專利名稱：一種建立橡膠樹內珠被再生體系的方法
技術領域：
本發明涉及一種橡膠樹內珠被作為外植體，通過體胚發生途徑再生橡膠樹小 植株的方法，屬于植物組織和細胞工程領域，特別是涉及一種建立橡膠樹內珠被 再生體系的方法。
背景技術：
橡膠樹生產上最早使用的種植材料是實生苗，實生苗來自自由授粉的種子， 具有生長快、經濟壽命長、抗逆性強的優點，但存在株間差異大、平均產量低
(僅為芽接樹的1/3)、不能保持母本優良性狀的缺點(王澤云，陳雄庭，吳胡蝶. 橡膠樹新型種植材料-體胚植株.熱帶農業科學，2001， (6) :11-15)。目前普遍使 用的種植材料是芽接苗，芽接苗減少了株間產量的差異，大幅度提高了產量， 但也有生長慢、抗逆性差的不足之處，而且產量常常受到砧木的影響。自根幼 態無性系是新型的種植材料，目前獲得自根幼態無性系有兩種方法通過花藥 再生植株和通過內珠被再生植株(王澤云，曾憲松，陳傳琴等.從離體花藥誘 導巴西橡膠植株。熱帶作物科技通訊，1978， (4): 1-7; CarronMP， EnjalricF. EmbryogenSse somatique & patir du tegument interne de la graine d 6raw7/e"^(Kunth) Miill-Arg. C R Acad Sci Paris, 1985, 300(111) 17:653-658)。花藥
(內珠被)植株經過了類似于合子胚的途徑，恢復了幼態，又屬體細胞無性繁 殖，因此保持了供體植株的遺傳信息。由此可見，這類植株集中了實生苗和芽 接苗的優點，具有生長快、產量高、莖干圓錐度大的優點，花藥植株產量較供 體老態無性系增加了29.9~46.3% (陳雄庭，王澤云，吳蝴蝶，張秀娟.橡膠樹新種植材料-自根幼態無性系，熱帶作物學報，2002， 23 (1): 19-23)內珠被微繁 植株較芽接樹產量提高了20% ( Carron MP, Laerdet L, Leconte A et al. Field growth and rubber yield of Hevea brasiliensis (Mugll.-Arg.) from budded versus in vitro micropropagated plants from clone IRCA 18. First international symposium on acclimatization and establishment of micropropagated plants, Sani隱Halkidiki, 2001,19-22 September, p 283-293)，而且克服了芽接苗中砧木的不良影響，被稱 為"自根幼態無性系"，正成為新型種植材料。
然而花藥培養取材季節大都是白粉病流行的時候，因此存在真菌污染嚴重的 問題；而且花藥較小，剝離困難，生產成本高，無法滿足生產上對自根幼態無性 系的大量需求。法國內珠被緊實愈傷再生體系經過多年的發展，已取得了較大進 展胚性愈傷誘導率達到60 100%，由體胚再生植株的頻率達到30%(MPCarron， J d，Auzac, H. Etienne et al. Biochemical and histological features of somatic embryogenesis in //evea Z)raw7/ew生Indian Journal of Natural Rubber Research, 1992: 5(1&2): 7-17)。改良的培養基如下誘導愈傷培養基為改良的MS培養基添加 6-BA、 3， 4-D、 AgN03、蔗糖和gelrite;胚狀體分化培養基基本同愈傷誘導培養 基但添加亞精胺；胚狀體成熟培養基基本同分化培養基但去除AgN03，降低BA 和3， 4-D濃度。培養溫度為2(TC，暗培養。上述改良的MS培養基修改的部分 為大量元素(mg/L) :NH4N03: 1601; KN03: 2022; MgS04-7H20: 739; NaH2P(VH20: 276;微量元素(mg/L):H3B03: 9.28; ZnS04'7H20: 11.5; CuS(V5H20: 0.37; CoCl2'6H20: 0.24; Na2S04: 92.37;有機元素(mg/L):肌醇5.4;煙酸0.46;
鹽酸硫胺素0.67;鹽酸吡多醇0.62;生物素0.048; D-泛酸鈣0.48;抗壞 血酸0.17;氯化膽堿0.14; L-半胱氨酸鹽酸鹽0.46;甘氨酸0.37;核黃素:0.37。但是，實踐證明用該方法無法建立國內品種的內珠被再生體系，相關研究 仍處于摸索階段(叢明.人血清白蛋白cDNA轉化橡膠樹的研究，華南熱帶農業大學 碩士論文，2005)。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種建立橡膠樹內珠被再生體系 的方法，通過體細胞胚胎發生和植株再生技術研究，獲得橡膠樹再生植株，以滿 足生產和實驗的需要。
為了達到上述目的，本發明的目的是這樣實現的 一種建立橡膠樹內珠被
再生體系的方法，它包括對幼果的選擇及處理，對外植體的選擇及處理，愈傷
組織的誘導、繼代，體細胞胚狀體的分化和植株再生的過程；
(O對幼果的選擇及處理過程選取6 10周的幼果，先用洗衣粉洗滌，再 用流動的自來水充分沖洗后，將幼果移入無菌環境，先用70 75%乙醇消毒1分 鐘，接著用0.P/。升汞消毒10分鐘，最后用無菌水沖洗3 5次；
(2) 對外植體的選擇及處理過程對幼果的選擇及處理過程己消毒好的幼
果切開，取出胚珠，將胚珠的外珠被切掉，保留內珠被及珠心，將其切成大小
為0.3 1.0cm，厚0.5 lmm的片狀；
(3) 愈傷組織的誘導過程所述片狀外植體，接種于愈傷組織誘導培養基 暗培養15 30天，以誘導愈傷組織，培養溫度在24'C 3(TC之間；愈傷組織誘導 培養基的有效成份為改良的MS培養基和附加成份，MS培養基修改的成份為七 水硫酸鎂400~600mg/L，磷酸二氫鉀350~500mg/L，無水氯化鈣200 350mg/L， 一水硫酸錳20 40mg/L，五水硫酸銅0.1~0.3mg/L，附加成份為2,4-二氯苯氧乙 酸(2,4-D) 0.5~3mg/L、 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA) 0.5~3mg/L、硝酸銀(AgN03)5~10mg/L、植物凝膠(Phytagel) 2 3g/L、蔗糖50~90g/L、椰子水40~90ml/L;
(4) 愈傷組織的繼代過程將所述誘導的愈傷組織轉入繼代培養基暗培養 15~30天，培養溫度在24'C 30'C之間；繼代培養基的有效成分為改良的MS培 養基，并添加2，4-二氯苯氧乙酸0.1 2mg/L、 6-芐氨基腺嘌呤0.1 2mg/L、脫落 酸(ABA) 0.05~2mg/L、植物凝膠2~3g/L、蔗糖50 卯g/L、椰子水40 90ml/L;
(5) 體細胞胚狀體的分化過程將得到的愈傷組織接種于分化培養基暗培養 20 50天，以促進體細胞胚狀體的分化、成熟，培養溫度在2(TC 28r之間；分 化培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加6-芐氨基腺嘌呤0.5 2mg/L、 激動素(KT) 0.5~4mg/L、 a-萘乙酸(NAA) 0.05 lmg/L、赤霉素(GA3) 0.01-lmg/L、植物凝膠2 3g/L、蔗糖50~90g/L、活性碳l 2g/L、椰子水 40 90ml/L;
(6)植株再生的過程將體細胞胚狀體的分化過程得到的成熟胚狀體接種
到出苗培養基，光照培養，以促其再生出完整植株，培養溫度在2(TC 3(TC之間； 出苗培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加激動素0.1~2mg/L、赤霉素 0.1~4mg/L、 生長素(IAA ) 0.01 lmg/L、植物凝膠2~3g/L、蔗糖50~90g/L、 活性碳l 2g/L、椰子水40 90ml/L;
本發明一種建立橡膠樹內珠被再生體系的方法的有益效果是(1)本發明 所使用的愈傷組織誘導、繼代、體胚分化和出苗基本培養基及培養基添加的激 素和附加物及培養條件與法國不同，適宜國內橡膠樹品種。國內原來巴西橡膠 樹通過體胚發生途徑的獲得再生植株的方法只有花藥再生體系，使得基于組織 培養的研究和生產受花季限制，內珠被再生體系的建立使花季過后還可以取內 珠被作外植體，延長了獲取外植體的時間、種類，加速該領域的發展。(2) 本發明與花藥再生體系相比，剝離花藥費工、費錢，而內珠被獲得簡 單、快捷，大大提高了實驗和生產效率；橡膠樹開花季節往往也是白粉病流行 的時候，而花萼幼嫩，無法抵擋菌絲的侵入，因此花藥接種污染率常較高，嚴 重時達到50%-70%。而胚珠成熟過程均處于封閉狀態，受到厚厚的果皮的保護， 因此胚珠基本是無菌的，所以內珠被接種污染率很低， 一般少于5%，極大地提
高了實驗和生產效率。
(3) 本發明為極有前途的新型種植材料"自根幼態無性系"在國內的推廣，
為生產上遺傳背景一致的砧木的獲取，為巴西橡膠樹研究領域一直關心的砧穗 關系的研究提供了新的選擇。自根幼態無性系結合了芽接苗和實生苗的優點，
很有推廣價值；而橡膠樹的砧木一直都是采用自然授粉狀態下的種子再生苗， 因而遺傳背景差異大，導致來自同一基因型接穗的芽接樹產量差別較大，因此 砧木無性系有很大的市場潛力；該材料也為砧穗關系的研究奠定基礎，從而為 選擇最優的砧穗組合提供了可能。
(4) 本發明為國內可長期繼代的胚性愈傷組織提供了新的來源。可長期繼 代的胚性愈傷組織是一類有別于以花藥和內珠被為外植體誘導出來的愈傷組 織，直接誘導的愈傷組織不耐繼代，多次繼代后胚性喪失，而可長期繼代的胚 性愈傷組織經過5年的繼代仍能保持胚性。實踐證明，花藥和內珠被均能誘導 這類胚性愈傷組織。
本發明工藝流程簡單，生產成本低，胚狀體誘導率高，再生植株健壯，具有 很大的應用價值。
具體實施例方式
下面舉例對本發明作進一步詳細說明本發明所設計的建立內珠被再生體系的方法包括幼果的選擇和處理，外 植體的選擇和處理，愈傷組織的誘導和繼代，體細胞胚誘導和植株再生過程
(1) 對幼果的選擇及處理過程是指選取6~10周的幼果，先用洗衣粉洗滌， 再用流動的自來水充分沖洗后，移入無菌環境，先用70 75%乙醇消毒1分鐘，
接著用0.1%升汞消毒10分鐘，最后用無菌水沖洗3~5次。
(2) 對外植體的選擇及處理過程是指已消毒好的幼果切開，取出胚珠，將胚 珠的外珠被切掉，保留內珠被及珠心，將其切成大小為0.3 1.0cm，厚0.5 lmm
的片狀。'
(3) 愈傷組織的誘導過程是指所述片狀外植體，接種于愈傷組織誘導培養基 暗培養15 30天，以誘導愈傷組織，培養溫度在24"C 3(TC之間。愈傷組織誘導 培養基的有效成份為改良的MS培養基和附加成份，MS培養基修改的成份為七 水硫酸鎂(MgS04.7H20) 400~600mg/L，磷酸二氫鉀(KH2P04 )350 500mg/L， 無水氯化鈣 (CaCl2) 200 350mg/L， 一水硫酸錳(MnS04.H20 )20~40mg/L， 五水硫酸銅(CuSO4.5H2O)0.1 0.3mg/L (以下步驟同)，附加成份為2，4-二氯苯氧 乙酸(2,4-D) 0.5~3mg/L、 、 6-節氨基腺嘌呤(6-BA) 0.5~3mg/L、硝酸銀(AgN03) 5~10mg/L、植物凝膠(Phytagel) 2~3g/L、蔗糖50~90g/L、椰子水40~90ml/L。
(4) 愈傷組織的繼代過程是指誘導的愈傷組織轉入繼代培養基暗培養。培養 溫度在24。C 3(TC之間。所述繼代培養基的有效成分為上述改良的MS培養基和 附加成份，附加成份為2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0.1~2mg/L、 6-芐氨基腺嘌呤 (6-BA) 0.1~2mg/L、脫落酸(ABA) 0.05 2mg/L、植物凝膠(Phytagel) 2 3g/L、蔗 糖50~90g/L、椰子水40~90ml/L。
(5) 體細胞胚狀體的分化過程是得到的愈傷組織接種于分化培養基暗培養20~50天，以促進體細胞胚狀體的分化、成熟，培養溫度在20。C 28'C之間。分 化培養基的有效成分為上述改良的MS培養基和附加成份，附加成份為6-芐氨 基腺嘌呤(6-BA) 0.5 2mg/L、激動素(KT) 0.5 4mg/L、 a-萘乙酸(NAA) 0.05 lmg/L、赤霉素(GA3) 0.01-lmg/L、 植物凝膠(Phytagel) 2 3g/L、蔗糖 50 90g/L、活性碳l 2g/L、椰子水40 90ml/L。
(6)植株再生的過程是得到的成熟胚狀體接種到出苗培養基，光照培養，以 促其再生出^整植株，培養溫度在2(TC 30'C之間。出苗培養基的有效成分為改 良的MS培養基和附加成份，附加成份為激動素(KT ) 0.1~2mg/L、赤霉素 (GA30) .1 4mg/L、生長素(IAA ) 0.01~lmg/L、植物凝膠(Phytagel) 2 3g/L、 蔗糖50 90g/L、活性碳l 2g/L、椰子水40 90ml/L。 實施例
一種建立橡膠樹內珠被再生體系的方法，具體步驟是
(1) 對幼果的選擇及處理選取6 10周的熱研88-13幼果，先用洗衣粉洗滌， 再用流動的p來水充分沖洗后，移入無菌環境，先用75%乙醇消毒1分鐘，接 著用0.1%升汞消毒10分鐘，最后用無菌水沖洗3 5次，每次3分鐘。
(2) 對外植體的選擇及處理將消毒好的幼果切開，取出胚珠，將胚珠的外 珠被切掉，保留內珠被及珠心，將其切成大小為0.3 1.0 cm，厚0.5 lmm的片 狀。
(3) 愈傷組織的誘導過程將上述片狀外植體，接種于愈傷組織誘導培養基 暗培養15 30天，培養溫度在24t: 28。C之間。外植體在上述培養基中膨大、部 分愈傷化、顏色由白色變成鮮黃。所述愈傷組織誘導培養基的有效成份為改良 的MS培養基和附加成份，MS培養基修改的成份為MgS04.7H20 500mg/L，KH2PO4400mg/L， CaCl2 250mg/L， MnS04. H20 35mg/L， CuS04.5H20 0.2mg/L (以下步驟同)，附加成份為2,4-D 1.2mg/L、6-BA2mg/L、AgN03 5mg/L、Phytagel 2g/L、蔗糖50g/L、椰子水50ml/L。
(4) 愈傷組織的繼代過程將愈傷組織轉入繼代培養基暗培養15~30天，培 養溫度在24"C 28X:之間。部分愈傷化的外植體在繼代培養基中進一步愈傷化， 形成鮮黃、緊實的愈傷組織。所述繼代培養基的有效成分為改良的MS培養基 和附加成份，附加成份為2，4-D0.5mg/L、 6-BA 1 mg/L、 ABA0.5mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖50g/L、椰子水50ml/L。
(5) 體細胞胚狀體的分化過程將繼代后的愈傷組織接種于分化培養基暗培 養30天，以促進體細胞胚狀體的分化、成熟，培養溫度在2(TC 28'C之間。30 天后，緊實的愈傷組織表面出現了長勢旺盛的乳白色各個階段的小胚狀體及子 葉形胚狀體， 一個愈傷可分化一至數十個胚狀體。分化培養基的有效成分為改 良的MS ,養基和附加成份，附加成份為6-BA 0.5mg/L、 KT lmg/L、 NAA 0.05mg/L、 GA3 lmg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖50g/L、活性碳lg/L、椰子水50ml/L。
(6) 植株再生的過程將成熟胚狀體接種到出苗培養基，光照培養，以促其 再生出完整植株，培養溫度在2(TC 3(TC之間。成熟的子葉形胚狀體轉入出苗培 養基后20天開始陸續有小植株再生，再生的小植株健壯，主根發達。出苗培養 基的有效成分為改良的MS培養基和附加成份，附加成份為KT lmg/L、 GA3 lmg/L、 IAA0.01mg/L、 Phytagel 2g/L、蔗糖50g/L、活性碳lg/L、椰子水50ml/L。
權利要求
1、一種建立橡膠樹內珠被再生體系的方法，它包括對幼果的選擇及處理，對外植體的選擇及處理，愈傷組織的誘導、繼代，體細胞胚狀體的分化和植株再生的過程，其特征在于(1)對幼果的選擇及處理過程選取6～10周的幼果，先用洗衣粉洗滌，再用流動的自來水充分沖洗后，將幼果移入無菌環境，先用70～75％乙醇消毒1分鐘，接著用0.1％升汞消毒10分鐘，最后用無菌水沖洗3～5次；(2)對外植體的選擇及處理過程對幼果的選擇及處理過程已消毒好的幼果切開，取出胚珠，將胚珠的外珠被切掉，保留內珠被及珠心，將其切成大小為0.3～1.0cm，厚0.5～1mm的片狀；(3)愈傷組織的誘導過程所述片狀外植體，接種于愈傷組織誘導培養基暗培養15～30天，以誘導愈傷組織，培養溫度在24℃～30℃之間；愈傷組織誘導培養基的有效成份為改良的MS培養基和附加成份，MS培養基修改的成份為七水硫酸鎂400～600mg/L，磷酸二氫鉀350～500mg/L，無水氯化鈣200～350mg/L，一水硫酸錳20～40mg/L，五水硫酸銅0.1～0.3mg/L，附加成份為2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5～3mg/L、6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0.5～3mg/L、硝酸銀(AgNO3)5～10mg/L、植物凝膠(Phytagel)2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L；(4)愈傷組織的繼代過程將所述誘導的愈傷組織轉入繼代培養基暗培養15～30天，培養溫度在24℃～30℃之間；繼代培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加2，4-二氯苯氧乙酸0.1～2mg/L、6-芐氨基腺嘌呤0.1～2mg/L、脫落酸(ABA)0.05～2mg/L、植物凝膠2～3g/L、蔗糖50～90g/L、椰子水40～90ml/L；(5)體細胞胚狀體的分化過程將得到的愈傷組織接種于分化培養基暗培養20～50天，以促進體細胞胚狀體的分化、成熟，培養溫度在20℃～28℃之間；分化培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加6-芐氨基腺嘌呤0.5～2mg/L、激動素(KT)0.5～4mg/L、α-萘乙酸(NAA)0.05～1mg/L、赤霉素(GA3)0.01-1mg/L、植物凝膠2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L；(6)植株再生的過程將體細胞胚狀體的分化過程得到的成熟胚狀體接種到出苗培養基，光照培養，以促其再生出完整植株，培養溫度在20℃～30℃之間；出苗培養基的有效成分為改良的MS培養基，并添加激動素0.1～2mg/L、赤霉素0.1～4mg/L、生長素(IAA)0.01～1mg/L、植物凝膠2～3g/L、蔗糖50～90g/L、活性碳1～2g/L、椰子水40～90ml/L。
全文摘要
本發明涉及一種橡膠樹內珠被作為外植體，特別是涉及一種建立橡膠樹內珠被再生體系的方法，主要步驟包括對幼果的選擇及處理，對外植體的選擇及處理，愈傷組織的誘導、繼代，體細胞胚狀體的分化和植株再生。本發明所提供的橡膠樹內珠被再生體系建立方法工藝流程簡單，生產成本低。利用內珠被來獲得幼態自根無性系，克服了花藥培養雄蕊剝離困難、白粉病流行季節污染嚴重的缺點，擴大了外植體的來源，具有容易獲得外植體、再生植株健壯的特點，為幼態自根無性系的推廣和砧木選育提供了良好的再生體系，為遺傳轉化提供了良好的受體，也為可長期繼代的胚性愈傷組織提供了新的來源，因此具有廣闊的應用前景。
文檔編號A01H4/00GK101485290SQ20081000145
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月17日 優先權日2008年1月17日
發明者周權男, 孫愛花, 哲 李, 李維國, 黃華孫, 黃天帶 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所