一種對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及顯微成像領域，特別涉及一種在醫用生物領域對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡。
【背景技術】
[0002]細胞作為生命活動的基本單元，是深入研宄生命過程的關鍵。了解各種大分子在活細胞中構象改變和精確定位，揭示生物分子相互作用關系，對于研宄疾病機理、促進生物醫藥科學和相關產業的發展具有重大意義。而實現這些的關鍵在于細胞的觀察及檢測。
[0003]目前，激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy)是細胞原位觀察的重要工具，然而，受到光學衍射限制，激光掃描共聚焦顯微鏡的成像分辨率在200?300nm，隨著觀察和原位檢測的深入，需要對尺寸在20?200nm的病毒、單鏈或雙鏈DNA實現觀察和檢測，在這些情況下，共聚焦顯微鏡就無法分辨。為了突破光學衍射極限，近年來涌現出了不少超分辨光學顯微成像方法，如光激活定位法(Photoactivat1nLocalizat1n Microscopy，PALM)、隨機光學重構法(Stochastic Optical Reconstruct1nMicroscopy，STORM)、結構光照明法(Structured Illuminat1n Microscopy, SIM)以及受激發射損耗法(Stimulated Emiss1n Deplet1n，STED)等。相比其他的方法，STED方法是一種更為直觀的方法，它以傳統共聚焦顯微光學技術為基礎，通過把被激發的熒光物質限制在小于衍射極限的范圍內，從而實現超高分辨率，其成像方式無需復雜的后期圖像處理，因此STED技術被認為是下一代顯微光學發展的核心技術，是光學最前沿理論與技術實踐的結合。
[0004]STED顯微成像系統有多種實現方法，但大部分STED系統十分復雜，這些STED系統多采用兩組激光光源，且該類系統通過增加反射鏡的數量來增加光行進的距離，這帶來兩方面的問題，一是系統裝校過程十分復雜，每個反射鏡在每次使用時都必須精確調校，耗時費力，即使是對從事STED顯微鏡系統開發的科研人員來說也是一項十分具有挑戰性的工作；二是系統的可靠性非常低，用戶在使用時經常遇到系統需要重新校準，這在很大程度上限制了 STED超分辨顯微鏡的推廣應用。
【實用新型內容】
[0005]為減小STED系統的復雜性，本實用新型采用超連續譜脈沖光源同時作為激發光光源和損耗光光源，此外，為使得激發光和損耗光在時間上保持嚴格的同步關系，本實用新型在損耗光路中采用雙光楔對光程進行補償，使得激發光和損耗光先后進入物鏡，兩路光在時間上保持幾皮秒的延時，以獲得對熒光最佳的損耗效果。同時，采用脈沖光作為激發光和損耗光也減小了光照對熒光物質的漂白。
[0006]為了實現上述目的，本實用新型采用以下技術方案:
[0007]—種對焚光物質進行成像的超分辨顯微鏡，它包括:第一光路，其中的光線的波長選擇為適于激發該待成像的熒光物質產生處于激發態的熒光粒子的波長；
[0008]第二光路，其中設置有相位板，以使所述第二光路的照射面形成為環形光斑，且所述第二光路中光線的波長選擇為不能激發該待成像的熒光物質產生處于激發態的熒光粒子的波長；
[0009]雙光楔光程補償裝置，其設置在所述第二光路中，所述雙光楔光程補償裝置由折射率大于空氣折射率的透光材料制成，且所述光程調節器包括兩個含斜邊的光楔，兩個光楔的斜邊彼此可滑動移動地貼合，所述第二光路中的光線穿過兩個光楔的貼合部分。
[0010]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，包括:
[0011]光源，其為超連續譜脈沖激光源，用于發射波長范圍較寬的脈沖光；
[0012]第一二色鏡，其用于將所述波長范圍較寬的脈沖光分解為長波長和短波長兩路光，其中短波長光波行進的光路為激發光光路，長波長光波行進的光路為損耗光光路；
[0013]第一濾光片，其位于所述激發光光路上，且只允許一個特定波長的激光透射，該透射出的特定波長的激光為激發光；
[0014]第二濾光片，其位于所述損耗光光路上，且只允許一個特定波長的激光透射，該透射出的特定波長的激光為損耗光；
[0015]所述激發光和損耗光均垂直照射于熒光物質上的同一位置；
[0016]相位板，其位于所述損耗光的光路上，具有O?2 的渦旋相位分布，用于將所述損耗光的照射面由實心的光斑轉變為中間無光周圈有光的圓環空心光斑；
[0017]雙光楔光程補償裝置，其位于所述損耗光的光路上，由折射率大于空氣折射率的透光材料組成，當損耗光穿過所述雙光楔光程補償裝置時，損耗光的傳播速度小于它在空氣中的傳播速度，從而使得所述激發光和損耗光產生一個時間差先后到達熒光物質，且激發光先于損耗光到達熒光物質，所述雙光楔光程補償裝置通過自由調節損耗光在雙光楔光程補償裝置中的傳播距離，來控制所述時間差的大小；
[0018]熒光探測系統，其用于檢測熒光及其強度；
[0019]分析控制系統，其與所述熒光探測系統電連接，用于記錄和分析熒光強度，并最終實現顯微成像；
[0020]其中，通過調節所述雙光楔光程補償裝置來改變時間差的大小，以使得所述激發光先照射熒光物質，待熒光物質中的熒光粒子從基態躍迀至激發態之后，且在該處于激發態的熒光粒子發出熒光之前，損耗光剛好照射到熒光物質，使熒光物質受激輻射，以迫使已經處于激發態的熒光粒子躍迀至其他能級，從而通過后續光學器件以濾除損耗區域的熒光信號。
[0021]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，所述光楔呈直角梯形或直角三角形。
[0022]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，還包括:
[0023]三維納米位移臺，其與所述分析控制系統電連接，用于承載熒光物質，并在X、Y、Z方向自由地進行以納米為單位的移動；
[0024]物鏡，其位于熒光物質上方，用于聚焦激發光和損耗光，并收集由熒光物質發出的熒光；
[0025]第三濾光片，其位于熒光光路上，用于濾除干擾光，透射熒光；
[0026]透鏡，其位于所述第三濾光片和熒光探測系統之間，用于聚焦熒光；
[0027]針孔，其位于所述透鏡和熒光探測系統之間，用于濾除干擾光。
[0028]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，還包括:
[0029]反射鏡，其位于所述第二濾光片和相位板之間，用于反射損耗光；
[0030]第二二色鏡，其位于所述第三濾光片和物鏡之間，用于反射所述激發光和透射熒光;
[0031]第三二色鏡，其位于所述第二二色鏡和物鏡之間，用于反射所述損耗光，透射激發光和熒光。
[0032]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，所述激發光從所述光源出發，依次經過第一二色鏡、第一濾光片、第二二色鏡、第三二色鏡和物鏡，最終到達熒光物質。
[0033]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，所述損耗光從所述光源出發，依次經過第一二色鏡、第二濾光片、反射鏡、相位板、雙光楔光程補償裝置、第三二色鏡和物鏡，最終到達熒光物質。
[0034]優選的是，所述的對熒光物質進行成像的超分辨顯微鏡，所述熒光物質發出的熒光依次經過物鏡、第三二色鏡、第二二色鏡、第三濾光片、透鏡和針孔，最終到達熒光探測系統。
[0035]本