拮抗植物病原菌的生防菌株及其用途
【專利摘要】本發明公開了一株拈抗植物病原菌的生防菌株及其用途;所述菌株為灰紅鏈霉菌Y1B(Streptomyces?griseoruber?Y1B)CCTCC?N0:M2013358。采用GYM培養基對該灰紅鏈霉菌Y1B進行發酵,收集發酵液,萃取并減壓蒸餾,制得發酵粗產品。該發酵粗產品,對水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌有較好的抑菌效果。
【專利說明】拮抗植物病原菌的生防菌株及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物防治和生物工程【技術領域】,具體涉及一株拈抗植物病原菌的生防菌株及其用途 。
【背景技術】
[0002]伴隨著農業經濟的迅猛發展,農業生產中的植物病蟲害防治越來越依賴于化學農藥的廣泛應用。但是在化學農藥大量使用的同時,環境污染問題也隨之而來,由此人們對現代農業的防治技術提出了更高的要求。生防農藥作為一種新型的綠色農藥,以其安全可靠、不污染環境、抗菌效果好的特點,近年來受到世界各國的廣泛關注,因此尋找有效的生防菌株也成為人們日益關注的熱點。
[0003]鏈霉菌可以產生多種抗生素,目前世界上已經發現的抗生素中,約有80%是由放線菌產生,其中又以鏈霉菌屬列居放線菌中最大的菌屬,該屬可產生1000多種抗生素。這些抗生素除了可以廣泛應用于醫藥領域,在農作物生產方面,還具有植物保護的用途。
[0004]鏈霉菌是一類活躍在植物根際的微生物,土壤中的許多鏈霉菌具有抑制植物病害、促進植物生長的作用,屬于植物根際促生菌。生防農藥中大部分是農用抗生素,具有毒性低、殘留少的特點,可以有效抑制植物病原菌的生長和繁殖。因此,鏈霉菌產生的農用抗生素在生防農藥中占有重要地位,多種鏈霉菌的次級代謝產物被研制成農用抗生素在生產上大力推廣,如井R霉素、春雷霉素、中生菌素等在植物病蟲害防治方面取得的效果得到了人們的公認。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一株拈抗植物病原菌的生防菌株及其用途;通過發酵該菌株制備粗產品,對植物病原菌有較好的防治效果。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]第一方面,本發明涉及一株拈抗植物病原菌的生防菌株,所述菌株為灰紅鏈霉菌YlB(Streptomyces griseoruber YlB)CCTCC NO:M2013358。
[0008]優選地,所述灰紅鏈霉菌YlB具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
[0009]第二方面,本發明涉及一種上述的拈抗植物病原菌的生防菌株在制備防治植物枯萎病生物農藥中的用途。
[0010]第三方面,本發明涉及一種生防菌株發酵粗產品的制備方法,采用GYM培養基對如權利要求1所述的灰紅鏈霉菌YlB進行發酵,收集發酵液,萃取并減壓蒸餾,即得所述發酵粗產品。
[0011]優選地,每1000mL GYM培養基中含有葡萄糖3~5g、酵母提取物2~6g、麥芽提取物8~12g、余量為水,pH7.0~8.0。
[0012]優選地,所述灰紅鏈霉菌YlB是通過如下步驟獲得的:采集水稻土壤樣品,土樣碾碎后放置在烘箱烘焙,稱取烘焙后的土樣溶于無菌水中,充分振蕩,制成不同濃度的土壤懸浮液,涂布于添加有0.05%~0.25% K2Cr2O7的高氏I號培養基平板上,待長出菌落后,挑單菌落于SFM固體培養基上純化,即得灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB)CCTCC NO:M2013358o
[0013]優選地,每1000mL高氏I號培養基中含有可溶性淀粉10~30g、KN030.8~1.2g、K2HPO40.3 ~0.6g、MgSO4.7Η200.4 ~0.8g、FeSO4.7Η200.008 ~0.012g、NaC10.4 ~0.6g、瓊脂18~24g、余量為水,ρΗ7.0~8.0。
[0014]優選地,每1000mL SFM培養基的制備包括如下步驟:取15~25g黃豆餅粉,加蒸餾水沸水煮20~40min,過濾黃豆餅粉液體,濾液中加甘露醇15~25g,固體培養基另加瓊脂18~25g,蒸餾水定容至1000mL, ρΗ7.0~8.0。
[0015]第四方面,本發明涉及一種上述的制備方法制得的生防菌株發酵粗產品在制備防治植物枯萎病生物農藥中的用途。
[0016]優選地,所述植物枯萎病為水稻枯萎病菌或西瓜枯萎病菌。
[0017]本發明具有的有益效果為:本發明制得的拈抗植物病原菌的生防菌株發酵粗產品,對水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌有較好的抑菌效果,相對抑菌率分別達到47.1%和30.9%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述,本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0019]圖1為本發明菌株灰紅鏈霉菌YlB(Streptomyces griseoruber YlB)的菌落形態圖;
[0020]圖2為本發明菌株的系統發育樹。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明,但不以任何形式限制本發明。應當指出的是,對本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明構思的前提下,還可以做出若干調整和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0022]本發明的灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB),該菌株已在中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏,保藏單位地址為:中國.武漢.武漢大學,郵編為:430072,保藏日期為:2013年8月I日,保藏編號為:CCTCC NO:M2013358。
[0023]本發明菌株的形態特征、培養特征、16SrDNA序列和菌種分類結果如下:
[0024]1、形態特征和培養特征:灰紅鏈霉菌YlB革蘭氏染色呈陽性,孢子橢圓形,孢子絲緊密螺旋形。在SFM固體培養基上形成圓形灰色菌落,菌落表面凸起,光滑干燥,菌落可產生紅色色素(如圖1所示)。
[0025]2、本發明所述的灰紅鏈霉菌YlB的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0026]圖2為本發明菌株的系統發育樹,根據菌落形態和16SrDNA序列分析,該菌株屬于灰紅鏈霉菌(Streptomyces griseoruber),故命名為灰紅鏈霉菌Y1B。
[0027]本發明的菌株發酵粗產品的制備方法具體如下:[0028]1、菌株的獲得:從江蘇省無錫市采集水稻土壤樣品若干,將土樣碾碎后,放置在50°C~70°C烘箱烘焙30~60min。稱取烘焙后的土樣溶于無菌水中,充分振蕩,制成不同濃度梯度的土壤懸浮液,涂布于添加有0.05%~0.25% K2Cr2O7的高氏I號培養基平板上,在28°C~32°C恒溫培養箱中培養5~10天。挑單菌落于SFM固體培養基上純化,得到灰紅鏈霉菌 YlB (Streptomyces griseoruber YlB), CCTCC M2013358。
[0029]2、生防菌株發酵粗產品的制備:用SFM固體培養基活化冷凍保藏的CCTCCM2013358菌株,然后將上述培養物接種到SFM液體培養基搖瓶中,28°C~32°C條件下培養2~3天,作為種子液;再將種子液按1%~5%的接種量接種到GYM培養基搖瓶中,28°C~32°C條件下發酵6~8天。發酵結束后,將發酵液離心收集發酵上清液,用乙酸乙酯等體積萃取發酵上清液,合并收集有機相,減壓蒸餾有機相,濃縮蒸干后,得到發酵粗產品。具體見以下各實施例:[0030]實施例1
[0031]菌株的獲得:從江蘇省無錫市采集水稻土壤樣品若干,將土樣碾碎后,放置在60°C烘箱烘焙30min。稱取烘焙后的土樣5g加入盛有45mL無菌水的搖瓶中,振蕩30min,制成KT1濃度的土壤懸浮液,將土壤懸浮液充分混勻,依次稀釋制成10_2、10_310_4、?ο-5濃度的土壤懸浮液。然后分別取10_2、10_3、10_4、10_5濃度的土壤懸浮液各200 μ L,涂布于添加有
0.1% K2Cr2O7的高氏I號培養基平板上,在28°C恒溫培養箱中培養7天。挑單菌落于SFM固體培養基上純化,得到灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB)。
[0032]上述各種培養基的組分分別為:
[0033]高氏I 號培養基:可溶性淀粉 20g, KNO3Ig, K2HPO40.5g,MgSO4.7Η200.5g,FeSO4.7Η200.01g, NaCl0.5g,瓊脂 20g,蒸餾水定容至 1000mL, ρΗ7.2 ~7.4。
[0034]SFM培養基:取20g黃豆餅粉,加蒸餾水沸水煮30min,用紗布過濾,濾液中加甘露醇20g,固體培養基另加瓊脂20g,蒸餾水定容至lOOOmL,pH7.2~7.3。
[0035]實施例2
[0036]生防菌株發酵粗產品的制備:用SFM固體培養基活化冷凍保藏的CCTCC M2013358菌株,然后將上述培養物接種到SFM液體培養基搖瓶中,280C、180rpm條件下培養2天,作為種子液;再將種子液按2%的接種量接種到GYM培養基搖瓶中,28°C、180rpm條件下發酵7天。發酵結束后,將發酵液離心收集發酵上清液,用乙酸乙酯等體積萃取發酵上清液3次,合并收集有機相,40 V減壓蒸餾有機相,濃縮蒸干后,得到發酵粗產品。
[0037]上述GYM培養基的組分為:葡萄糖4g,酵母提取物4g,麥芽提取物10g,蒸餾水定容至 1000mL, ρΗ7.2。
[0038]實施例3
[0039]生防菌株發酵粗產品對植物病原菌的抑制作用:稱取適量粗產品溶于二甲基亞砜(DMSO),配制成1000mg / L的溶液,按一定比例加入融化好的PDA培養基中,混合后倒入滅菌的培養皿中,分別制成粗產品終濃度為50mg / L的PDA培養基平板;同時,分別將等體積的無菌水和DMSO溶劑添加到融化好的PDA培養基中,混合后倒入滅菌的培養皿中,制成空白對照平板和溶劑對照平板。用直徑為8mm的打孔器打取水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌的菌餅,接種到上述各平板中央,在28°C恒溫培養箱中培養5天,用十字交叉法測定各平板菌落的生長直徑,按以下公式計算相對抑菌率(初始接種的菌落直徑為8mm):[0040]
相對抑菌率("O DMSO溶劑對照的菌落直徑-添加粗提物的菌落直徑
— 空白對照的菌落直徑-初始接種的菌落直徑
[0041]結果表明,本發明所述的生防菌株發酵粗產品,對水稻紋枯病菌和西瓜枯萎病菌有較好的抑制作用,相對抑菌率分別達到47.7%和31.0 %。
[0042]PDA培養基:取200g去皮馬鈴薯,切成小塊后沸水煮30min,用紗布過濾,濾液中加葡萄糖20g,瓊脂15g,蒸餾水定容至1000mL,自然pH值。
[0043]以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是,本發明并不局限于上述特定實施方式,本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改,這并不影響本發明的實質內容。
【權利要求】
1.一株拈抗植物病原菌的生防菌株,其特征在于,所述菌株為灰紅鏈霉菌YlB (Streptomyces griseoruber YlB)CCTCC NO:M2013358。
2.如權利要求1所述的拈抗植物病原菌的生防菌株,其特征在于,所述灰紅鏈霉菌YlB具有SEQ ID NO:1所示的16SrDNA序列。
3.—種如權利要求1所述的拈抗植物病原菌的生防菌株在制備防治植物枯萎病生物農藥中的用途。
4.一種生防菌株發酵粗產品的制備方法,其特征在于,采用GYM培養基對如權利要求1所述的灰紅鏈霉菌YlB進行發酵,收集發酵液,萃取并減壓蒸餾,即得所述發酵粗產品。
5.如權利要求4所述的生防菌株發酵粗產品的制備方法,其特征在于,每1000mLGYM培養基中含有葡萄糖3~5g、酵母提取物2~6g、麥芽提取物8~12g、余量為水,pH7.0~8.0。
6.如權利要求4或5所述的生防菌株發酵粗產品的制備方法,其特征在于,所述灰紅鏈霉菌YlB是通過如下步驟獲得的:采集水稻土壤樣品,土樣碾碎后放置在烘箱烘焙,稱取烘焙后的土樣溶于無菌水中,充分振蕩,制成不同濃度的土壤懸浮液,涂布于添加有0.05%~0.25% K2Cr2O7的高氏I號培養基平板上,待長出菌落后,挑單菌落于SFM固體培養基上純化,即得灰紅鏈霉菌 YlB (Sti^ptomyces griseoruber YlB) CCTCC NO:M2013358。
7.如權利要求6所述的生防菌株發酵粗產品的制備方法,其特征在于,每1000mL高氏I號培養基中含有可溶性淀粉10~30g、KNO30.8~1.2g、K2HPO40.3~0.6g、MgSO4.7Η200.4 ~0.8g、FeSO4.7Η200.008 ~0.012g、NaCl0.4 ~0.6g、瓊脂 18 ~24g、余量為水,pH7.0~8.0。
8.如權利要求6所述的生防菌株發酵粗產品的制備方法,其特征在于,每1000mLSFM培養基的制備包括如下步驟:取15~25g黃豆餅粉,加蒸餾水沸水煮20~40min,過濾黃豆餅粉液體,濾液中加甘露醇15~25g,固體培養基另加瓊脂18~25g,蒸餾水定容至1000mL, ρΗ7.0 ~8.0。
9.一種如權利要求4所述的制備方法制得的生防菌株發酵粗產品在制備防治植物枯萎病生物農藥中的用途。
10.如權利要求9所述的用途,其特征在于,所述植物枯萎病為水稻枯萎病菌或西瓜枯萎病菌。
【文檔編號】A01P1/00GK103642725SQ201310627298
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】王威, 惠俊淵, 張雪洪 申請人:上海交通大學