專利名稱：通過體細胞胚胎發生再生和大量繁殖麻風樹的制作方法
通過體細胞胚胎發生再生和大量繁殖麻風樹相關申請的交叉參考本申請要求2008年2月1日提交的美國臨時專利申請系列號No. 61/025，430的 權益和優先權，所述專利全文援引加入本文。
背景技術：
本發明涉及體細胞胚胎產生領域，特別涉及通過體細胞胚胎發生再生麻風樹屬 (Jatropha)的方法。本發明更特別涉及再生麻風樹(Jatrophacurcas)植物的方法和培養 基組合物。所述方法非常適于麻風樹轉化和產生克隆種植原種用于大規模麻風樹種植。本文中使用的舉例說明本發明背景或者提供額外關于實施的詳細描述的出版物 及其它材料援引加入本文，為方便起見分別附于參考文獻中。世界正面臨化石燃料供應短缺和溫室效應加劇。目前急需增加可再生能源的生產 和消耗。許多國家在發現替代能源以滿足其能源安全需求中，生物燃料已被認為是國家優 先級，同時幫助降低導致溫室效應的CO2排放。對生物燃料的需求已對食品生產施加了日益 增加的壓力。例如，為滿足由德國政府頒布的德國2017年的生物燃料需求，該國全部耕地 需要用于生長生物能源作物，沒有土地被留下用于食品生產。為減輕這種土地競爭及滿足 我們對可再生燃料的需求，強烈需要利用邊際土地(marginal land)進行生物能量產生。麻風樹是小的木本植物，屬于大戟科(Euphorbiaceae)。麻風樹的一些獨特特征特 征使得其成為生物柴油生產的理想植物。這些包括在邊際土地生長的能力；對水的需求低； 非食品作物狀態，在種植后1-2年的快速油料生產，相比之下油棕櫚要3年以上。因此，印 度尼西亞政府已聲明他們在接下來5年內投入大約3百萬公頃土地種植麻風樹屬。在各國中，印度在建立麻風樹屬種植方面是最先進的。但是，印度麻風樹屬種植的 種子產量低，在0. 4-12MT/Ha范圍(相比之下棕櫚為大約19Mt/Ha)。這種差異至少部分由 于缺乏麻風樹育種研究和農場管理所致。對來自麻風樹的油料的強烈興趣對供應足夠種植用的均質及高產種子已產生巨 大壓力。因此，目前急需大量繁殖精選樹。同等急需的是改良麻風樹的各種農學性質的方 法。基因工程被認為是作物改良的快速方法。植物轉化基本上是兩步方法，即輸送基因進入 宿主細胞，隨后再生轉化細胞為植物。體細胞胚胎發生愈傷組織或者體細胞胚胎發生懸浮 培養物通常被認為是最有效的再生方法，因為大多數轉化細胞已獲得胚胎發生潛力，能非 常自發地驅動它們發展為體細胞胚，這是類似于合子胚中的受精卵細胞的過程(Dodeman， et al.，1997)。體細胞胚適于經根癌農桿菌(Agrobacterium tuniefaciens)轉化(Mathewset al.，1992)、顯微注射(Neuhaus et al.，1987)和顆粒轟擊(Wilde et al.，1992)。另外，體 細胞胚或體細胞胚胎發生愈傷組織可以用液氮冷凍保存而不喪失生存力。它們是保持種質 及細胞胚胎發生的理想材料。體細胞胚在來源上是克隆的，因此用體細胞胚繁殖可以具有非常高的無性增加速 率的潛力，并因此有顯著商業價值。經體細胞胚胎發生的再生是植物組織培養的有吸引力 的選擇。體細胞胚據報道提供比枝(Shoot)更穩定的再生體(regenerant)。使用體細胞胚的再生系統的另一個優勢是它們表觀單細胞來源。這意味著再生體不可能是嵌合來源的， 因為如果再生體源自一簇細胞而非單細胞，則植物組織可能是嵌合的或者不穩定的并且產 生非正常型。體細胞胚胎發生還被成功用于許多植物物種如香蕉和松樹的大量繁殖(C0te et al. ,2000 ；Merkle and Dean，2000)。體細胞胚可以制成合成種子，以降低運輸成本和油 料種子競爭(Conrad，1996)。迄今為止，已經揭示了大量體細胞胚胎發生方案。一些實例如下=Eudeset al. (2006) (Pooidaea)、Kasha and Simion (2001，2004)(谷物)、Xie and Hong (2004) (Acacia mangium)、Guiltinan et al. (2001)(可可)、Trolinder et al. (1999)(棉花)、 Rutter et al. (1998a，1998b)(針葉樹)、Handley and Levis (1998)(針葉樹)、Chee (1991， 1997)(南瓜)、Becwar et al. (1995，1996)(針葉樹)、Genovesiand Yingling(1995)(玉 米)、Collins et al. (1991) (Glycine species)、Cooley andWilcox (1987)(向日葵)、 Schoofs et al. (1998)(香蕉)、Jouenne et al. (1995)(葡萄)、Garay et al. (2003) (agave tequilana weber) >Sondahl et al. (1993)(可可)、Armstrong and Deboer (2000) (棉花)、TuIi and Mithilesh (2005)(棉花)、Seabrook and Douglas (1999)(馬鈴薯)、 Buffard-Morel et al. (1994)(椰子樹)以及Cai and Ji (2005)(棉花)。如本文例證，可以 使用各種外植體。然而，無可通用的培養基、培養條件和再生程序。例如，Fki，et al. (2003) 描述了用未成熟開花期的用于棗椰樹(Phoenix dactylifera)的方案，其中體細胞胚胎發 生(易碎愈傷組織)在補加高濃度2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4-D)(10mg/l)、30mg/l腺嘌呤、 100mg/l 谷氨酰胺、2mg/l 甘氨酸、30mg/l Fe-EDTA、100mg/lKH2P04、100mg/l 肌醇的 MS 培養 基上起始，并且通過將固體或者液體培養基中2，4-D降低至lmg/1而實現進一步的胚進展。 相反，Cai and Ji (2005)揭示了棉花愈傷組織的體細胞胚胎發生的起始，這是在具有極低 濃度2，4-D和激動素(0. 05mg/l 2,4-D和0. lmg/1激動素)的更簡單的培養基中從根外植 體中誘導的，在愈傷組織起始后通過將其暴露于無激素的高硝酸鹽培養基中進行。此外，甚 至在相同物種的栽培品種之間也可發現顯著改變。對于麻風樹的體細胞胚胎發生的研究非常有限。近年來，報道了使用葉組織對麻 風樹的體細胞胚胎發生的初步研究結果(Jha et al.，2007)。盡管作者使用激動素和吲哚 丁酸(IBA)組合成功地誘導了體細胞胚胎發生，但是僅2%以下的體細胞胚能轉化為可存 活植物。此外，使用該方法的完整有性生命循環有待證實。顯然，盡管嘗試使用三種種質集 合、包括一種來自印度的種質，我們仍未能用相同方案和外植體在麻風樹中誘導體細胞胚 胎發生。因此，需要體細胞胚胎發生方法及制備胚胎發生液體懸浮培養物的方法，從中可 以實現有性可育麻風樹植物的高效植物再生和生產。發明概述本發明涉及體外再生麻風樹屬屬植物、更特別是麻風樹及其人工雜種的方法。本 發明更特別涉及體細胞胚胎發生和制備胚胎發生液體懸浮培養物的方法，從中可以實現有 性可育麻風樹植物的高效植物再生和生產。這些方法也使得可以高效轉化這種植物。一方面，本發明提供了從外植體中生產體細胞胚的方法，所述外植體得自麻風樹 的合子胚。根據這個方面，將所述外植體置于含有生長素的固體培養基上。可任選補加低 濃度的細胞因子。許多已知的培養基如MS鹽、B5鹽和FNL鹽與MS維生素或者B5維生素的組合對于這種方法是有效的。由此誘導的體細胞胚通常以相似大小的1-2個單獨胚存 在，在此被稱作I型體細胞胚(TISE)。在高濃度生長素條件下，可以從TISE中產生次生體 細胞胚。如果最初的培養基含有低濃度生長素，則TISE可以直接萌發。或者，它們可以在 另一個不含激素及任選補加氨基酸的培養基上成熟。體細胞胚的萌發可以用赤霉酸(GA3) 在1/2或者1/4強度MS或者B5培養基中改良。萌發的胚可以在培養基中進一步發育2-6 周，之后移植至盆栽土壤中。第二方面，本發明提供了產生體細胞胚和胚胎發生愈傷組織的方法。根據這個方 面，使用兩步誘導方法，其中從合子胚切下外植體并且在包含生長素的第一固體培養基中 培養。可任選加入細胞因子。在2-6周、優選2-4周后將如此誘導的外植體移至第二固體 培養基中。第二固體培養基不含激素，任選補加氨基酸。許多已知培養基如MS鹽、B5鹽和 FNL鹽組合MS維生素或者B5維生素在誘導體細胞胚中是有效的，所述胚通常以不同大小 的5個以上的胚群簇存在，在此稱作II型體細胞胚(TIISE)。TIISE可以繁殖為胚胎發生 愈傷組織。這些材料是植物繁殖和轉化的理想材料。優選將成熟的體細胞胚在具有GA3的 1/2或者1/4強度培養基如MS鹽與MS維生素的培養基中萌發。萌發小植物可以在培養基 中進一步發育，之后移植至盆栽土壤中。第三方面，本發明提供了制備胚胎發生液體懸浮培養物的方法。根據這個方面，將 如上述制備的胚胎發生愈傷組織或者TIISE移至液體培養基中，每2-3周定期傳代培養。所 述液體培養基可以是MS鹽、B5鹽和FNL鹽與MS維生素或者B5維生素的組合之一。在所 述液體培養基中優選補加氨基酸。所述培養基中優選包含生長素。長度超過0.5cm的體細 胞胚優選在傳代培養期間通過篩選除去。培養物保持在搖動平臺上，光照16小時。這個液 體培養系統非常適于制備大批量同步體細胞胚，其可以用于植物繁殖以及用作遺傳轉化的 外植體。第四方面，本發明提供了培養某時期的體細胞胚以再起始胚胎發生發育途徑的方 法。根據這個方面，將在液體培養基中繼續成熟至不適于起始新的胚胎發生愈傷組織的體 細胞胚的部分在具有高濃度生長素的固體培養基上進一步培養，隨后移至進一步補加游離 氨基酸的無激素固體培養基中。本發明的這個方面是液體懸浮培養系統的實際補充，提供 了進行遺傳轉化的大量外植體。第五方面，本發明提供了維持液體懸浮培養物的方法，由此愈傷組織的量增加以 及胚的萌發被抑制。根據這個方面，將體細胞胚胎發生愈傷組織維持在液體維持培養基中 懸浮培養及通常每2-3周定期傳代培養。所述液體維持培養基優選是含有MS鹽和B5維生 素的無NH4NO3培養基。也可以使用其它培養基如B5鹽與B5維生素、或者FNL鹽與B5維生 素，但是效果不佳。在所述液體培養基中優選補加氨基酸。所述培養基中優選包含生長素。 所述液體培養基進一步補加聚乙二醇(PEG)。在所述液體維持培養基中培養使得愈傷組織 的量增加。將這種愈傷組織更均一地維持在球狀期或者魚雷(torpedo)期。所述培養基抑 制胚的萌發。本發明的方法包括完整有效的系統，其可用于再生麻風樹屬植物、特別是麻風樹 種及其人工雜種。通過這個系統已經產生許多體細胞胚，且已經證實再生體在植物性生長 發育和有性預生產(sexual preproduction)中完全正常。附圖簡述


圖1A-1D示出I型體細胞胚(TISE)形成。所有外植體均在具有MS鹽、B5培養基、 2. 2g/l phytagel、pH5. 8的培養基中培養。激素水平變化。比例尺表示1mm。圖IA 在具 有5mg/l 2，4-D和0. lmg/1激動素的培養基中培養40天后從長度為0. 6cm的子葉中起始 的體細胞胚。圖IB 源自胚乳-下胚軸交界處的體細胞胚和次生體細胞胚。外植體在具有 0. 2g/l 2，4-D和0. lmg/1激動素的培養基中培養70天。圖IC 源自長度為1. 5cm的合子 胚的胚乳外植體的TISE，所述合子胚已經在具有0. 2g/l 2，4-D和0. lg/1激動素的培養基 中培養40天。圖ID 源自胚乳-下胚軸交界處的TISE。外植體在具有0.2g/l 2，4_D和 0. lg/1激動素的培養基中培養21天。圖2示出II型體細胞胚(TIISE)的形成。誘導下胚軸外植體形成TIISE，其在DGA 培養基中分化，在G13培養基中萌發。比例尺表示1mm。圖3A-3E示出植物再生階段。圖3A 在G13培養基中萌發一個月的體細胞胚。圖 3B:小植物在1/2強度MS培養基(具有15g/l蔗糖)中進一步發育一個月。圖3C:從TIISE 中再生的麻風樹植物。圖3D:圖3C的特寫，示出花。圖3E:圖3C的特寫，示出成熟果實。圖4A-4D示出谷氨酰胺、天冬酰胺和KNO3的作用。將體細胞胚暴露于修飾DGA培 養基，4周后照相。圖4A:無谷氨酰胺，0.25g/l天冬酰胺。圖4B:無谷氨酰胺，0.25g/l天 冬酰胺，KNO3增加至2. 85g/l。圖4C 0. 5g/l谷氨酰胺，0. 25g/l天冬酰胺。圖4D 圖4C的 放大圖(方框區)，示出次生胚的大量產生和胚胎發生愈傷組織的形成。D中的比例尺代表 Icm0圖5A-5D示出胚胎發生液體懸浮培養物。將在固體DGA培養基中產生的大約50mg 胚胎發生愈傷組織接種于20ml修飾的DGA液體培養基中。在接種之前除去大于2mm的胚。 每兩周進行傳代培養。2次傳代培養后照相。圖5A:20g/l蔗糖，lg/Ι谷氨酰胺，0.5g/l天 冬酰胺，無2，4-D。圖5B :20g/l蔗糖，lg/Ι谷氨酰胺，0. 5g/l天冬酰胺，0. 2g/l 2，4-D。圖 5C :30g/l 蔗糖，lg/Ι 谷氨酰胺，0. 5g/l 天冬酰胺，0. 2g/l 2，4-D。圖 5D :20g/l 蔗糖，lg/1 谷氨酰胺，0.5g/l天冬酰胺，lg/1 2，4-D。箭頭表示非胚胎發生球形愈傷組織。比例尺表示 Icm0圖6示出PEG對于維持液體懸浮培養物的作用。將體細胞胚發生愈傷組織維持 在無NH4NO3的MS培養基、B5維生素、20g/l蔗糖、1. 9g/l KNO3 (全部)、0. 5g/l谷氨酰胺、 0. 25g/l天冬酰胺、0. 3mg/l 2，4_D中。取大約200mg愈傷組織，在樣品培養基或者在分別 補加5%、10%和20%PEG8000的培養基中培養。每兩周傳代培養該培養物。在第8周，確 定全部愈傷組織量。圖中示出愈傷組織量的凈增加。圖中示出三個獨立實驗的平均值。發明詳述本發明涉及體細胞胚產生領域，特別涉及通過體細胞胚胎發生再生麻風樹屬的方 法。本發明更特別涉及再生麻風樹植物的方法和培養基組合物。所述方法非常適于麻風樹 轉化及產生克隆種植原種用于麻風樹大規模種植。通過體細胞胚胎發生繁殖是指在體外從小部分植物組織或者個體細胞中產生胚 的方法。所述胚被稱作體細胞胚，因為其衍生自體細胞(營養性)組織，而不是衍生自有性 生殖過程。通過體細胞胚胎發生的無性繁殖具有捕獲極其希望的基因型的所有遺傳獲得量 的能力。此外，這些方法易于順應自動化和機械化。最后，植物的高效轉化可以使用體細胞 胚胎發生再生轉化的細胞實現。
在本發明的一方面，體細胞胚通過在外植體組織上誘導體細胞胚形成而產生。在 一個實施方案中，從得自麻風樹屬植物的合子胚的外植體中誘導體細胞胚。根據這個實施 方案，將外植體置于含有生長素的固體培養基上。優選所述外植體是從合子胚中分離的胚 乳組織。所述合子胚的長度為大約0. 3cm到大約1. 5cm，優選大約0. 5cm到大約1. 5cm，更 優選大約0.5cm到大約1.0cm。在一個實施方案中，在這種組織中有效誘導體細胞胚的生 長素是2，4-D，其濃度在廣泛的范圍內，例如大約0. lmg/1至大約20mg/l，優選大約1. Omg/ 1至大約5mg/l。所述培養基可任選補加低濃度細胞因子。在一個實施方案中，可包含的 細胞因子是激動素，其濃度為例如大約0. 05mg/l至大約lmg/1。許多已知的培養基可以用 作固體培養基，對于本發明的這個方面是有效的。合適的培養基例子包括MS鹽、B5鹽或者 FNL鹽與MS維生素或者B5維生素的組合。在一個實施方案中，所述含有生長素的培養基不 含NH4NO315在一個實施方案中，所述外植體在黑暗中培養。在另一個實施方案中，所述外植 體在光照和黑暗條件下分段培養。由此誘導的體細胞胚通常以相似大小的1-2個單獨胚存 在，在此被稱作I型體細胞胚(TISE)。在高濃度生長素條件下，例如在大約1. Omg/1至大 約5mg/l，可以從TISE中產生次生體細胞胚。如果最初的培養基含有低濃度的生長素如2， 4-D如大約0. lmg/1至大約1. Omg/1的2，4-D，則根據本發明的這個方面產生的TISE可以 直接萌發。或者，TISE可以在不含有激素但補加一或多種氨基酸的另一種培養基上成熟。在 一個實施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺或者谷氨酰胺與天冬酰胺的組合。在 一個實施方案中，這個成熟培養基中的谷氨酰胺的濃度可例如是大約0. 25g/l至大約2g/ 1，優選大約0. 5g/l至大約1. Og/Ι，更優選大約0. 5g/l至大約0. 75g/l。在一個實施方案 中，這個成熟培養基中天冬酰胺的濃度可例如是大約0. lg/Ι至大約lg/Ι，優選大約0. Ig/ 1至大約0. 75g/l，更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l。在另一個實施方案中，所述氨基 酸是酪蛋白水解物。這個成熟培養基中酪蛋白水解物的濃度可例如是大約50mg/l至大約 1，000mg/l，優選大約100mg/l至大約500mg/ml，更優選大約100mg/l至大約200mg/l。然后將體細胞胚移至萌發培養基中。體細胞胚的萌發可以通過使用1/2或者1/4 強度MS或者B5培養基的培養基用赤霉酸(GA3)改善。在一個實施方案中，GA3是例如大約 0. 5mg/l至大約10mg/l，優選大約lmg/1至大約5mg/l，更優選大約2mg/l至大約3mg/l。萌 發的胚可以在這個培養基中進一步發育2-6周，之后移植至盆栽土壤中。膠凝劑如瓊脂和 phytagen在制備固體培養基的應用為本領域技術人員熟知。在一個實施方案中，優選的膠 凝劑是Phytagel。在這個實施方案中，phytagel的量在例如大約2. 2g/l至大約2. 8g/l之 間。在本發明的第二方面，體細胞胚通過兩步誘導方法從麻風樹屬外植體組織中誘導 體細胞胚形成而產生。根據這個方面，外植體在含有生長素的第一培養基中培養。在一個 實施方案中，所述外植體從合子胚中切下。所述合子胚長度為大約0.3cm至大約1.5cm，優 選大約0. 5cm至大約1. 5cm，更優選大約0. 5cm至大約1. Ocm0在第二個實施方案中，外植 體從魚雷期后(post-torpedo)體細胞胚中切下。在一個實施方案中，得自合子胚或者魚雷 期后體細胞胚的外植體是下胚軸組織或者根端組織。在一個實施方案中，在這種組織中有 效誘導體細胞胚的生長素是2，4-D，其濃度范圍例如是大約0. 5mg/l至大約10mg/l，優選大 約2mg/l至大約5mg/l。所述培養基可任選補加低濃度細胞因子。在一個實施方案中，可包
10含的細胞因子是激動素，濃度為例如大約0. 05mg/l至大約lmg/1。所述外植體在含有生長 素的培養基上培養一段足以起始胚胎發生愈傷組織的時間。在一個實施方案中，在含有生 長素的培養基上的培養時間為大約1周至大約8周，優選大約2周至大約6周，更優選大約 2周至大約4周。然后將胚胎發生愈傷組織和/或外植體移至第二固體培養基上成熟。該第二固體 培養基無激素，補加了一或多種氨基酸。在一個實施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬 酰胺或者谷氨酰胺與天冬酰胺的組合。在一個實施方案中，谷氨酰胺的濃度可以是例如大 約0. 2g/l至大約2g/l，優選大約0. 2g/l至大約1. 5g/l，更優選大約0. 5g/l至大約1. Og/ 1。在一個實施方案中，天冬酰胺的濃度可以例如是大約0. lg/Ι至大約1. 5g/l，優選大約 0. 2g/l至大約1. Og/Ι，更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l。在另一個實施方案中，所述 氨基酸是酪蛋白水解物。這個培養基中酪蛋白水解物的濃度可例如是大約50mg/l至大約 1，000mg/l，優選大約100mg/l至大約500mg/ml，更優選大約100mg/l至大約200mg/l。在 一個實施方案中，第二培養基(即無激素培養基)不含NH4NO315在一個實施方案中，所述第 二培養基還含有碳水化合物來源以改善體細胞胚成熟。在一個實施方案中，所述碳水化合 物可以是蔗糖和/或麥芽糖。蔗糖的量可以是大約10g/l至大約20g/l。麥芽糖的量可以 是大約20g/l至大約60g/l。許多已知培養基可用于所述每種固體培養基(即含有生長素 的培養基和無激素培養基)，對于本發明的這個方面是有效的。合適的培養基例子包括MS 鹽、B5鹽或者FNL鹽與MS維生素或者B5維生素的組合。由此誘導的體細胞胚通常以不同 大小的5個以上的胚群簇存在，在此稱作II型體細胞胚(TIISE)。TIISE在含有2，4-D的 培養基上持續培養導致胚胎發生愈傷組織產生。TIISE和胚胎發生愈傷組織是植物大量繁 殖和轉化的理想材料。然后將體細胞胚移至培養基上萌發。體細胞胚的萌發可以通過使用1/2或者1/4 強度MS或者B5培養基用赤霉酸(GA3)改善。在一個實施方案中，GA3的濃度是例如大約
0.5mg/l至大約10mg/l，優選大約lmg/1至大約5mg/l，更優選大約2mg/l至大約3mg/l。萌 發的胚可以在這個培養基中進一步發育2-6周，之后移植至盆栽土壤中。膠凝劑如瓊脂和 Phytagen在制備固體培養基中的應用為本領域熟知。在一個實施方案中，優選的膠凝劑是 phytagel。在這個實施方案中，phytagel的量例如是大約2. 2g/l至大約2. 8g/l。在本發明的第三方面，從根據本發明第二方面產生的胚胎發生愈傷組織或者 TIISE中產生胚胎發生液體懸浮培養物。在一個實施方案中，將所述胚胎發生愈傷組織或 者TIISE移至液體培養基中，每2-3周定期傳代培養。許多已知的培養基可用于液體培養 基，在本發明的這個方面有效。合適的培養基例子包括MS鹽、B5鹽或者FNL鹽與維生素MS 或者B5維生素的組合。在一個實施方案中，所述液體培養基補加一或多種氨基酸。在一個 實施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺或者谷氨酰胺與天冬酰胺的組合。在一個實 施方案中，谷氨酰胺的濃度可以是例如大約0. lg/Ι至大約2g/l，優選大約0. 2g/l至大約
1.5g/l，更優選大約0. 5g/l至大約1. Og/Ι。在一個實施方案中，天冬酰胺的濃度可以是例 如大約0. lg/Ι至大約2g/l，優選大約0. 25g/l至大約1. Og/Ι,以及更優選大約0. 25g/l至 大約0. 5g/l。在一個實施方案中，所述液體培養基含有生長素。在一個實施方案中，在所述 液體懸浮培養系統中有效的生長素是2，4-D，其濃度是例如大約0. lmg/1至大約0. 5mg/l, 優選大約0. 2mg/l至大約0. 3mg/l。在一個實施方案中，所述液體培養基已經被修飾為不含有NH4NO3鹽。長度超過0.5cm的體細胞胚優選在傳代培養期間通過篩選取出。如本文所述 使體細胞胚成熟和萌發。在一個實施方案中，將培養物以60-100rpm、優選70-90rpm、更優 選SOrpm保持在搖動平臺上。在一個實施方案中，將培養物保持在大約20°C至35°C，更優 選大約28°C的溫度下。在一個實施方案中，將培養物在光照和黑暗中分階段培養，優選16 小時光照。所述液體培養系統非常適于大批量制備同步體細胞胚，其可用于植物繁殖及作 為遺傳轉化外植體。在上述條件下，一部分體細胞胚可繼續成熟至不適于在液體培養基中起始新的胚 胎發生愈傷組織的階段。如果這些材料是在設計為提供再起始的固體培養基中進一步成 熟，則其是再起始胚胎發生發育途徑的極佳材料。在一個實施方案中，所述材料首先在含有 高濃度生長素的固體培養基上培養，隨后在無激素而進一步補加氨基酸的固體培養基上培 養。在一個實施方案中，有效的生長素是2，4-D，其濃度例如是大約0. lmg/1至大約20mg/l， 優選大約1. Omg/1至大約5mg/l。在一個實施方案中，所述氨基酸是谷氨酰胺、天冬酰胺或 者谷氨酰胺與天冬酰胺的組合。在一個實施方案中，谷氨酰胺的濃度可以是例如大約0. 2g/ 1至大約2g/l，優選大約0. 2g/l至大約1. 5g/l，更優選大約0. 5g/l至大約1. Og/Ι。在一 個實施方案中，天冬酰胺的濃度可以是例如大約0. 2g/l至大約1. 5g/l，優選大約0. 2g/l至 大約1. Og/Ι，更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l。這個實施方案是所述液體懸浮培養系統 的實際補充，可以提供用于遺傳轉化的大量外植體。第四方面，本發明提供了維持液體懸浮培養物的方法，由此愈傷組織量增加而胚 萌發被抑制。根據這個方面，體細胞胚胎發生愈傷組織在液體維持培養基中維持懸浮培養 以及每2-3周定期傳代培養。所述液體維持培養基是無NH4NO3培養基，其含有MS鹽和B5 維生素。也可以使用其它培養基如B5鹽與B5維生素，或者FNL鹽與B5維生素。在一個實 施方案中，所述液體維持培養基優選補加一或多種氨基酸。在一個實施方案中，所述氨基酸 是谷氨酰胺、天冬酰胺或者谷氨酰胺與天冬酰胺的組合。在一個實施方案中，谷氨酰胺的濃 度可以是例如大約0. lg/Ι至大約2g/l，優選大約0. 2g/l至大約1. 5g/l，更優選大約0. 5g/ 1至大約1. Og/Ι。在一個實施方案中，天冬酰胺的濃度可以是例如大約0. lg/Ι至大約2g/ 1，優選大約0. 25g/l至大約1. Og/Ι，更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l。在一個實施方案 中，所述液體維持培養基優選含有生長素。在一個實施方案中，在所述液體維持培養系統中 有效的生長素是2，4-D，其濃度例如是大約0. lmg/1至大約0. 5mg/l，優選大約0. 2mg/l至 大約0.3mg/l。在一個實施方案中，所述液體維持培養基進一步優選補加聚乙二醇(PEG)。 在一個實施方案中，培養基中PEG的濃度可以是例如大約至大約15%，優選大約3%至 大約10%，更優選大約3%至大約7%。在一個實施方案中，PEG適于植物組織培養。在一 個實施方案中，PEG的平均分子量可以是例如大約1，000至大約15，000，優選大約1，000至 大約10，000，更優選大約5，000至大約10，000。在液體維持培養基中培養使得愈傷組織的 量增加。將這種愈傷組織更均一地維持在球形期或者魚雷期。所述培養基抑制胚的萌發。本發明可以使用麻風樹屬成員的植物實施，優選使用麻風樹或者含有大量 麻風樹的基因組DNA的麻風樹人工雜種。這種人工雜種的例子是麻風樹與琴葉珊瑚 (J. intergerima)的 Fl 代及其回交子代(Sujatha and Prabakaran，2003)。本發明提供了 可用于再生麻風樹屬植物的完整有效的系統。通過這些系統已經產生許多體細胞胚，而且 已經證實再生體在無性發育和有性繁殖中是完全正常的，即獲得有性可育植物。
此外，本發明提供了可用于轉化麻風樹屬植物的系統。轉化/轉染方法對于麻風 樹屬植物的轉化不是關鍵的，目前可利用各種轉化或者轉染方法。可利用更新的方法直接 轉化谷物或者其它宿主細胞。因此，已經揭示了許多方法將DNA序列插入宿主細胞的基 因組中以獲得該序列的轉錄和/或翻譯，實現生物體中表型改變。因此，可以使用有效轉 化 / 轉染的任何方法。見例如 Mathews et al. (1992)、Neuhaus et al. (1987)、Wilde et al. (1992)、美國專禾IJ No. 7，241，937,7, 273，966和7，291，765以及美國專利申請出版物 No. 2007/0231905 和 2008/0010704 所述。也見國際公開申請 No. W02005/103271 所述。在一個實施方案中，可以使用本領域熟知技術將外植體組織與攜帶含有感興趣的 基因或者核酸的DNA構建體的農桿菌菌株共培養。可以使用本領域熟知的常規技術選擇轉 化的組織。在另一實施方案中，可以使用本領域熟知的技術將胚胎發生液體懸浮培養物與 攜帶含有感興趣的基因或者核酸的DNA構建體的農桿菌菌株共培養。可以使用本領域熟知 的常規技術選擇轉化的組織。在再一個實施方案中，可以使用常規技術如顆粒轟擊將所述 DNA導入外植體組織或者胚胎發生液體懸浮培養物細胞中。轉化的組織可以通過使用本領 域熟知的常規技術選擇。轉化或者轉基因植物可以通過使用本文所述方法再生。相似地，插入麻風樹屬植物中的DNA (感興趣的DNA)對于轉化過程不是關鍵的。通 常導入植物中的DNA是構建體的一部分。所述DNA可以是感興趣的基因，例如蛋白質的編碼 序列，或者其可以是能調節基因表達的序列，如反義序列、有義阻抑序列或者miRNA序列。 所述構建體典型包含調節區，其與感興趣的DNA的5’末端和/或感興趣的DNA的3’末端可 操縱地連接。含有所有這些元件的盒在本文也被稱作表達盒。所述表達盒在表達盒構建體 中可另外含有5’前導序列。調節區(即啟動子、轉錄調節區以及翻譯終止區)和/或編碼 信號錨的多核苷酸對于宿主細胞或者彼此是天然/相似的。或者，調節區和/或編碼信號 錨的多核苷酸與宿主細胞或者彼此可以是異源的。見美國專利No. 7，205，453和美國專利 申請出版物No. 2006/0218670和2006/0248616所述。所述表達盒可另外含有選擇標記基 因。見美國專利No. 7，205，453和美國專利申請出版物No. 2006/0218670和2006/0248616 所述。通常，所述表達盒包含用于選擇轉化的細胞的選擇標記基因。選擇標記基因用 于選擇轉化的細胞或者組織。通常，植物選擇標記基因編碼抗生素抗性，合適的基因包括 至少一組如下合適基因編碼抗生素壯觀霉素抗性的基因、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸 轉移酶(SPt)基因、編碼卡那霉素或者遺傳霉素抗性的新霉素磷酸轉移酶(nptll)基因、 編碼潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶(hpt或者aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。 或者，植物選擇標記基因編碼除草劑抗性如對磺酰脲型除草劑、草丙磷(glufosinate)、 草甘膦(glyphosate)、銨、溴苯腈、咪唑啉酮以及2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)的抗性，包 括編碼除草劑抗性的基因，其作用是抑制谷氨酰胺合酶如草胺膦或者basta的作用(例 如bar基因)。通常見WO 02/36782、美國專利No. 7，205，453和美國專利申請出版物 No. 2006/0248616和2007/0143880及其中引用的那些參考文獻所述。選擇標記基因的列表 非限于此。可以使用任何選擇標記基因。許多啟動子可用于實施本發明。可以基于希望的結果選擇啟動子。即核酸可以 與組成型、組織優選或者其它啟動子組合以在感興趣的宿主細胞中表達。這種組成型啟動 子包括例如Rsyn7的核心啟動子(W099/48338和美國專利No. 6，072, 050)、CaMV35s啟動子(Odell et al.，1985)、水稻肌動蛋白(McElroy et al.，1990)、遍在蛋白(Christensen and Quail, 1989 andChristensen et al.，1992)、pEMU(Last et al.，1991)、MAS(Velten et al.，1984)、ALS啟動子(美國專利No. 5，659，026)等。其它組成型啟動子包括例如在美國 專利 No. 5，608，149,5, 608，144,5, 604，121,5, 569，597,5, 466，785,5, 399，680,5, 268，463 和 5，608，142 所述。其它啟動子包括可誘導啟動子，特別是病原體可誘導啟動子。這種啟動子包括來 自發病相關蛋白(ra蛋白)的那些啟動子，其在感染病原體后被誘導，例如ra蛋白、SAR 蛋白、0-1，3-葡聚糖酶、殼多糖酶等。其它啟動子包括在病原體感染部位局部或者附近 表達的那些啟動子。在進一步的實施方案中，啟動子可以是創傷可誘導啟動子。在其它實 施方案中，可以使用化學調節的啟動子以通過應用外源化學調節劑調節基因在植物中的表 達。所述啟動子可以是化學可誘導啟動子，其中應用化合物誘導基因表達；或者是化學可 阻抑啟動子，其中應用化合物阻抑基因表達。此外，組織優選的啟動子可用于在特定植物組 織內靶向增強感興趣的多核苷酸表達。這些啟動子在美國專利No. 6，506，962,6, 575，814、 6，972，349和7，301，069以及在美國專利申請出版物No. 2007/0061917和2007/0143880中 描述。感興趣的DNA可以適當地優化以增加在轉化的植物中表達。即可以使用植物優選 的密碼子合成編碼序列以改良表達。本領域可獲得合成植物優選的基因的方法。見例如美 國專利 No. 5，380，831,5, 436，391 和 7，205，453 以及美國專利申請出版物No. 2006/0218670 和 2006/0248616 所述。除非特別指出，可以使用本領域技術人員已知的常規化學、分子生物學、微生 物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養和轉基因生物學等方法實 施本發明。見例如 Maniatis et al, 1982, MolecularCloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork)、 Sambrook et al,1989, Molecular Cloning,2nd Ed. (Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York)、Ausubel et al,1992, Current Protocols in MolecularBiology(John Wiley&Sons, including periodic updates)、 Glover, 1985, DNACloning(IRL Press, Oxford) > Russell, 1984, Molecular biology of plants :alaboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y. ) >Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York,1992)、Guthrie and Fink, Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology (Academic Press, New York,1991)、Harlow and Lane,1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、 Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames&S. J. Higgins eds. 1984)、Transcription And Translation(B. D. Hames&S. J. Higgins eds.1984)、Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc. ,1987)> ImmobilizedCells And Enzymes(IRL Press, 1986)、B. Perbal, A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984) ；the treatise, Methods In Enzymology (AcademicPress, Inc. , N. Y. ) > Methods In Enzymology, Vols.154 and 155(Wu et al. eds. ), Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker, eds. , Academic Press, London,1987)、Handbook Of Experimental Immunology, Volumes HV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds. ,1986)> Riott, Essentiallmmunology,6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988、Fireet al. , RNA Interference Technology :From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge,2005 ；Schepers, RNA Interference inPractice, ffiley-VCH,2005 ；Engelke, RNA Interference(RNAi) :The Nuts&Bolts of si RNA Technology, DNA Press, 2003 ；Gott, RNA Interference, Editing, and Modification :Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology), Human Ptess,Totowa,NJ,2004、Sohail,Gene Silencing by RNA Interference :Technology and Application, CRC, 2004 所述。
實施例參考如下實施例描述本發明，所述實施例只是舉例說明本發明，無任何限制之意。 利用本領域熟知的標準技術或者在下文特別描述的技術。實施例1培養基5K :MS 鹽、B5 維生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel、5mg/l 2，4_D、0. lmg/1 激動 素，pH 5. 8。10K :MS 鹽、B5 維生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel、10mg/l 2，4_D，0. lmg/1 激動 素，pH 5. 8。d20 :MS 鹽、B5 維生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel、2，4_D 20mg/12，4_D，pH 5. 8。EGA0 缺乏 NH4N03(NH4N03_deficient)的 MS 鹽、B5 維生素、30g/l 葡萄糖、2. 4g/l phytagelUg/1谷氨酰胺、0. 5g/l天冬酰胺。EGAh 缺乏 NH4N03 的 MS 鹽、B5 維生素、30g/l 蔗糖、2. 4g/l phytagel、lg/1 谷氨酰 胺、0. 5g/l 天冬酰胺、0. 95g/l KN03DGA 無 NH4N03 的 MS 鹽、B5 維生素、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytogel、lg/1 谷氨酰胺、 0. 5g/l 天冬酰胺，pH 5.8。G13 :MS 鹽、B5 維生素、3mg/l GA3、30g/l 蔗糖、2. 2g/l phytagel, pH 5. 8。G12-1 :1/2MS 鹽、1/2B5、0. 01mg/l 萘乙酸(NAA)、200mg/l 酪蛋白水解物、15g/l 蔗 糖、3g/l phytagel, pH 5. 8。MS培養基成分的一般描述見Murashige and Skoog (1962)，B5培養基成分的一般 描述見 Gamborg et al. (1968)。實施例2無菌外植體的組織培養條件和制備除非特別指出，將植物材料在90mm培養皿中培養，將其置于清潔房間中的光照架 子上，在28°C恒定溫度以16-8小時日-夜循環培養。用1-4個具有大約60-150 iimol/m2/ s光合作用光子流量(PPF)的Phillips Fluotone管(36W)提供光照。在播種進土壤中之后第5至第7天收獲幼苗。通過在10% H202中洗滌20分鐘及
15隨后用無菌水漂洗3次進行表面滅菌。發育中的果實通過在70%乙醇中浸泡30分鐘及隨 后在無菌水中洗滌3次而滅菌。在置于層流內的立體顯微鏡下用外科手術刀切下發育中的 種子和合子胚。在65mm塑料圓柱形容器中或者250ml玻璃錐形瓶中進行液體培養，所述容器置于 80rpm搖床中在28°C恒定溫度及16_8小時日_夜循環條件下培養。實施例3外植體對于誘導體細胞胚胎發生的作用我們檢測了各種外植體和激素濃度對于誘導麻風樹體細胞胚的作用。將在播種 于土壤中5-7天后收獲的幼苗進行表面滅菌，從萌發的種子中切下莖、葉、葉柄、子葉、下胚 軸，并且切成長度為大約0. 5cm。將外植體在許多固體培養基上培養，所述培養基含有MS鹽 和B5維生素，補加0-20mg/12，4-D、0-0. 01mg/l萘乙酸(NAA)和0-lmg/l細胞因子，如激動 素、6-芐基氨基嘌呤(BAP)、N6-(2-異戊烯基)腺嘌呤(2ip)、玉米素或者玉米素核苷。將 外植體和愈傷組織大約每兩周在相同培養基或者無激素培養基中傳代培養。具有二倍濃度 KN03(1.9g/l)的修飾的無NH4S04-培養基也用于傳代培養。在至少4個月后在所有檢測的 培養基中均未觀測到體細胞胚。實施例42,4-D對于合子胚外植體中體細胞胚胎發生的作用將發育中的果實表面滅菌。使用外科手術刀將未成熟的合子胚和胚乳(En)彼此 分離。將長度超過0. 5cm的合子胚在子葉_下胚軸交界處進一步切割，產生僅子葉外植體 及具有根radicals的下胚軸。將短于0. 5cm的合子胚完整培養，因為其太易碎。我們將這 些外植體分類為子葉(Cot)、有根radicals的下胚軸(Rh)、完整胚(Eb)和胚乳(En)。將外植體在包含MS鹽、B5維生素和0. 1至20mg/L的各種濃度2，4_D的固體培養 基上培養。在一些處理中加入0. lmg/L激動素。在大約第10天，體細胞胚開始出現，無明 顯愈傷組織形成跡象，其主要在已經分離胚的胚乳組織邊緣形成。體細胞胚最可能源自附 著于胚乳上的合子胚組織的剩余二倍體細胞。在胚乳_合子胚交界處優先形成體細胞胚提 示胚乳組織也許提供為體細胞胚起始和發育必需的外部信號或者營養素。這些體細胞胚迅 速發育及主要成熟為單胚(
圖1)。我們稱其為I型體細胞胚(TISE)。盡管2，4-D在高水 平呈現出抑制性，但是在所有檢測的培養基中均觀測到TISE (表1)。表 12,4-D及培養基改變對于體細胞胚形成的作用
權利要求
通過體細胞胚胎發生再生麻風樹屬(Jatropha)可育植物的方法，包括(a)從麻風樹屬未成熟合子胚中分離胚乳組織；(b)在含有生長素的固體培養基上培養該胚乳組織一段足以誘導體細胞胚產生的時間；及(c)在固體萌發培養基上培養該體細胞胚一段足以使體細胞胚萌發產生小植物的時間。
2.權利要求1的方法，其進一步包括在步驟(b)之后及在步驟(c)之前的步驟(bl)在 固體成熟培養基上培養體細胞胚一段足以使該體細胞胚成熟的時間。
3.權利要求1或2的方法，其進一步包括在步驟(c)之后和步驟(d)之前的在培養基 上使小植物生根、使小植物適應盆栽土壤以及使小植物生長成開花植物的步驟。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述含有生長素的培養基含有2，4-D。
5.權利要求4的方法，其中含有生長素的培養基中2，4-D的濃度為大約0.lmg/1至大 約20mg/l，優選大約0. lmg/1至大約5mg/l。
6.權利要求1-5任一項的方法，其中含有生長素的培養基包含選自由MS鹽、B5鹽和 FNL鹽組成的組中的鹽。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中含有生長素的培養基不含NH4NO315
8.權利要求6或7的方法，其中所述培養基包含選自由MS維生素和B5維生素組成的 組中的維生素。
9.權利要求1的方法，其中胚乳組織在黑暗中培養。
10.權利要求1的方法，其中胚乳組織在光照和黑暗循環條件下培養。
11.權利要求1的方法，其中胚乳組織與攜帶DNA構建體的農桿菌菌株共培養。
12.權利要求2的方法，其中成熟培養基補加有大約0.25g/l至大約2g/l、優選大約 0. 5g/l至大約lg/Ι、更優選大約0. 5g/l至大約0. 75g/l的谷氨酰胺。
13.權利要求2的方法，其中成熟培養基補加有大約0.lg/Ι至大約lg/Ι、優選大約 0. lg/Ι至大約0. 75g/l、更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l的天冬酰胺。
14.權利要求2的方法，其中成熟培養基補加有大約50mg/l至大約1，000mg/l、優選大 約100mg/l至大約500mg/l、更優選大約100mg/l至大約200mg/l的酪蛋白水解物。
15.權利要求1的方法，其中萌發培養基含有大約0.5mg/l至大約10mg/l、優選大約 lmg/1至大約5mg/l、更優選大約2mg/l至大約3mg/l的GA3。
16.權利要求1的方法，其中合子胚的長度為大約0.3cm至大約1. 5cm,更優選長度大 約0. 5cm至大約1. 0cm。
17.通過體細胞胚胎發生再生麻風樹屬可育植物的方法，包括(a)在含有激素的固體培養基上培養麻風樹屬外植體一段足以使愈傷組織開始生長的 時間；(b)在無激素培養基上培養所述外植體或者愈傷組織一段足以發生體細胞胚或者胚胎 發生愈傷組織的時間；(c)在固體成熟培養基上培養所述體細胞胚一段足以使所述體細胞胚成熟的時間；及(d)在萌發培養基上培養所述成熟的體細胞胚一段足以使所述體細胞胚萌發產生小植 物的時間。
18.權利要求17的方法，其進一步包括在步驟(d)之后的步驟(e)使所述小植物在培 養基上生根、使所述小植物適應盆栽土壤以及使所述小植物生長為開花植物。
19.權利要求17或者18的方法，其中所述外植體是未成熟合子胚。
20.權利要求19的方法，其中所述合子胚的長度為大約0.3cm至大約1. 5cm，優選長度 大約0. 5cm至大約1. 0cm。
21.權利要求17或者18的方法，其中所述外植體是體細胞胚。
22.權利要求21的方法，其中所述體細胞胚是魚雷期后體細胞胚。
23.權利要求19-22任一項的方法，其中所述外植體是下胚軸和根端組織。
24.權利要求17-23任一項的方法，其中含有激素的培養基包含選自由MS鹽、B5鹽和 FNL鹽組成的組中的鹽。
25.權利要求24的方法，其中含有激素的培養基包含選自由MS維生素和B5維生素組 成的組中的維生素。
26.權利要求17-25任一項的方法，其中含有激素的培養基含有生長素。
27.權利要求26的方法，其中所述生長素是2，4-D。
28.權利要求27的方法，其中2，4-D的濃度為大約0.5mg/l至大約10mg/l，優選大約 2mg/l 至大約 5mg/l。
29.權利要求17-28任一項的方法，其中將所述外植體在含有激素的固體培養基上培 養大約1周至大約8周，優選大約2周至大約6周，更優選大約2周至大約4周。
30.權利要求17-29任一項的方法，其中無激素培養基含有硝酸鹽。
31.權利要求30的方法，其中所述無激素培養基含有大約0.5g/l至大約3.8g/lKNO3, 優選大約0. 95g/l至大約1. 9g/l KNO30
32.權利要求17-31任一項的方法，其中無激素培養基不含NH4NO315
33.權利要求17-32任一項的方法，其中無激素培養基補加有一或多種氨基酸。
34.權利要求33的方法，其中氨基酸是大約0.2g/l至大約2g/l、優選大約0. 2g/l至 大約1. 5g/l、更優選大約0. 5g/l至大約1. Og/Ι的谷氨酰胺。
35.權利要求33的方法，其中氨基酸是大約0.2g/l至大約1. 5g/l、優選大約0. 2g/l 至大約1. 0/1、更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l的天冬酰胺。
36.權利要求17-35任一項的方法，其中無激素培養基是固體培養基。
37.權利要求17-36任一項的方法，其中成熟培養基含有大約10g/l至大約20g/l蔗糖。
38.權利要求17-36任一項的方法，其中成熟培養基含有大約20g/l至大約60g/l麥芽糖。
39.權利要求17-38任一項的方法，其中萌發培養基含有大約0.5mg/l至大約5mg/l、 優選大約lmg/1至大約4mg/l、更優選大約2mg/l至大約3mg/l的GA3。
40.權利要求17-39任一項的方法，其中萌發培養基是1/2至1/4強度MS鹽和MS維生
41.權利要求17-40任一項的方法，其中所述外植體和愈傷組織任選用DNA構建體轉化。
42.建立麻風樹屬的植物體細胞胚胎發生液體懸浮培養物的方法，包括(a)在含有激素的固體培養基上培養所述麻風樹屬外植體一段足以使愈傷組織開始生 長的時間；(b)在無激素培養基上培養所述外植體或者愈傷組織一段足以發生體細胞胚或者胚胎 發生愈傷組織的時間；(c)在液體培養基上培養胚胎發生愈傷組織或者體細胞胚，產生體細胞胚胎發生愈傷 組織或者胚狀體；及(d)定期傳代培養及根據大小選擇體細胞胚胎發生愈傷組織或者胚狀體。
43.權利要求42的方法，其中所述外植體是未成熟合子胚。
44.權利要求43的方法，其中所述合子胚的長度為大約0.3cm至大約1. 5cm，優選長度 大約0. 5cm至大約1. 0cm。
45.權利要求42的方法，其中所述外植體是體細胞胚。
46.權利要求45的方法，其中所述體細胞胚是魚雷期后體細胞胚。
47.權利要求43-45任一項的方法，其中所述外植體是下胚軸和根端組織。
48.權利要求42-47任一項的方法，其中含有激素的培養基包含選自由MS鹽、B5鹽和 FNL鹽組成的組中的鹽。
49.權利要求48的方法，其中含有激素的培養基包含選自由MS維生素和B5維生素組 成的組中的維生素。
50.權利要求42-49任一項的方法，其中含有激素的培養基含有生長素。
51.權利要求50的方法，其中所述生長素是2，4-D。
52.權利要求51的方法，其中2，4-D的濃度為大約0.5mg/l至大約10mg/l，優選大約 2mg/l 至大約 5mg/l。
53.權利要求42-52任一項的方法，其中在含有激素的固體培養基上培養所述外植體 大約1周至大約8周，優選大約2周至大約6周，更優選大約2周至大約4周。 權利要求42-53任一項的方法，其中無激素培養基含有硝酸鹽。
54.權利要求53的方法，其中無激素培養基含有大約0.5g/l至大約3.8g/lKNO3，優 選大約0. 95g/l至大約1. 9g/l KNO30
55.權利要求42-54任一項的方法，其中無激素培養基不含NH4NO315
56.權利要求42-55任一項的方法，其中無激素培養基補加有一或多種氨基酸。
57.權利要求56的方法，其中氨基酸是大約0.2g/l至大約2g/l、優選大約0. 2g/l至 大約1. 5g/l、更優選大約0. 5g/l至大約1. Og/Ι的谷氨酰胺。
58.權利要求56的方法，其中氨基酸是大約0.2g/l至大約1. 5g/l、優選大約0. 2g/l 至大約1. 0/1、更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l的天冬酰胺。
59.權利要求42-58任一項地方法，其中無激素培養基是固體培養基。
60.權利要求42-59任一項的方法，其中液體培養物保持在搖動平臺上，優選保持在 60-100rpm。
61.權利要求42-60任一項的方法，其中液體培養物每天保持一定時間的光照。
62.權利要求42-61任一項的方法，其中所述液體培養基含有低濃度的生長素。
63.權利要求62的方法，其中所述生長素是2，4-D。
64.權利要求63的方法，其中2，4-D的濃度為大約0.lmg/1至大約0. 5mg/l，優選大約.0. 2mg/l 至大約 0. 3mg/l。
65.權利要求42-64任一項的方法，其中液體培養基含有一或多種氨基酸。
66.權利要求65的方法，其中所述液體含有大約0.lg/Ι至大約2.0g/l、優選大約 0. 2g/l至大約1. 5g/l、更優選大約0. 5g/l至大約1. Og/Ι的谷氨酰胺。
67.權利要求65的方法，其中所述液體培養基含有大約0.lg/Ι至大約2g/l、優選大約 0. 25g/l至大約lg/Ι、更優選大約0. 25g/l至大約0. 5g/l的天冬酰胺。
68.了要求42-67任一項的方法，其中所述液體培養基含有大約0. 5g/l至大約3. 8g/l KNO3，優選大約 0. 95g/l 至大約 1. 9g/l KNO30
69.權利要求42-68任一項的方法，其中所述液體培養基不含NH4NO315
70.權利要求42-69任一項的方法，其中所述液體培養基含有聚乙二醇(PEG)。
71.權利要求70的方法，其中PEG的分子量在大約1，000和大約10，000之間。
72.權利要求70的方法，其中PEG的濃度在大約和大約15%之間、優選在大約3% 和大約之間。
73.權利要求42-72任一項的方法，其中所述液體培養基含有選自由MS鹽、B5鹽和FNL 鹽組成的組中的鹽。
74.權利要求73的方法，其中所述液體培養基含有選自由MS維生素和B5維生素組成 的組中的維生素。
75.權利要求1-74任一項的方法，其中所述植物是麻風樹(Jatrophacurcas)。
76.權利要求1-74任一項的方法，其中所述植物是含有麻風樹的大量基因組DNA的人 工雜種。
全文摘要
本發明涉及體細胞胚胎產生領域，特別涉及通過體細胞胚胎發生再生麻風樹屬(Jatropha)的方法。更特別地，本發明涉及再生麻風樹(麻風樹)植物的方法和培養基組合物。本發明的方法非常適于麻風樹轉化和產生克隆種植原種，用于大規模麻風樹種植。
文檔編號A01G7/00GK101952447SQ200980103600
公開日2011年1月19日 申請日期2009年1月7日 優先權日2008年2月1日
發明者紀良輝, 蔡林 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司