專利名稱：一種山核桃葉中總黃酮苷元的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種利用聚酰胺分離純化中藥有效成分的方法，更具體的來說是聚酰胺分離富集山核桃葉中總黃酮苷元的新方法，屬于中藥化學的分離純化技術領域。
背景技術：
黃酮類化合物是一種天然存在的有機化合物。在自然界中，黃酮類化合物廣泛存在于多種植物的器官(如種子、花、果實、和葉子)和其他中藥材原料中，例如回心草、甜茶、金蓮花、益母草、銀杏葉、山楂、甘蔗、板栗花、蜂膠等里面都含有豐富的黃酮類化合物。凡是有兩個苯環(A環和B環)通過三碳鏈相連結而形成的一類化合物統稱為黃酮類化合物，其基本骨架為C6-C3-C6，常有羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等取代。根據其B環的連接位置(2位或3位)，C環氧化程度和C環是否成環等因素將黃酮類化合物分為七大類:黃酮和黃酮醇類、二氫黃酮和二氫黃酮醇類、異黃酮和二氫異黃酮、查耳酮和二氫查耳酮、橙酮類、花色素和黃烷醇類以及其他黃酮類。目前已經有6000多種黃酮類化合物的結構被鑒定出來，相信隨著研究的深入，將會有更多的黃酮類化合物的結構被鑒定出來。黃酮類化合物多是以黃酮苷(黃酮和多糖之間以糖苷鍵相連)和黃酮苷元(游離的黃酮單體)的形式存在于植物體內和天然中藥材原料中。
黃酮類化合物的研究已經非常廣泛而深入，其生理及藥理作用和活性研究也相當深入。有文獻表明，黃酮類化合物有抗炎鎮痛、抗過敏、擴張血管、抗氧化、抗心律失常、改善微循環、抗脂肪肝、防止動脈硬化、抗病毒、降血脂、減少糖尿病并發癥、協同增進抗腫瘤藥物療效等藥理作用。作為一種天然存 在的有機化合物，其在治療心血管疾病領域有著很重要的地位。故從天然植物和中藥材原料中提取、分離純化黃酮類化合物，進而進行有效地藥理實驗研究是一項極有必要性和有意義的工作。
目前實驗室多采用聚酰胺樹脂法精制純化黃酮類化合物，不僅方法簡單、成本低、效率高、穩定性好和容易再生等特點，而且其安全性也高，沒有重金屬和有毒有機試劑殘留等問題。層析分離中常用的聚酰胺是由己內酰胺聚合而成的尼龍6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龍66。聚酰胺是一類結構中含有重復單位酰胺鍵(-C0-NH-)的高分子聚合物，酰胺基團上的O、N原子在酸性介質中結合質子而帶正電荷，以靜電引力形成吸附溶液中的陰離子，故可與酚類、酸類、醌類、黃酮類等富含酚羥基的化合物形成氫鍵而被吸附，而與不能形成氫鍵的化合物分離。聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有機溶劑，對堿較穩定，對酸尤其是無機酸穩定性較差，可溶于濃鹽酸、冰醋酸及甲酸。
查閱相關文獻，傳統的用聚酰胺純化精制總黃酮的方法基本上是一致的，下面以用聚酰胺純化野菊花中的蒙花苷為例簡述這種方法。首先，配制蒙花苷標準品溶液，用HPLC制作標準曲線。然后，80%的乙醇浸泡提取野菊花，把提取液濃縮，真空干燥至浸膏狀(或干粉)。取少量浸膏加水配制已知濃度的上柱樣品液，通過靜態吸附考察和動態吸附考察確定綜合性能最好的聚酰胺，評價聚酰胺的性能標準是靜態吸附量和解吸率，動態吸附量和解吸率。選取最佳的聚酰胺，上柱以后，開始上樣(上樣液濃度已知)，一般都是采用濕法上樣。在上樣后聚酰胺開始吸附黃酮，由于上樣液的濃度、上樣液的體積及上樣吸附時間這些條件都會影響聚酰胺吸附黃酮的效果，故需要對這些條件進行優化。黃酮吸附在聚酰胺上以后，用洗脫液進行洗脫，洗脫條件的控制亦會對洗脫效果產生很大的影響。例如，洗脫液的濃度、洗脫液的用量、洗脫速度以及除雜液的用量這些條件也需要優化，使洗脫效果達到最佳。由于聚酰胺在水環境下吸附黃酮的效果最佳，故上樣液一般都是配制成水溶液，而洗脫液一般都是用不同濃度乙醇來解吸附。
但是，若是用這種方法分離富集黃酮苷元卻存在很多問題。我們發現，采用聚酰胺傳統分離、富集工藝根本難以做到，原因在于:其一，待分離的黃酮苷元脂溶性較強，用蒸餾水稀釋根本無法溶解；其二，雖然可以先用適量的乙醇溶解，然后大量蒸餾水稀釋能夠溶解，但其體積將非常巨大；其三，聚酰胺在水溶液中對黃酮類物質的吸附能力最強，稀釋后的乙醇上樣液是否會影響其黃酮苷元吸附仍有待考證。在實際中，無論是用聚酰胺分離富集黃酮苷元還是黃酮苷，我們都有類似問題，然而，檢索文獻資料，未有相關文獻論述這一問題，而且幾乎所有文獻都只分離富集總黃酮。鑒于前述現象和問題，我們認為有必要采用新的方法工藝，對聚酰胺分離富集黃酮進行改進，以適應實際需求。發明內容
傳統的聚酰胺分離富集黃酮的方法存在一些問題和不足，主要是難以應用于極性較小的黃酮苷及黃酮苷兀。
本發明的目的是提供一種山核桃葉中總黃酮苷元的提取方法，用以解決目前分離富集黃酮苷元所存在的問題。本方法的操作工藝簡單、且分離效果較好。
本發明的目的可以通過以下技術方案予以實現:
一種山核桃葉中總黃酮苷元的提取方法，其特征在于所述方法包括以下步驟:
(I)山核桃葉干粉用體積濃度5(Γ95%的乙醇水溶液加熱回流提取，過濾得總黃酮苷元提取液；
(2)聚酰胺上柱，先用體積濃度8(Γ100% (優選95%)的乙醇沖洗至流出液蒸干后無白色固體，再用蒸餾水洗至PH值中性，然后用4飛倍(優選5倍)柱體積的3飛wt% (優選5wt%)NaOH水溶液沖洗，再用蒸餾水洗至pH值中性，最后用4飛倍(優選5倍)柱體積的5^15wt% (優選10wt%)醋酸沖洗，再用蒸餾水洗至pH值中性，將聚酰胺取出于5(T90°C (優選6(T70°C)烘干，得到 預處理后的聚酰胺；
(3)將步驟(2)得到的預處理后的聚酰胺加入步驟(I)得到的總黃酮苷元提取液中，加入體積為總黃酮苷元提取液20 80%的水(優選為40%)，于35 55°C (優選40°C )溫度下減壓濃縮至反應混合液中無醇味，得到濃縮后的混合液；所述預處理后的聚酰胺和山核桃葉干粉的質量比為20 40: 100 (優選為30:100);
(4)步驟(3)得到的濃縮后的混合液上柱，其中固體聚酰胺自然沉降至平整無氣泡；放出柱中液體，然后先用體積濃度2(Γ30% (優選30%)的乙醇水溶液洗去雜質，再用體積濃度4(Γ50% (優選40%)的乙醇水溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，洗脫液蒸干制得總黃酮苷兀。
本發明所述步驟(I)優選按以下方法操作:
干燥的山核桃葉粉碎，過50目篩，得山核桃葉干粉，加入體積濃度為5(Γ95%的乙醇水溶液(優選為體積濃度95%的乙醇水溶液)加熱回流提取，每次提取時所述乙醇水溶液的體積用量以山核桃葉干粉的質量計為2(T35mL/g (優選25mL/g)，所述提取的次數為廣3次(優選提取2次)，每次提取通常時間為l(T30min，優選為lOmin，將每次提取后的得到的提取液過濾后合并，即得所述總黃酮苷元提取液。所述步驟(3)中，減壓濃縮的溫度優選為40°C ;在減壓濃縮的過程中，隨著乙醇蒸除，反應混合物中濃度的逐漸降低，黃酮和聚酰胺之間會以氫鍵的方式結合，逐漸吸附在聚酰胺的表面。所述步驟(4)中，放出柱中液體優選緩慢讓柱子中的水流下來，把水溶性的雜質帶出來一部分，用體積濃度2(Γ30%的乙醇水溶液洗去雜質，主要除去一些極性稍大的雜質。所述步驟(4)中，所述體積濃度2(Γ30%的乙醇水溶液的體積用量以山核桃葉干粉的質量通常計為2(T40mL/g，優選為30mL/g，所述體積濃度40 50%的乙醇水溶液的體積用量以山核桃葉干粉的質量通常計為4(T70mL/g，優選為60mL/g。較為具體的，推薦本發明方法按照以下步驟進行:(1)干燥的山核桃葉粉碎，過50目篩，得山核桃葉干粉，加入體積濃度為95%的乙醇水溶液加熱回流提取2次，每次提取時所述乙醇水溶液的體積用量以山核桃葉干粉的質量計為2(T35mL/g，每次提取時間為l(T20min，2次提取后的提取液過濾后合并，即得所述總黃酮苷元提取液；(2)聚酰胺上柱，先用體積濃度95%的乙醇沖洗至流出液蒸干后無白色固體，再用蒸餾水洗至PH值中性，然后用5倍柱體積的5wt%的NaOH水溶液沖洗，再用蒸餾水洗至pH值中性，最后用5倍柱體積的10被％醋酸沖洗，再用蒸餾水洗至pH值中性，將聚酰胺取出于6(T70°C烘干，得到預處理后的聚酰胺；(3)將步驟(2)得到的預處理后的聚酰胺加入步驟(I)得到的總黃酮苷元提取液中，加入體積為總黃酮苷元提取液40%的水，于40°C溫度下減壓濃縮至反應混合液中無醇味，得到濃縮后的混合液；所述預處理后的聚酰胺和山核桃葉干粉的質量比為30: 100；(4)步驟(3)得到的濃縮后的混合液上柱，其中固體聚酰胺自然沉降至平整無氣泡；放出柱中液體，然后先用體積濃度30%的乙醇水溶液洗去雜質，再用體積濃度40%的乙醇水溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，洗脫液蒸干制得總黃酮苷元。本發明與現有的方法相比較，具有以下優點:1)該方法操作簡便，工藝較簡單，而且成本較低，非常適合工業化生產分離富集黃酮苷元；2)用此種方法得到的黃酮純度較高，可以達到87.47%，而且加樣回收率也較高，可以達到95.52%。


圖1是5種黃酮單體化合物的標準品和實施例1制得的山核桃葉的總黃酮苷元固體產品72nm檢測波長下的HPLC色譜圖，A曲線對應標準品，B曲線對應實施例1制得的山核桃樹葉總黃酮苷兀；1-5號峰分別依次對應漢黃岑素、白楊素、小豆蘧明、球松素查耳酮和松屬素。
具體實施例方式下面結合具體的實施例進一步對本發明方案進行說明，但它們不是對本發明的限定。實施例1:(a)聚酰胺的預處理:I)將80-100目柱層析用聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)上柱，用體積濃度95%的乙醇沖洗至流出液蒸干后無白色固體；2)再用蒸餾水洗至pH值中性，然后用5倍柱體積的5wt%Na0H水溶液沖洗；3)再用蒸餾水洗至pH值中性，然后用5倍柱體積的10wt%醋酸沖洗；4)再用蒸餾水洗至pH值中性，將聚酰胺取出于60°C烘干，得到預處理后的聚酰胺備用。(b)山核桃葉總黃酮苷元提取液的制備:稱取IKg山核桃樹 葉干粉；加入25L的體積濃度95%乙醇加熱回流提取，提取2次，每次IOmin ;將2次的提取液過濾后合并，即得到50L山核桃葉總黃酮苷元提取液。(C)制作標準曲線:山核桃葉中含有5種黃酮單體化合物，分別是漢黃芩素、白楊素、小豆蘧明、球松素查耳酮和松屬素。I)操作步驟:以漢黃芩素、白楊素、小豆蘧明、球松素查耳酮和松屬素這5種單體化合物為對照品，分別配置成不同濃度的混合溶液，利用HPLC技術以標準溶液濃度(μ g/mL)為橫坐標(X)，峰面積(mUV*min)為縱坐標繪制標準曲線(Y)。2)高效液相色譜條件及系統適應性:戴安UltiMate3000液相色譜儀分析，戴安 Acclaiml20C18 色譜柱(250 X 4.6mm, 5 μ m),戴安 UltiMate3000 自動進樣器，戴安 UltiMate3000DAD 檢測器，檢測波長 262nm、272nm、284nm、342nm，流動相 0.lwt% 乙酸水:100%甲醇=30:70 (v/v)，流速lmL/min，柱溫30。。。漢黃芩素檢測波長為272nm、白楊素為262nm、小豆蘧明和球松素查耳酮為342nm、松屬素為284nm。各峰與相鄰的峰的分離度均大于1.5，理論塔板數均在I萬以上，漢黃芩素、白楊素、小豆蘧明、球松素查耳酮、松屬素的相對保留時間分別為9.4，10.7，14.9，15.8，20.4min左右。圖1中A曲線為標準品在272nm檢測波長下的HPLC色譜圖。3)結果表明:漢黃芩素、白楊素、小豆蘧明、球松素查耳酮和松屬素濃度分別在
1.27 25.30,2.56 51.20、1.29 25.60,5.01 100.20 和 5.06 101.20 μ g/mL 范圍內線性關系良好，相應的回歸方程分別為:Y=L 0120X+0.0590 r=0.9999Y = 0.8255X-0.0903 r=0.9999Y=L 0463X-0.0587 r=0.9999Y = 0.8067X-0.4716 r=0.9999Y = 0.7391X+0.3407 r=0.9999(d)聚酰胺分離富集提取總黃酮苷元:將步驟(b)得到的50L的山核桃葉總黃酮苷元提取液(預先用HPLC檢測其中總黃酮苷元純度，計算得到提取液中已知物含量)中加入300g步驟(a)得到的預處理后的聚酰胺，然后再加入20L的蒸餾水，把混合液40°C下減壓濃縮，使濃縮后的液體體積在15L(這時殘余液幾乎無醇味)。然后把殘余混合液直接上柱，待其慢慢沉降以后，使水慢慢流出。先用30L的體積濃度30%乙醇沖洗，除去極性稍小的雜質，然后用60L的體積濃度40%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，得總黃酮苷元固體產品。將沉降后的流出的水、30L30%乙醇沖洗后收集的沖洗液蒸干，得到固體物，與最后60L40%乙醇洗脫后收集的洗脫液蒸干得到的總黃酮苷元固體產物，均用HPLC檢測其中總黃酮苷元含量，即已知物純度，相應計算得到各洗脫液得到的固體物中已知物的質量，所得結果如下表1，HPLC參數同步驟(C)。表I聚酰胺分離富集山核桃葉總黃酮苷元結果
權利要求
1.一種山核桃葉中總黃酮苷元的提取方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: (O山核桃葉干粉用體積濃度5(Γ95%的乙醇水溶液加熱回流提取，過濾得總黃酮苷元提取液； (2)聚酰胺上柱，先用體積濃度8(Γ100%的乙醇水溶液沖洗至流出液蒸干后無白色固體，再用蒸餾水洗至PH值中性，然后用4飛倍柱體積的3飛wt%NaOH水溶液沖洗，再用蒸餾水洗至PH值中性，最后用4飛倍柱體積的5 15wt%醋酸沖洗，再用蒸餾水洗至pH值中性，將聚酰胺取出于5(T90°C烘干，得到預處理后的聚酰胺； (3)將步驟(2)得到的預處理后的聚酰胺加入步驟(I)得到的總黃酮苷元提取液中，加入體積為總黃酮苷元提取液體積的2(Γ80%的水，于35飛5°C溫度下減壓濃縮至反應混合液中無醇味，得到濃縮后的混合液；所述預處理后的聚酰胺和山核桃葉干粉的質量比為20 40: 100 ； (4)步驟(3)得到的濃縮后的混合液上柱，其中固體聚酰胺自然沉降至平整無氣泡；放出柱中液體，然后先用體積濃度2(Γ30%的乙醇水溶液洗去雜質，再用體積濃度4(Γ50%的乙醇水溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，洗脫液蒸干制得總黃酮苷元。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(I)按以下方法操作: 干燥的山核桃葉粉碎，過50目篩，得山核桃葉干粉，加入體積濃度為5(Γ95%的乙醇水溶液加熱回流提取，每次提取時所述乙醇水溶液的體積用量以山核桃葉干粉的質量計為2(T35mL/g，所述提取的次數為廣3次，每次提取后的提取液過濾后合并，即得總黃酮苷元提取液。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，加水的體積為總黃酮苷元提取液體積的40%。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述預處理后的聚酰胺和山核桃葉干粉的質量比為30:100。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述乙醇水溶液的體積濃度為95%。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中，所述體積濃度2(Γ30%的乙醇水溶液的體積用量以山核桃葉干粉的質量計為2(T40mL/g ;所述體積濃度40 50%的乙醇水溶液的體積用量以 山核桃葉干粉的質量計為4(T70mL/g。
全文摘要
本發明公布了一種山核桃葉中總黃酮苷元的提取方法，山核桃葉干粉用體積濃度50~95%的乙醇水溶液加熱回流提取，過濾得總黃酮苷元提取液；將聚酰胺進行預處理；預處理后的聚酰胺加入總黃酮苷元提取液中，加水后減壓蒸餾，得到濃縮后的混合液直接上柱，其中固體聚酰胺自然沉降至平整無氣泡；放出柱中液體，然后先用體積濃度20~30%的乙醇水溶液洗去雜質，再用體積濃度40~50%的乙醇水溶液為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，洗脫液蒸干制得總黃酮苷元。本發明的有益效果在于通過本方法所得到的總黃酮苷元純度較高，回收率也很高，不但工藝簡單，操作方便，而且成本較低，適于工業化生產。
文檔編號A61P3/06GK103142685SQ201310048648
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月7日 優先權日2013年2月7日
發明者丁志山, 蔣福升, 張坤, 丁濱, 金波, 高承賢 申請人:浙江中醫藥大學