活體動物雙光子激發延時檢測熒光成像分析方法及設備的制造方法
【專利摘要】本發明公開了一種活體動物雙光子激發延時檢測熒光成像分析方法及設備，用于分析動物體內組織和器官中熒光納米探針(或熒光納米載藥體模擬探針)的分布、熒光強度或探針濃度隨時間變化動力學性質，以紅光或近紅外脈沖激光雙光子激發體內熒光納米探針發光，以延時檢測熒光成像方式探測體內特定部位熒光強度及其隨時間變化動力學性質，具有成像分析深度大、可靠性高、檢測靈敏度高等優點。
【專利說明】
活體動物雙光子激發延時檢測熒光成像分析方法及設備
技術領域
[0001] 本發明涉及動物在體熒光影像分析技術，特別涉及一種活體動物體內納米載藥體 模擬探針或熒光納米探針的分布及輸運動力學性質的熒光成像分析方法，實施所述分析的 設備，以及該方法和設備在納米載藥體腫瘤靶向動力學性質表征中的應用。
【背景技術】
[0002] 動物在體熒光影像技術具有靈敏度高、損傷小等特點，已發展成為活體動物成像 的一種常用方法，被廣泛用于生命科學、生物醫學和藥物研發等領域[V. Wagner， A.DuIlaartjA.BockjA.ZweckjThe emerging nanomedicine landscape.Nature Biotechnology. 2006,24,1211-1217.]。活體熒光成像系統在生物醫學、生理分析及藥物研 發等領域的許多研究中有廣闊的應用前景。然而，活體動物熒光成像技術也面臨著許多難 題有待解決，例如，在可見光/紫外激發光源照射下，活體動物的皮膚、毛發等組織會產生較 強的自發熒光，它們與常用的標記探針的熒光光譜重疊，導致信噪比大幅降低，嚴重影響檢 測的靈敏度和準確性;另一方面，不同類型的細胞和組織對光的吸收和散射能力不同，活體 動物組織結構及體液運動情況復雜，導致了特異熒光信號的衰減、信號失真等問題。此外， 一些有毒性的探針不宜在活體中使用，而小分子熒光探針發光強度較低，發光性質受環境 影響顯著，光穩定性和化學穩定性不夠高等問題也是制約活體熒光成像技術發展的重要因 素。如何克服活體動物自發熒光的干擾，增加探測深度，提高所采集生化信息的準確性，是 活體熒光影像技術發展中具有挑戰性的科學技術難題。
[0003] 傳統熒光成像技術利用連續或調制光源激發活體組織或細胞中的特異性熒光探 針發光實現熒光成像。組織、細胞和體液對激發光的散射和自發熒光等背景熒光與探針發 光混在一起，對特異性靶標的影像產生較大的干擾。一般通過與探針熒光匹配的窄帶濾光 片壓制激發光散射和背景熒光來提高活體熒光影像分析的靈敏度。但是，在活體動物體內 大深度標記下需要使用較高激發光強時，背景熒光的干擾難以克服。背景熒光干擾導致圖 像信噪比下降，嚴重時將湮沒特異性熒光信號，大大制約了活體動物熒光成像技術的應用。 利用激發光散射和生物自發熒光等背景熒光與熒光探針發光之間的發光壽命差異，實現時 間分辨熒光成像是一個很好的解決方案。由于激發光散射的持續時間與激發光脈沖寬度大 致相當，可以通過延時檢測技術將其避開。但是，背景熒光壽命和絕大多數熒光探針分子壽 命均在納秒量級，如，蛋白質、色素和大多數熒光祀標的熒光壽命一般不超過20ns，壽命差 異較小，相應的延時檢測技術僅適合于顯微壽命成像，難以應用于活體動物的快速、大視場 成像。
[0004] 近年來，基于染料分子獨特的熒光光譜，通過比較標準熒光光譜去除本底熒光干 擾，發展了光譜拆分活體成像技術，在一定程度上提高了成像的準確度和靈敏度[X.H.Gao， Y.Y.Cui,R-M-LevensonjL-W.K-ChungjS-M-NiejIn vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots，Nature Biotechnology，2004,22,969_976.]D但由于 光譜成像或光譜拆分成像是由多幀含有光譜信息的圖像拼合而成，高度依賴于圖像的計算 解析技術，在背景光較強時，難以保證探針特征光譜拆分的可靠性。生物分子和普通熒光染 料的發射光譜都很寬，彼此嚴重交疊，在準確獲取目標物的特征光譜方面仍有相當難度。由 于動物種屬、不同個體間以及不同組織的差異等原因，光譜拆分技術在實際應用中也會產 生一些假象。因此，采用新的背景光抑制原理與技術是進一步提高檢測靈敏度與可靠性的 關鍵所在。
[0005] 動物組織和細胞中存在與激發光波長四次方成反比的瑞利散射，以及其它形式的 散射，強烈的散射和吸收使激發光難以有效到達深層靶標，給實現其熒光成像帶來很大困 難。生物組織、細胞和體液對610-900nm波段的光散射和吸收相對較小，因而該波段被稱為 生物組織激發和檢測的光學窗口。雙光子激發熒光一般使用波長為750-1000nm的飛秒近紅 外激光作為激發光源，熒光標記探針同時吸收兩個光子達到激發態。由于雙光子激發幾率 與激發光強兩次方成正比，焦點以外的發光物質被激發的幾率大為降低。然而，動物體內的 某些物質也會因雙光子效應而產生很強的背景熒光，導致信噪比下降，而本發明人的研究 表明，動物表皮在飛秒激光激發下會產生很強的背景熒光或磷光，其壽命也長于普通熒光 染料的熒光壽命，采用普通雙光子激發成像方式難以獲得體內發光標記物的準確信息。
[0006] 另一方面，現有雙光子共焦成像技術是在單光子共焦成像技術和飛秒激光光源基 礎上，針對可見光譜區的雙光子熒光染料開發的。該技術采用逐點掃描成像，因而不適用于 大視場下的活體動物成像。同時由于逐點掃描的工作模式，在成像時間的限制下，每點的工 作時間必須是納秒量級的，這使此類技術難以應用于活體動物高效雙光子激發成像分析。
[0007] 納米載藥體已成為一種有效的新型給藥方式，在腫瘤治療中發揮了積極作用。然 而納米載藥體的性能取決于其組成、尺寸、表面祀向分子結構，進一步優化納米載藥體的性 能，需要定量理解其在活體動物體內的腫瘤靶向動力學性質及在主要器官中的分布與上述 結構特征之間的關系。為高效、準確地獲得上述信息，本發明人提出采用雙光子激發延時檢 測熒光成像的方法對注入活體動物體內的、具有長發光壽命且雙光子激發和熒光發射波長 均處于生物透光窗口（600-1000nm)的納米載藥體模擬探針（下稱熒光納米載藥體模擬探 針）的分布和動力學性質進行定量分析的方法。由于動物表皮血管或體內組織中距光源更 近的納米載藥體模擬探針將首先被激發，而在普通照射模式下，隨著探測深度的增加，激光 功率密度會顯著減小，雙光子激發發光強度下降，因此在大視場(例如一維尺寸為1mm-IO厘 米)下要對活體動物體內腫瘤或某些特定器官中的納米載藥體模擬探針進行無損或非介入 式熒光分析，需要減小或消除處于皮膚或待測組織、器官周圍的上述探針產生的熒光干擾。

【發明內容】

[0008] 為解決上述難題，本發明提供一種雙光子激發延時檢測熒光動物成像分析技術、 設備與應用，以實現在大視場下，增大動物體內熒光納米載藥體模擬探針成像分析深度，消 除自發熒光與背景光的干擾，同時減小來自動物表皮和目標探測部位周圍組織中熒光納米 載藥體模擬探針熒光的干擾，提高所述成像分析的可靠性。
[0009] 本發明的技術方案如下：
[0010] -種活體動物體內組織和器官中熒光納米探針的分布、熒光強度或探針濃度隨時 間變化動力學性質的熒光成像分析方法，其特征在于，以紅光或近紅外脈沖激光雙光子激 發體內熒光納米探針發光，以延時檢測的方式探測體內受激發部位的熒光，進行成像。
[0011] 上述熒光成像分析方法中，所述熒光納米探針可為動物體內的組織或器官中的熒 光納米載藥體模擬探針。通過該方法可以對熒光納米探針在動物體內的分布、熒光強度或 探針濃度隨時間變化動力學性質進行檢測分析。
[0012] 本發明的熒光成像分析方法的成像視場至少有一維尺寸在1毫米至10厘米范圍 內。通過電動平移臺驅動檢測設備對成像部位進行激發光斑的可控掃描，實現大的成像視 場。
[0013] 本發明的熒光成像分析方法中，優選的，通過紅光或近紅外飛秒脈沖激光激發熒 光納米探針中的雙光子敏化稀土發光配合物發光，所述紅光或近紅外飛秒脈沖激光的波長 在610-1100納米范圍內，更優選為700-1000納米范圍。所述飛秒脈沖激光的輸出總功率為 10-1 OOOOmW，優選為 300-1 OOOmW，脈沖激發頻率為 IOHz-I OOOOHz，優選為 100Hz-400Hz。
[0014] 本發明的熒光成像分析方法中，激發光脈沖激發后，利用熒光探測器延時檢測體 內受激發成像部位的熒光，所述延時為激發光脈沖激發后到熒光探測器開啟之前的時差， 該時差為IOns至500ys;延時檢測焚光的時間窗口為IOns至IOOms，優選為IOOns至20ms。
[0015] 上述熒光納米探針可具有雙光子敏化稀土發光性能，所述稀土發光的波長位于紅 光或近紅外區，優選波長范圍為600-1050納米。所述熒光納米探針的發光體基本上由基質 材料和具有雙光子敏化稀土發光性能的稀土配合物組成，所述基質材料是由主鏈為碳氫 鏈、側基為羧基和疏水基團構成的高分子化合物;所述稀土配合物為近紅外光激發下發射 可見光或近紅外光的稀土配合物。
[0016] 優選的，所述稀土配合物選自式I、式II和式III結構通式所示化合物中的一種或 多種；
[0017]
[0018] 式I、式II和式III中，La代表銪、鐿或釹離子A1和R2各自獨立為Cl~C4烷基;R 3、 R4、R5、R6、R7和R8各自獨立為甲基或H。
[0019]所述基質材料與所述稀土配合物的質量比為1~10,000:1;組成所述基質材料的 高分子化合物的數均分子量為1，500~150，000;所述高分子化合物中，羧基基團占所述高 分子化合物總質量的〇.01 %~40%。由基質材料和稀土配合物組成的發光體為發光納米粒 子，其粒徑為5~200納米。
[0020] 本發明熒光成像分析方法中的激發光脈沖激發、延時熒光信號采集、信號多次累 積、樣品移動是在時序控制器控制下自動進行。
[0021] 本發明的熒光成像分析方法可以做到無損分析，即為用于激發熒光納米探針的激 發光源位于體外，熒光探測器也位于體外的無創傷檢測。另一種情況是，所述熒光納米探針 的光激發和熒光收集是以將導光管插入體內并接近探測部位的方式進行，所述導光管的前 端位置和探測部位的距離為0.1至3厘米;所述導光管可以是空芯光纖、液芯光纖和覆膜光 纖等。
[0022]在很多情況下，激發、檢測目標部位位于動物皮膚以下，需要使激發光的焦點位于 動物皮膚以下，使激發光焦點處的光功率密度遠大于其它部位的光功率密度;優選的，使皮 膚以下激發光焦點處的光功率密度是皮膚處的光功率密度的2至1000倍，更優選的，是皮膚 處的光功率密度10至1000倍。
[0023] 本發明的熒光成像分析方法可以以功率密度均勻的平場線形飛秒脈沖激光束對 活體動物(注射熒光納米探針)進行掃描激發熒光成像分析;利用時序控制器控制熒光探測 器(如ICCD)延時采集動物體內被上述激發方式激發的熒光納米探針的熒光信號。
[0024] -種方法是，以兩條功率密度均勻的平場線形飛秒脈沖激光束在活體動物皮下聚 焦成一條平場線形脈沖激光束，并以此激光束掃描的方式激發熒光納米探針，利用時序控 制器控制熒光探測器(如ICCD)延時采集動物體內被上述激發方式激發的熒光納米探針的 焚光信號。
[0025] 還可以是，以環形帶狀飛秒脈沖激光束射入動物皮下待測部位聚焦的方式激發熒 光納米探針，利用時序控制器控制熒光探測器(如ICCD)延時采集動物體內被上述激發方式 激發的熒光納米探針的熒光信號。
[0026] 本發明的熒光成像分析方法中，除了采集受激發部位的熒光信號，還可以對受激 發部位的光致發光進行光譜采集，所述光譜采集的波長位于600納米至1000納米范圍。
[0027] 進一步的，在時序控制器下，利用平場線形聚焦激光束對動物體內進行掃描激發， 以光譜儀和ICCD以延時探測的方式采集各受激發位置的光致發光光譜;或者，在時序控制 器下，利用環形帶狀激光束在動物體內進行聚焦激發，以光譜儀和ICCD以延時探測的方式 采集各受激發位置的光致發光光譜。
[0028] 本發明的熒光成像分析方法可應用于研究納米載藥體在動物體內分布、輸運或腫 瘤靶向動力學性質方面，在荷瘤動物或正常動物的靜脈注射熒光納米載藥體模擬探針(簡 稱熒光納米探針)的前后，分別對待測部位進行雙光子激發延時光譜采集檢測，以注射所述 熒光納米探針之前的光譜為背景，利用光譜差減方法，獲得注射所述熒光納米探針后動物 體內受測部位熒光納米探針的光譜信號，以及該信號隨時間變化的動力學性質。
[0029]利用本發明的熒光成像分析方法還可以通過以下步驟實現對藥物靶向性的研究： [0030] 1)對動物靜脈注射熒光納米載藥體模擬探針；
[0031 ] 2)以飛秒脈沖激光激發動物體內一個正常非臟器部位血管中的所述探針發光，以 延時信號采集的方式記錄該部位熒光強度隨時間的變化；
[0032] 3)以飛秒脈沖激光激發動物體內載藥體靶向目標部位中的具有載藥體靶向性的 所述探針發光，以延時信號采集的方式記錄該目標部位熒光強度隨時間的變化；
[0033] 4)以方程Y=AieTtAl+C擬合步驟2)中探針發光強度隨時間衰減的數據；
[0034] 5)以方程Y = AaeTtAl+AbertA2+B擬合步驟3)中探針發光強度隨時間衰減的數據，以 Ab/(Aa+Ab)表征所述探針的載藥體靶向性，以1Λ1表征因免疫系統清除或非特異性吸附導 致所述探針在探測部位的濃度下降速率，以τ2表征所述探針在靶向部位平均滯留時間；其 中C和B為常數或時間的函數。
[0035] 本發明還提供了一種用于實施上述熒光成像分析方法的熒光成像分析設備，主要 部件包括飛秒激光器、熒光探測器、時序控制器、光路控制系統、和用于空間光功率密度分 布調控的光場分布器，其中，飛秒激光器發出的紅光或近紅外脈沖激光經光場分布器的調 節和聚焦后，在時序控制器和光路控制系統的控制下投射到動物體內的待測部位上，激發 待測部位的熒光納米探針發光，然后在時序控制器和光路控制系統的控制下通過熒光探測 器進行延時檢測，所述激發可為雙光子或多光子激發，所述延時的時長為10納秒至500微 秒。
[0036] 進一步的，上述熒光成像分析設備還包括用于實現光源、樣品和/或熒光探測器移 動的運動平臺。
[0037] 所述熒光探測器通常采用KXD探測器，進一步的還可以包括成像光譜儀。
[0038]本發明的焚光成像分析設備利用光場分布器將飛秒激光以空間光場能量分布可 控方式將點或線形激發光束式投射到動物體內的待測部位上。
[0039]所述光場分布器基本上由三個部分構成，以完成所需光場分布調節功能：對激發 光進行擴束的擴束部分，進行光束形狀控制的光場控制光闌，以及將經過調整的激光光束 聚焦的聚焦部分。
[0040] 其中，擴束部分為擴束透鏡組或擴束反射鏡組中的至少一種;光場控制光闌的位 置可位于擴束透鏡組或反射鏡組的鏡片之間，或位于擴束部分和聚焦部分之間，或位于光 束聚焦部分之后的一側;聚焦部分為透鏡、透鏡組、反射聚焦鏡或反射聚焦鏡組中的至少一 種。
[0041] 優選的，所述光場分布器的部件的組合方式如圖1所示，其中凹透鏡1-1和凸透鏡 1-2共同組成擴束透鏡組，光場控制光闌1-3位于擴束透鏡組兩片透鏡之間，經過調整的激 光光束被柱面凸透鏡1-4聚焦后形成線形激發光斑。光場分布器的光學部件集合體(包括擴 束透鏡組、光場控制光闌和聚焦用的柱面凸透鏡)被置于電控平移臺1-5上，可在所述電動 平移臺1-5的驅動下對待測成像部位進行激發光斑的可控掃描。
[0042] 所述光場控制光闌可以為曲線形光闌、帶狀光闌中的至少一種，所述帶狀光闌包 括條帶形光闌和環帶形光闌。
[0043] 所述光場控制光闌結構示意圖如圖2所示，其中：a為曲線形光闌；b為條帶形光闌； c為環帶形光闌。所述曲線形光闌的光透過或光反射區域為兩條曲線型和兩條直線型邊框 圍成的區域，所述曲線的形狀可根據將光功率密度呈高斯分布的飛秒激光束變化為線形平 場飛秒激光束的需要計算獲得。所述條帶形光闌由一個具有兩條直邊的阻止(或減弱)光透 過或光反射的區域將上述曲線形光闌分隔成兩個具有光透過或光反射性能的條帶區域;所 述環帶形光闌的光透過或光反射區域呈環形帶狀，內環中的區域為阻止或削弱光透過或光 反射的區域。所述設備可以控制激發激光在樣品內部形成點狀或線狀聚焦。在環帶形光場 控制光闌（圖2c)的作用下，提高激光在聚焦點處和遠離聚焦點處的功率密度差異。在曲線 形光場控制光闌的作用下，將能量密度呈高斯函數形式分布的激光光束變換成能量密度均 勻的（平場)線形聚焦光束，該光闌的透光區域具有曲線形和直線形邊框（圖2a)，其中曲線 形的形狀可以通過對高斯函數的線聚焦光場分布強度關系進行反向計算獲得。在條帶形光 場控制光闌的作用下，將能量呈高斯函數形式分布的激光光束變換形成平場的線形聚焦光 束;并且在中間條帶形遮擋物對光束的遮擋作用下，提高激光在聚焦線處和遠離聚焦線處 的功率密度差異(圖2b)。
[0044] 可以通過允許和阻隔光的通過來實現對光場的控制，即為透射光闌；也可以通過 允許和阻隔光的反射方式來實現對光場的控制，即為反射光闌。
[0045] 所述光場控制光闌當以透射模式工作時(透射光闌），阻隔光的部分可以是不透光 的材質制成，以獨立自支撐形式存在，透光的部分用中空的形式實現;透光和阻隔光的邊緣 處厚度為500納米到1毫米;也可以通過在透光基質表面上涂布，鍍或粘貼不透光或透光性 差的物質對光進行遮擋形成。
[0046] 所述光場控制光闌的不透光或透光性差的物質為金屬、高分子和含有染料的高分 子中的至少一種，所述透光性基質包括石英、玻璃、高分子樹脂中的一種。
[0047] 所述光場控制光闌以反射模式工作時(反射光闌），允許光的反射可以通過在透明 基底上鍍具有特定反射能力的鍍層來實現，未鍍反射層的部分可以用鍍增透膜、涂黑防止 反射或附加遮擋部件等方式來阻隔光的反射。
[0048] 本發明的熒光成像分析設備，優選的，其各光學和機械功能部件間連接方式和結 構示意圖如圖3、圖4或圖5所示;其各機械、電子控制功能部件間連接方式和結構示意圖如 圖6所示。
[0049] 其中，圖3所示的設備包括用于放置待測動物的樣品平移臺3-3,其光路控制系統 包括二向色鏡3-4、物鏡組3-5、轉向反射鏡3-6、第一成像透鏡組3-7和第二成像透鏡組3-10,熒光探測器包括成像光譜儀3-8、第一ICXD 3-9和第二ICXD 3-11，其光場分布器3-2含 有電控平移臺；來自飛秒激光器的激光3-1經本發明提供的光場分布器3-2的調節和聚焦控 制后經過二向色鏡3-4的反射后形成所述飛秒激發光束并照在樣品平移臺3-3上待測動物 的待測部位上。所述激發光束可以在光場分布器3-2的電控平移臺驅動下掃描激發待測部 位的不同位置;拍攝像場與樣品之間的位置改變通過三維電控的樣品平移臺3-3驅動樣品 移動來實現;產生的信號光透過二向色鏡3-4被物鏡組3-5收集。轉向反射鏡3-6用于控制信 號光通向影像分析端（圖中右側)或是光譜成像分析端（圖中左側）。影像分析端包括第二成 像透鏡組3-10和第二KXD探測器3-11;光譜成像分析端則包括第一成像透鏡組3-7、成像光 譜儀3-8和第一 ICCD探測器3-9。
[0050] 圖4和圖5分別給出了圖3所示設備在僅使用影像分析端或光譜成像分析端工作模 式下的光學和機械部分及其連接結構，在圖4中，產生的信號光透過二向色鏡3-4被物鏡組 3-5收集，經過轉向反射鏡3-6和成像透鏡組3-10后成像在KXD探測器3-11的像平面上;在 圖5中，產生的信號光透過二向色鏡3-4被物鏡組3-5收集，經過轉向反射鏡3-6和成像透鏡 組3-7后成像在成像光譜儀3-8的入口狹縫處，經過光柵分光形成光譜像而被KXD探測器3-9檢測。
[0051] 圖6描述本發明設備（圖3、4、5)的機械電子控制部件的連接結構，飛秒激光器輸出 的激光同步信號輸送至延時發生器，延時發生器控制飛秒激光脈沖與ICCD采集熒光信號時 間之間的精確延時關系。通過計算機給延時發生器和平移臺控制器設定的參數，可以控制 成像采集的空間位置和飛秒激光照射的具體位置;通過計算機設定的參數，快門的通斷決 定在設備工作中激光脈沖在探測器進行采集工作之前的恰當時間激發樣品，并在設定的時 間窗口內收集特定部位的熒光信號。
[0052] 本發明設備利用可編程控制的延時發生器，控制脈沖激發、延時熒光信號采集、信 號多次累積、樣品移動按預定程序自動進行；所述延時為IOns至IOms，優選為IOOns至 500ns。本發明的分析方法和設備可應用在測定熒光納米探針或熒光納米載藥體模擬探針 在動物體內分布、輸運或腫瘤靶向動力學性質方面。
[0053] 上述用于空間光功率密度分布調控的光場分布器和光場控制光闌也屬于本發明 的保護范圍。本發明提供的成像分析方法和設備在測定熒光納米探針或熒光納米載藥體模 擬探針在動物體內分布、輸運或腫瘤靶向動力學性質方面的應用也屬于本發明的保護范 圍。
[0054]本發明提供的活體動物體內熒光納米探針分析方法和設備，克服了傳統活體動物 熒光成像分析方法中穿透深度小、背景熒光干擾大，易產生偽像、難以對體內熒光納米探針 輸運動力學性質進行準確的無創定量分析等缺點，具有成像分析深度大、可靠性高、檢測靈 敏度高等優點，利用該技術可以無創傷的方式定量分析注入動物體內的所述熒光納米探針 的輸運動力學性質，腫瘤靶向動力學性質及所述熒光納米探針在體內的分布等方面的準確 信息(見實施例1)，在納米醫藥研制、新型疾病診斷技術開發等方面具有重要應用價值。如 實施例6所示，本發明的方法和設備可對活體動物表皮以下100個熒光標記腫瘤細胞進行清 楚地成像分析，并可對動物體內所標記的細胞進行定量分析。
[0055] 本發明借助所提供的配有特殊曲線形光場控制光闌的光場分布器，在不引入額外 色散(透鏡組導致的色散除外）的情況下，將能量密度呈高斯形分布的圓形飛秒脈沖激光束 整形為平場線形飛秒脈沖激光束，這是傳統干涉型整形器件所不能實現的。本發明使平場 線形飛秒激光光束在活體動物表皮以下待測部位聚焦，對待測部位進行掃描雙光子激發， 有效地減小的表皮組織在飛秒激光激發下產生的背景熒光，同時解決了因飛秒激光高斯形 光場分布導致激發光功率密度不均，不能用于大視場下準確的雙光子激發延時檢測熒光成 像定量分析的難題，提高的所述雙光子激發成像分析的效率和可靠性。本發明借助所提供 的配有環形帶狀光場控制光闌的光場分布器，使飛秒激光光束在活體動物表皮以下待測部 位聚焦，減小了動物表皮及待測部位周圍熒光納米探針對分析效果的干擾，提高的分析結 果的可靠性。
[0056] 本發明利用雙光子激發高效稀土長壽命發光探針、延時檢測熒光強度分布、延時 光譜采集解析等多項技術的協同耦合效果，實現了體內熒光納米探針或熒光納米載藥體輸 運動力學性質和腫瘤組織靶向結合動力學性質的準確定量分析(參見實施例1)，這一效果 是無法從以往報道的結果中預期而知的。本發明人的研究表明，使用現有商購活體動物熒 光成像分析設備無法獲得準確的上述信息。
【附圖說明】
[0057] 圖1是光場分布器的一種典型結構的示意圖，其中：1-1為凹透鏡，1-2為凸透鏡，1-3為光場控制光闌，1-4為柱面凸透鏡，1-5為電動平移臺。
[0058]圖2顯示了光場控制光闌的三種實施形式:a，曲線形光闌；b，條帶形光闌；c，環帶 形光闌。
[0059]圖3是雙光子激發延時熒光檢測活體動物成像分析設備示意圖，其中：3_1為飛秒 激光，3-2為光場分布器，3-3為樣品平移臺，3-4為二向色鏡，3-5為物鏡組，3-6為轉向反射 鏡，3-7為第一成像透鏡組，3-8為成像光譜儀，3-9為第一 ICXD，3-10為第二成像透鏡組，3-11 為第二 ICCD。
[0060]圖4是雙光子激發成像模式下的結構模式圖，其中：3-1為飛秒激光，3-2為光場分 布器，3-3為樣品平移臺，3-4為二向色鏡，3-5為物鏡組，3-6為轉向反射鏡，3-10為第二成像 透鏡組，3-11為第二ICXD。
[0061]圖5是雙光子激發光譜成像模式下的結構模式圖，其中：3-1為飛秒激光，3-2為光 場分布器，3-3為樣品平移臺，3-4為二向色鏡，3-5為物鏡組，3-6為轉向反射鏡，3-7為第一 成像透鏡組，3-8為成像光譜儀，3-9為第一 KXD。
[0062] 圖6是雙光子激發延時熒光檢測活體動物成像設備整體控制結構示意圖，其中3-5 為物鏡組，3-3為樣品平移臺，3-7為第一成像透鏡組，。
[0063] 圖7是實施例1中，體內不同熒光納米探針熒光強度隨時間變化曲線，其中：a，EuO SMA-mPEG-RGD探針，插圖為放大圖；b，EuOSMA-Tf探針。
[0064] 圖8是實施例2中，活體動物成像分析中雙光子激發延時熒光檢測成像與普通雙光 子激發熒光成像效果比較，其中：a，腿部荷瘤小鼠明場圖；b、c分別為注射熒光納米探針前 后普通雙光子激發熒光成像結果;d、e分別為注射熒光納米探針前后雙光子激發延時熒光 檢測成像結果;標尺為2mm。
[0065] 圖9顯示了實施例2中成像分析方法探測深度實驗結果，其中：a，脂肪組織模擬液 (1%)熒光成像;b，置于5_厚的脂肪組織模擬液(1%)之下的熒光納米探針的熒光成像;C， 置于7_厚的脂肪組織模擬液(1 % )之下的熒光納米探針的熒光成像。
[0066]圖10顯示了實施例4中，飛秒激光光場分布調控效果，其中a，在垂直于光束方向上 入射飛秒脈沖激光光功率密度分布圖；b,光場分布器整形后的飛秒脈沖線形激光光功率密 度分布圖，虛線為直接使用柱透鏡進行線聚焦的光場分布圖，實線為經曲線形光場控制光 闌后再進行柱透鏡線聚焦之后的光場分布圖。
[0067]圖11顯示了實施例5中雙光子激發延時熒光檢測成像分析中的熱效應。
【具體實施方式】
[0068] 為了更加清楚地說明本發明的效果，提供以下實施例，但本發明的內容并不限于 這些實施例，所使用的材料如無特別說明，均可通過商購獲得。
[0069] 實施例1、荷瘤小鼠體內熒光納米探針腫瘤靶向動力學分析
[0070] 在裸鼠的右后腿上建立用于雙光子激發時間分辨成像的HepG-2肝癌模型。實驗中 分別使用轉鐵蛋白（Tf)和RGD修飾的含10%Eu(tta) 3bpt的苯乙烯-馬來酸酐共聚合物 (SMA)納米粒子(16nm)，獲得兩種表面上分別接有不同腫瘤識別分子的雙光子敏化Eu 3+發光 的熒光納米探針。通過尾靜脈注射300微升含有1.5mg熒光納米探針的膠體溶液，然后，采用 吸入式呼吸麻醉系統將老鼠麻醉，以保證在成像過程中老鼠不會產生明顯的位移。在本發 明雙光子激發時間分辨成像設備上，采用波長為SOOnm的飛秒脈沖激光激發所需分析部位 體內熒光納米探針，在每個激光脈沖過后經500ns延時，再收集500ns到3ms之間的熒光信 號，然后累計收集5000次上述激發-延時檢測得到的信號用于成像分析。該實驗中激光輸出 功率為500mW，脈寬為100飛秒，重復速率為250Hz。
[0071] 實驗中我們分別對荷瘤鼠的腫瘤部位和另一條腿部的無腫瘤相應部位進行了成 像分析。以方程Y=AieTtAl+C擬合腿部無腫瘤相應部位探針發光強度隨時間（t)衰減的數 據，以方程Y = AaeTtAl+AbertA2+B擬合腫瘤部位探針發光強度隨時間衰減的數據，以A b/(Aa+ Ab)表征所述熒光納米探針的腫瘤靶向性，以1Λ1表征因免疫系統清除或非特異性吸附導 致熒光納米探針在探測部位的濃度下降速率，以τ2表征所述納米粒子在腫瘤組織上的結合 或受陷強度(平均滯留時間）；其中C和B為常數。實驗測得的熒光強度隨時間變化的曲線如 圖7所示，數據擬合分析結果列于表1。由表1中實驗結果可知，表面接枝RGD分子獲得的納米 載藥體(Eu@SMA-RGD-mPEG)(熒光納米探針）的腫瘤靶向效率(94 % )遠高于表面接枝Tf獲得 的納米載藥體(EuOSMA-Tf)(焚光納米探針）的腫瘤靶向效率(44%)，前者的腫瘤組織結合 效果（134)也優于后者(93)。
[0072]表1、熒光納米探針腫瘤靶向動力學分析結果 [nn7^!i
[0074] 實施例2、活體動物成像分析中雙光子激發延時熒光檢測成像與普通雙光子激發 熒光成像效果比較
[0075] 該實施例中，雙光子激發延時檢測成像實驗條件與實施例1相同，在普通雙光子激 發熒光成像實驗中激發條件相同，延時為零納秒。我們對熒光探針注射前后荷瘤小鼠腫瘤 區域分別進行了雙光子激發延時熒光檢測成像和普通雙光子激發熒光成像。結果如圖8所 示。該實驗結果表明，使用本發明提供的方法和設備可以有效消除雙光子激發活體動物成 像分析中的背景熒光對成像分析的影響，獲得可靠的熒光納米探針腫瘤靶向性質分析結 果。
[0076] 實施例3、本發明成像分析方法探測深度實驗
[0077] 將熒光納米探針固定于容器底部，在容器中注入脂肪組織模擬液，調節底部探針 上覆蓋的脂肪組織模擬液的厚度，采用本發明延時熒光檢測方法和設備使激發光從頂部穿 過組織模擬液激發探針，在液面上方進行成像分析，激發與檢測條件如實施例1。如圖9所 示，結果表明，該實驗中熒光成像探測深度大于7mm，較以往的可靠熒光成像探測深度有了 顯著提高。研究表明通過改變激發光功率和熒光納米探針種類可以進一步大幅度提高探測 深度。
[0078] 實施例4、本發明設備對飛秒激光光場分布的調控
[0079] 使一束波長為700-900納米(脈寬lOOfs)，在垂直于激光傳播方向的平面上的光場 強度或功率密度分布為高斯函數形狀的飛秒脈沖光束（圖l〇a)，通過配有圖2a所示曲線形 光場控制光闌的本發明設備（圖3)，實驗測得出射的飛秒脈沖激光光束為平場的線形聚焦 光束，其能量分布如圖IOb所示。該實驗表明經本發明設備光場分布器整形可使飛秒激光線 形聚焦光束的能量分布均勻化，這使本發明設備可以線掃描的方式對活體動物進行雙光子 激發延時檢測熒光成像定量分析，從而實現在大視場下對活體動物體內熒光納米探針輸運 及腫瘤靶向動力學性質進行定量分析。
[0080] 實施例5、體內熒光納米探針動力學測試方式與溫度控制
[0081] 雙光子激發活體動物成像中需要考慮溫度控制問題以防止對動物的熱損傷及發 熱對分析結果產生顯著干擾，本發明的研究表明，采用飛秒激發-延時熒光檢測的成像方式 可有效控制照射部位的溫度升高。該實驗中，我們以輸出功率為480mW，脈寬為100飛秒，重 復速率為250Hz的激光連續工作24秒后，以紅外成像儀探測照射部位的溫度隨時間的變化 (圖11)，實驗結果表明，在該工作條件下成像部位的溫度升高小于2度，該溫度變化不會對 本發明成像分析方法的結果產生顯著影響。
[0082]本發明的研究表明，通過改變飛秒激光輸出功率和重復速率可以進一步顯著減小 本發明雙光子激發-延時熒光檢測成像分析方法中的溫度變化。
[0083]實施例6、體內腫瘤細胞雙光子激發延時熒光檢測成像分析 [0084]以包埋有Eu(tta)3bpt表面接枝轉鐵蛋白（Tf)的稀土發光熒光納米探針EuOPM/ SMA-Tf探針(33納米)標記HepG-2腫瘤細胞。利用無血清DMEM培養基調節細胞濃度為I X IO5 個/ml，I X IO4個/ml、I X IO3個/ml，各取100μΙ不同細胞濃度經納米探針標記的HepG-2細胞 接種于雄性裸鼠右后腿部皮下。于裸鼠右后腿部皮下接種100μΙ細胞濃度為IX IO5個/ml的 無標記的HepG-2細胞作為對照組。
[0085]采用本發明提供的設備(如圖3和圖6所示），在飛秒脈沖激光輸出總功率為500mw， 激發波長為800nm，激光脈沖頻率250HZ，延時為550ns條件下對上述4組動物腫瘤細胞接種 部位樣品進行了所述雙光子激發延時熒光檢測成像分析。結果表明該成像分析對裸鼠皮下 接種腫瘤細胞的檢測限好于100個細胞，接種1000個細胞部位的探針熒光信號強度為接種 100個細胞部位的3.5倍;接種10000個細胞部位的探針熒光信號強度為接種100個細胞部位 的23倍。對對照組樣品進行的5次平行分析表明，儀器自身靈敏度(檢測限)好于0.3%。 [0086]該實驗結果表明本發明提供的分析方法和設備可以實現對活體動物體內標記腫 瘤細胞及其濃度變化進行高精度成像分析。
【主權項】
1. 一種熒光成像分析方法，用于分析活體動物體內組織和器官中熒光納米探針的熒光 強度和分布，其特征在于，以紅光或近紅外脈沖激光雙光子激發體內熒光納米探針發光，以 延時檢測的方式探測體內受激發部位的熒光，進行成像。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，成像的視場至少有一維尺寸在1毫米至10 厘米范圍內。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用熒光探測器延時檢測體內受激發成像 部位的熒光，所述延時為激發光脈沖激發后到熒光探測器開啟之前的時差，該時差為IOns 至500ys;延時檢測焚光的時間窗口為IOns至100ms。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過紅光或近紅外飛秒脈沖激光激發熒光 納米探針中的雙光子敏化稀土發光配合物發光，所述紅光或近紅外飛秒脈沖激光的波長在 610-1100納米范圍內；所述稀土發光的波長位于600至1050納米范圍內。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述熒光納米探針的發光體基本上由基質 材料和具有雙光子敏化稀土發光性能的稀土配合物組成，所述基質材料是由主鏈為碳氫 鏈、側基為羧基和疏水基團構成的高分子化合物;所述稀土配合物為近紅外光激發下發射 可見光或近紅外光的稀土配合物。6. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述稀土配合物選自如下式I、式II和式 III結構通式所示化合物中的一種或多種；式I、式II和式III中，La代表銪、鐿或釹離子也和R2各自獨立為Cl~C4烷基;R3、R4、R 5、 R6、R7和R8各自獨立為甲基或Η。7. 根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述基質材料與所述稀土配合物的質量比 為1~10，000:1;組成所述基質材料的高分子化合物的數均分子量為1，500~150，000;所述 高分子化合物中，羧基基團占所述高分子化合物總質量的0.01 %~40 % ;由基質材料和稀 土配合物組成的發光體為發光納米粒子，其粒徑為5~200納米。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，激發熒光納米探針的激發光源位于動物體 外，采集體內受激發成像部位熒光的熒光探測器也位于體外;或者，所述熒光納米探針的光 激發和熒光信號采集是以將導光管插入體內并接近探測部位的方式進行，所述導光管的前 端位置和探測部位的距離為0.1至3厘米。9. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，激發、檢測目標部位位于動物皮膚以下，使 激發光的焦點位于動物皮膚以下，且激發光焦點處的光功率密度是皮膚處的光功率密度的 2至1000倍，優選為10至1000倍。10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于，以兩條功率密度均勻的平場線形飛秒脈 沖激光束在活動物皮下聚焦成一條平場線形脈沖激光束，并以此激光束掃描的方式激發熒 光納米探針;或者，以環形帶狀飛秒脈沖激光束射入動物皮下待測部位聚焦的方式激發熒 光納米探針;然后，利用時序控制器控制熒光探測器延時采集動物體內被激發的熒光納米 探針的熒光信號。11. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，對受激發成像部位的光致發光進行光譜 采集，所述光譜采集的波長范圍在600~1000納米范圍內。12. 根據權利要求11所述的方法，其特征在于，在時序控制器下，利用平場線形聚焦激 光束對動物體內進行掃描激發，以光譜儀和ICCD以延時探測的方式采集各受激發部位的光 致發光光譜;或者，在時序控制器下，利用環形帶狀激光束在動物體內進行聚焦激發，以光 譜儀和ICCD以延時探測的方式采集各受激發位置的光致發光光譜。13. -種研究納米載藥體在動物體內分布、輸運或腫瘤靶向動力學性質的方法，對荷瘤 動物或正常動物靜脈注射熒光納米載藥體模擬探針，在注射前后分別對待測部位利用權利 要求1~12任一所述的方法進行雙光子激發延時光譜采集檢測，以注射所述探針之前的光 譜為背景，利用光譜差減方法，獲得注射所述探針后動物體內受測部位探針的光譜信號，以 及該信號隨時間變化的動力學性質。14. 一種研究納米載藥體在動物體內分布、輸運或腫瘤靶向動力學性質的方法，利用權 利要求1~12任一所述的熒光成像分析方法進行，包括以下步驟： 1) 對動物靜脈注射熒光納米載藥體模擬探針； 2) 以飛秒脈沖激光激發動物體內一個正常非臟器部位血管中的所述探針發光，以延時 信號采集的方式記錄該部位熒光強度隨時間的變化； 3) 以飛秒脈沖激光激發動物體內載藥體靶向目標部位中的具有載藥體靶向性的所述 探針發光，以延時信號采集的方式記錄該目標部位熒光強度隨時間的變化； 4) 以方程Y=AieTtAl+C擬合步驟2)中探針發光強度隨時間衰減的數據； 5) 以方程Y = AaeTtAl+AbertA2+B擬合步驟3)中探針發光強度隨時間衰減的數據，以A b/ (Aa+Ab)表征所述探針的載藥體靶向性，以1Λ1和1Λ2表征因免疫系統清除或非特異性吸附 導致所述探針在探測部位的濃度下降速率，以τ3表征所述探針在靶向部位平均滯留時間； 其中C和B為常數或時間的函數。15. -種熒光成像分析設備，用于分析活體動物體內組織和器官中熒光納米探針的分 布和熒光強度，所述設備包括飛秒激光器、熒光探測器、時序控制器、光路控制系統和用于 空間光功率密度分布調控的光場分布器，其中，飛秒激光器發出的紅光或近紅外脈沖激光 經光場分布器的調節和聚焦后，在時序控制器和光路控制系統的控制下投射到動物體內的 待測部位上，激發待測部位的熒光納米探針發光，然后在時序控制器和光路控制系統的控 制下通過熒光探測器進行延時檢測。16. 根據權利要求15所述的設備，其特征在于，所述設備還包括用于實現光源、樣品和/ 或熒光探測器移動的運動平臺。17. 根據權利要求15所述的設備，其特征在于，所述熒光探測器是ICCD探測器和/或成 像光譜儀。18. 根據權利要求15所述的設備，其特征在于，所述光場分布器基本上由三個部分構 成:對激發光進行擴束的擴束部分，進行光束形狀控制的光場控制光闌，以及將經過調整的 激光光束聚焦的聚焦部分。19. 根據權利要求18所述的設備，其特征在于，所述光場分布器的擴束部分為擴束透鏡 組或擴束反射鏡組中的至少一種;所述光場控制光闌的位置位于擴束透鏡組或反射鏡組的 鏡片之間，或位于擴束部分和聚焦部分之間，或位于聚焦部分之后的一側;所述聚焦部分為 透鏡、透鏡組、反射聚焦鏡或反射聚焦鏡組中的至少一種。20. 根據權利要求19所述的設備，其特征在于，所述光場分布器中，由凹透鏡和凸透鏡 組成擴束透鏡組，光場控制光闌位于擴束透鏡組的兩片透鏡之間，經過調整的激光光束被 柱面凸透鏡聚焦后形成線形激發光斑;所述擴束透鏡組、光場控制光闌和柱面凸透鏡置于 電控平移臺上，在所述電動平移臺的驅動下對待測成像部位進行激發光斑的可控掃描。21. 根據權利要求18所述的設備，其特征在于，所述光場控制光闌為曲線形光闌和帶狀 光闌中的至少一種，所述帶狀光闌包括條帶形光闌和環帶形光闌。22. 根據權利要求21所述的設備，其特征在于，所述曲線形光闌的光透過或光反射區域 為兩條曲線型和兩條直線型邊框圍成的區域，所述曲線的形狀根據將光功率密度呈高斯分 布的飛秒激光束變化為線形平場飛秒激光束的需要計算獲得;所述條帶形光闌由一個具有 兩條直邊的阻止或減弱光透過或光反射的區域將所述曲線形光闌分隔成兩個具有光透過 或光反射性能的條帶區域;所述環帶形光闌的光透過或光反射區域呈環形帶狀，內環中的 區域為阻止或削弱光透過或光反射的區域。23. 根據權利要求18所述的設備，其特征在于，所述光場控制光闌為透射光闌或反射光 闌。24. 根據權利要求15所述的設備，其特征在于，所述設備還包括用于放置待測動物的樣 品平移臺，所述光路控制系統包括二向色鏡、物鏡組、轉向反射鏡和成像透鏡組，所述熒光 探測器包括ICCD和/或成像光譜儀，所述光場分布器帶有電控平移臺；飛秒激光器發出的激 光經光場分布器的調節和聚焦控制后經過二向色鏡的反射，形成飛秒激發光束照在樣品平 移臺上的待測動物的待測部位上;所述飛秒激發光束在光場分布器的電控平移臺驅動下掃 描激發待測部位的不同位置;拍攝像場與樣品之間的位置改變通過樣品平移臺驅動樣品移 動來實現;產生的信號光透過二向色鏡被物鏡組收集，然后經過轉向反射鏡和成像透鏡組 后由KXD探測，和/或，經過轉向反射鏡和另一成像透鏡組后由成像光譜儀和另一KXD探 測 。25. 根據權利要求15所述的設備，其特征在于，所述時序控制器為可編程控制的延時發 生器，飛秒激光器輸出的激光同步信號輸出至延時發生器，延時發生器控制飛秒激光脈沖 與熒光探測器采集時間之間的精確延時關系;所述設備還包括樣品平移臺，所述光場分布 器帶有電控平移臺，樣品平移臺和光場分布器的電控平移臺由平移臺控制器控制;通過計 算機給延時發生器和平移臺控制器設定的參數，控制成像采集的空間位置和飛秒激光照射 的具體位置;通過計算機設定參數，經快門控制器控制快門的通斷，決定激光脈沖在熒光探 測器進行采集工作之前的恰當時間激發樣品，并在設定的時間窗口內收集特定部位的熒光 信號。26. -種光場分布器，包括擴束部分、光場控制光闌和聚焦部分，其中：所述擴束部分為 擴束透鏡組或擴束反射鏡組中的至少一種;所述光場控制光闌的位置位于擴束透鏡組或反 射鏡組的鏡片之間，或位于擴束部分和聚焦部分之間，或位于聚焦部分之后的一側;所述聚 焦部分為透鏡、透鏡組、反射聚焦鏡或反射聚焦鏡組中的至少一種。27. 根據權利要求26所述的光場分布器，其特征在于，所述擴束部分為由凹透鏡和凸透 鏡組成的擴束透鏡組;光場控制光闌位于擴束透鏡組的兩片透鏡之間；所述聚焦部分為柱 面凸透鏡，位于所述擴束透鏡組的凸透鏡之后;所述擴束透鏡組、光場控制光闌和柱面凸透 鏡置于電控平移臺上。28. 根據權利要求26所述的光場分布器，其特征在于，所述光場控制光闌為曲線形光闌 和帶狀光闌中的至少一種，所述帶狀光闌包括條帶形光闌和環帶形光闌。29. 根據權利要求28所述的光場分布器，其特征在于，所述曲線形光闌的光透過或光反 射區域為兩條曲線和兩條直線圍成的區域，所述曲線的形狀根據將光功率密度呈高斯分布 的飛秒激光束變化為線形平場飛秒激光束的需要計算獲得;所述條帶形光闌由一個具有兩 條直邊的阻止或減弱光透過或光反射的區域將所述曲線形光闌分隔成兩個具有光透過或 光反射性能的條帶區域;所述環帶形光闌的光透過或光反射區域呈環形帶狀，內環中的區 域為阻止或削弱光透過或光反射的區域。
【文檔編號】A61B5/00GK105891170SQ201610078236
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年2月4日
【發明人】王遠, 付利民, 張建平, 楊文云, 文學, 劉禹辰
【申請人】北京大學, 中國人民大學