來自感染的植物的向下卷曲的葉子的近軸側(圖(a))和遠軸側(圖(b))。圖(c)處理的麻風樹植物葉子上沿葉脈的近軸異位葉片。圖(d)處理的麻風樹植物葉子中近軸異位葉片和氣泡結構的高放大率視野。 圖(e)-(j)感染TRV:AG01的麻風樹植物的葉子。處理的麻風樹植物向上卷曲的葉子的圖 (e)近軸側和圖(f)遠軸側。圖(g)處理的麻風樹植物葉子的沿葉脈的遠軸異位葉片的高放大率視野。圖(h) :AG01表達沉默的植物的典型鋸齒葉表型。圖(i)和(j) :AG01表達沉默的植物中異常的葉形狀。(k)近軸(m)遠軸載體對照葉子。比例尺=10mm。圖9B =ASl表達沉默的葉子的掃描電子顯微照片。注意近軸異位葉片。PB 初生葉片；EB 異位葉片；ebad 異位葉片近軸；ebab 異位葉片遠軸。圖9C 顯示出柵欄組織(異位葉片柵欄，ebp)和側脈(異位葉片葉脈，ebv)分化的異位葉片的橫切面。圖9D =AGOl表達沉默的葉子的掃描電子顯微照片。注意沿初生葉脈(V)的遠軸異位葉片。圖9E =AGOl表達沉默的葉子的橫切面。注意異位遠軸葉片與下表皮(E)與海綿薄壁組織(SP)相鄰。圖9F =AGOl表達沉默的葉子的近軸氣泡的橫切面。注意維管樣結構的鑲嵌組成 (木質部，χ ；韌皮部，P)和兩層柵欄薄壁組織(PP)。
圖9G 感染空載體對照的麻風樹葉子的橫切面。圖9H =ASl表達沉默的麻風樹葉子中ASl和I類KNOX基因(KNAT1-樣)表達水平的實時RT-PCR分析。圖91 =AGOl表達沉默的麻風樹葉子中AGOl和iPHAVOLUTA (PHAV)表達水平的實時 RT-PCR 分析。比例尺=50 μ m(C，Ε, F，G)，B 禾口 D 中為 200 μ m。圖10示出了在麻風樹中編碼麻風樹毒蛋白的基因的沉默。麻風樹毒蛋白表達沉默的麻風樹葉子的蛋白印跡分析。頂部用抗麻風樹毒蛋白抗體檢測麻風樹毒蛋白。底部 作為加樣對照的RUBL(RUBISC0大亞基)的考馬斯亮藍染色。泳道1 空載體感染的植物葉子，泳道2-4，TRV:麻風樹毒蛋白感染的麻風樹葉子。圖11A-11E示出了用sTRV:JcCH42處理的一些推定的宿主植物(對于圖11A、11C、 IlD和 IlE 中示出的植物Dinesh Kumar et al. (2007))。圖 IlA 花生(Arachis hypogaea)； 圖 IlB 綠豆(Phaseolus aureus)；圖 IlC 大豆(Glycine max)；圖 IlD 菜豆(Phaseolus vulgaris)；圖 IlE 蓖麻(Ricinus communis)。比例尺10mm。圖12示出了用sTRV: JcCH42或模擬對照處理的一些推定的宿主植物(對于在泳道 1-5、11、12 和 14-17 中示出數據的植物 Dinesh Kumar et al. Q007))的 TRV 病毒 RNA 分析(RNA1和RNA2)。泳道1_5 花生(泳道1_3，用sTRV: JcCH42處理，泳道4和5來自模擬對照)；泳道6-10:綠豆(泳道6-8，用sTRV:JcCH42處理，泳道9和10來自模擬對照)； 泳道11-12和14-19 蓖麻(泳道11-12和14-17，用sTRV:JcCH42處理，泳道18禾口 19來自模擬對照)，泳道13為11Λ DNA ladder標記。“*”表示預期的PCR擴增片段。發明詳述本發明涉及基因組規模的麻風樹屬基因功能分析領域。更具體地，本發明涉及一種利用病毒誘導性基因沉默來進行基因組規模的麻風樹基因高通量功能分析的方法。病毒誘導性基因沉默(VIGS)(Ruiz et al.，1998 ；Burch-Smith et al.，2004)系統提供了不需要遺傳轉化植物就確定基因產物的生物學功能的可能性。RNA和DNA病毒均誘導導致產生病毒相關siRNA的RNA沉默(BaulCOmbe，2004)。可以構建攜帶候選植物基因的插入的部分序列的重組病毒。這樣的重組病毒可以在整個植物中全身移動，產生可以介導內源候選基因轉錄物降解的siRNA(Brigneti et al. ,2004 ；Burch-Smith et al.， 2004)，從而導致接種的植物中候選基因表達的沉默。VIGS方法提供了幾個良機(1)用于基因/基因家族敲低(knock down)的有效反向遺傳學工具；(2)迅速和高通量(Liu et al.，2002b)—在不到一個月內敲除整個基因組ORF ；(3)瞬時、可逆和所謂“誘導”敲除表型(Liu et al. ,2002a)；以及(4)適合沉默的不同器官，提供了通過不同感染方法來敲除根(Valentine et al. ,2004 ;Kaloshian，2007)、花(Liu et al. ,2004 ；Chen et al.，2005)、葉子(Liu et al.，2002a ；Liu et al.，2002b ；Burch-Smith et al.，2006)或果實(Fu et al.，2005)中基因的機會。TRV VIGS系統已成功地應用于一些植物中，如擬南芥(Arabidopsis) (Burch-Smith et al. , 2006) > 辣椒(Capsicum annuum) (Chung et al. , 2004) > 番 ^jp (Lycopersicon esculentum) (Liu et al. , 2002 ；Dinesh Kumar et al. , 2007)、矮牽牛(Petunia hybrida) (Chen et al. ,2005)(Nicotiana benthamian) (Liu et
al.，2002)、馬鈴薯(Solanum tuberosum) (Brigneti et al.，2004)。大部分這些植物經實驗證實為一些TRV株的易感宿主(Plant Virus Online,http colon backslash backslash image dot fs dot uidaho dot edu backslash vide backslash descr808 dot htm)。更重要地，不能合理預期這種TRV VIGS系統在所有植物中必然工作。例如，Dinesh Kumar et al. (2007)包含了據稱TRV VIGS系統可以工作的植物的列表。然而，這種TRV VIGS系統在花生和大豆中不能工作，因為它們不是TRV的宿主，盡管它們包含在Dinesh Kumar et al. (2007)的列表中。事實上，如本文證實的，TRV VIGS系統并不在所有Dinesh Kumar et al. (2007)或在線病毒數據庫中列出的對煙草脆裂病毒(TRV)易感的植物中工作。此外， 用于功能基因分析的TRV VIGS系統要求全身性感染。一些植物可能對TRV局部易感但不是全身性易感，所以TRV VIGS系統不會在這些植物中工作。在本發明之前，未知麻風樹屬是TRV的宿主或未知其對TRV任何程度的易感，不論局部或全身性。在篩選許多病毒載體后發現麻風樹屬對TRV易感并且TRV VIGS系統可以用于麻風樹屬，這是意料之外的。本發明出人意料的特征進一步由TRVVIGS系統不能在對TRV易感或列為TRV宿主植物的所有植物中工作所證實。在一方面，本發明提供了用于麻風樹中的VIGS的有效且可重復的系統和方法。在一實施方案中，本發明提供了 DCL4的共沉默以提高VIGS效率。在另一實施方案中，本發明提供了整個TRV病毒基因組的進一步再合成。在另一實施方案中，本發明證實這些載體具有與原始載體相似的效率。在另一實施方案中，本發明提供了 TRV VIGS系統在克隆和功能性鑒定幾種重要的脂肪酸生物發生途徑基因中的用途。這些重要的基因可以用于改善生物柴油的燃料特性，如低溫流動特性、氧化穩定性和NOx排放。因此在第一方面，本發明提供了一種麻風樹屬中病毒誘導性基因沉默(VIGS)的方法。根據本發明，所述方法包括(a)將包含待沉默的第一期望基因的序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的載體以產生修飾的TRV RNA2載體；(b)制備土壤桿菌的混合培養物，所述混合培養物包含土壤桿菌，其含有包含 TRV RNAl序列的載體；以及土壤桿菌，其含有所述修飾的TRVRNA2載體；(c)將所述土壤桿菌的混合培養物通過真空滲入引入麻風樹屬的植物組織以產生感染的植物；以及(d)使所述感染的植物生長足夠的時間以誘導所述期望基因的基因沉默。在一實施方案中，包含TRV RNA2的載體和包含TRV RNAl的載體為合成植物載體。 本文所示的結果和表型數據表明合成STRV-VIGS系統可以和TRV-VIGS系統一樣有效地用于誘導期望的內源麻風樹基因的沉默。在另一實施方案中，第一期望基因的序列為所述基因的有義鏈的序列。在另一實施方案中，第一期望基因的序列為所述基因的反義鏈的序列。 如本文所示，本發明的VIGS系統可以用于快速表征可能分享重疊功能的多基因家族的單個成員。在另一實施方案中，核酸還包含待沉默的第二期望基因的序列。在一實施方案中， 第二期望基因為抗病毒基因。在另一實施方案中，抗病毒基因選自核糖核酸酶III切酶樣 4(DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶樣2 (DCL2)基因、核糖核酸酶III切酶樣3 (DCL3)基因、 ARG0NAUTE1 (AG01)、ARG0NAUTE71 (AG07)、依賴于 RNA 的 RNA 聚合酶 1 (RDRl)、依賴于 RNA 的
10RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因1 (SGSl)、基因沉默阻抑基因3 (SGS3)和沉默缺陷 3(SDE3)。本文所示的表型和分子分析證實共沉默抗病毒基因可以在處理的麻風樹植物中帶來更高的VIGS效率。此外，抗病毒系統的共沉默還可以用于增加其他植物物種中其他 VIGS系統的效率。在另一實施方案中，核酸包含多于兩個待沉默的期望基因的序列。本文所示的數據表明本發明的VIGS系統可以用于敲低兩個或更多個基因的表達，從而允許在功能性冗余事件中破譯基因功能。在一些實施方案中，期望基因為脂肪酸生物合成中的候選基因，如β -酮酰基-酰基載體蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基載體蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶(SAD)基因和脂肪酸去飽和酶(FAD)基因。在其他實施方案中，期望基因為候選轉錄因子基因。在一實施方案中，期望基因為smRNA生物合成中的候選基因。在另一實施方案中，期望基因為毒性物質生物合成中的候選基因。本文所示的結果證實本發明的 VIGS系統可以有效地抑制靶宿主基因，并且可以用作分析候選基因在脂肪酸生物合成或毒素基因(toxic gene)生物合成中的作用的快速方法，以及用于研究諸如轉錄因子基因的調節基因的作用，或涉及小RNA生物發生途徑的基因的作用。如本文所示，種子SADl基因的抑制可以用于產生含有高硬脂酸含量的麻風樹屬油。如本文進一步所示，種子FAD2-1基因和FAD-2基因的抑制可以用于產生含有較高油酸含量和較低16-碳脂肪酸含量的麻風樹屬油。本文所示的結果和表型數據表明VIGS系統可以成功地用于誘導其他期望的內源麻風樹基因的沉默。我們產生了諸如種子和花的幾種不同麻風樹屬組織的表達序列標簽 (EST)。這些表達序列標簽(EST)為麻風樹屬的功能基因組研究提供了大量的信息。因此， 本文描述的VIGS法提供了在同源系統中測試麻風樹屬基因序列功能的方法。利用標準化 cDNA文庫，可以用本發明的VIGS系統進行基因功能的大規模篩選。在第二方面，本發明提供了一種在麻風樹屬中分析基因功能的方法。根據本發明， 所述方法包括(a)將包含待沉默的候選基因的序列的核酸插入包含煙草脆裂病毒(TRV) RNA2序列的載體以產生修飾的TRV RNA2載體；(b)制備土壤桿菌的混合培養物，所述混合培養物包含土壤桿菌，其含有包含 TRV RNAl序列的載體；以及土壤桿菌，其含有所述修飾的TRV RNA2載體；(c)將所述土壤桿菌的混合培養物通過真空滲入引入麻風樹屬的植物組織以產生感染的植物；(d)使所述感染的植物生長足夠的時間以誘導所述候選基因的基因沉默；以及在所述感染的植物上分析所述沉默的候選基因的表型效果。在一實施方案中，包含TRV RNA2的載體和包含TRV RNAl的載體為合成植物載體。 在另一實施方案中，第一期望基因的序列為所述基因的有義鏈的序列。在另一實施方案中， 第一期望基因的序列為所述基因的反義鏈的序列。在另一實施方案中，核酸還包含待沉默的第二期望基因的序列。在一實施方案中，第二期望基因為抗病毒基因。在另一實施方案中，抗病毒基因選自核糖核酸酶III切酶樣4(DCL4)基因、核糖核酸酶III切酶樣2(DCL2) 基因、核糖核酸酶 III 切酶樣 3(DCL3)基因、ARG0NAUTE1 (AGOl)、ARG0NAUTE71 (AG07)、依賴于RNA的RNA聚合酶1 (RDRl)、依賴于RNA的RNA聚合酶6 (RDR6)、基因沉默阻抑基因
111 (SGSl)、基因沉默阻抑基因3(SGS3)和沉默缺陷3(SDE3)。在另一實施方案中，核酸包含多于兩個待沉默的期望基因的序列。在一些實施方案中，期望基因為脂肪酸生物合成中的候選基因，如β -酮酰基-酰基載體蛋白合酶II (KASII)基因、酰基-酰基載體蛋白硫酯酶B(FATB)基因、硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶(SAD)基因和脂肪酸去飽和酶(FAD)基因。在其他實施方案中，期望基因為候選轉錄因子基因。在一實施方案中，期望基因為smRNA生物合成中的候選基因。在另一實施方案中，期望基因為毒性物質生物合成中的候選基因。一旦表征了麻風樹屬基因或多個麻風樹屬基因的功能，就可以利用常規技術制備轉基因植物以改變所述基因或多個基因的表達模式。插入麻風樹屬植物的DNA(所關注的DNA)對于轉化方法不重要。通常，導入植物的 DNA是構建體的一部分。DNA可以是所關注的基因，例如蛋白的編碼序列；或者它可以是能夠調節基因表達的序列，例如反義序列、有義抑制序列或微小RNA(miRNA)序列。構建體通常包含可操作地連接至所關注的DNA的5’端和/或所關注的DNA的3’端的調節區。含有所有這些元件的盒在本文中也稱為表達盒。在表達盒構建體中，表達盒還可以含有5’前導序列。調節區(即啟動子、轉錄調節區和翻譯終止區)和/或編碼信號錨定的多核苷酸對宿主細胞可以是天然的/類似的，或彼此是天然的/類似的。可選地，調節區和/或編碼信號錨定的多核苷酸對宿主細胞可以是異源的，或彼此是異源的。參見，美國專利號7，205，453 和美國專利申請
發明者葉健, 曲景, 蔡南海 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司