一種雙通道結構光照明超分辨成像方法與裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種雙通道結構光照明超分辨成像方法與裝置。
【背景技術】
[0002]脂筏在細胞質膜上信號傳導中起重要作用，利用熒光顯微成像技術直接觀察脂筏微結構及其相應細胞功能具有重要意義。由于傳統熒光顯微鏡的分辨率存在衍射極限，無法對脂筏進行檢測。近年來發展的一些超分辨成像技術，如受激輻射耗損顯微術(STED)、光激活定位顯微術(PALM)等最近也開始被用于脂筏研究，然而，它們都只是被用于探測脂筏簇，而無法檢測脂筏周圍的物理環境。近來發展的一些可通過其發射光譜的變化來反映所處物理環境的環境敏感探針。這類探針需要使用雙熒光探測通道同時探測，并結合發射光譜平移來確定和區分細胞膜上液態有序相與無序相。目前，這類探針都只局限于在傳統型的雙通道熒光顯微鏡上進行探測，所獲得圖像的空間分辨率受衍射極限限制。

【發明內容】

[0003]為了解決上述問題，本發明方案提出了一種單光源激發的雙通道同時探測的結構光照明超越衍射極限空間分辨率的顯微成像方法與裝置。利用本方案，可以在亞衍射分辨率尺度實現細胞膜上脂筏多相性的檢測。
[0004]本發明的第一具體實施方案是:一種雙通道結構光照明超分辨顯微成像裝置，其特征在于，包括光源及用于控制光路方向的沿光傳輸方向依次設置的第I反射鏡、第I透鏡、光闌、第II透鏡及位于第II透鏡后側的能改變結構光照明方向的空間光調制器；
沿所述空間光調制器導出光路方向依次設有第III透鏡、擋光板、第IV透鏡，所述光調制器導出的光經第III透鏡受到擋光板阻擋形成僅允許+1級衍射光和-1級光通過的光路；所述第IV透鏡導出光經一熒光顯微鏡傳輸至第II 二色鏡，所述第II 二色鏡光的導出方向分別設置有第I探測器和第II探測器，所述第I探測器和第II探測器與第II二色鏡光之間設有帶通濾光片。
[0005]進一步的，所述入射到空間光調制器的光入射角度< 10°。
[0006]進一步的，所述熒光顯微鏡包括物鏡、樣品臺以及用于接收第IV透鏡導入光的第V透鏡，所述第V透鏡后側設有接收第V透鏡導入光并向物鏡導入光源及接收樣品出射的經物鏡導出光的第I 二色鏡，所述第I 二色鏡導出光經第VI透鏡導向所述第II二色鏡。
[0007]進一步的，所述光源為激光器。
[0008]本發明的第二具體實施方案是:利用上述的一種雙通道結構光照明超分辨顯微成像裝置的雙通道結構光照明超分辨成像方法，包括以下步驟:
(I)采集相關熒光圖像
步驟S1:空間光調制器的相位控制圖像設置為光照方向為90°、相位為O時，利用第I探測器和第II探測器采集熒光圖像；
步驟S2:空間光調制器的相位控制圖像設置為光照方向為90°、相位為時，利用第I探測器和第II探測器采集熒光圖像；
步驟S3:空間光調制器的相位控制圖像設置為光照方向為90°、相位為時，第I探測器和第II探測器采集熒光圖像；
步驟S4:空間光調制器的相位控制圖像設置為光照方向為0°、相位為O時，第I探測器和第II探測器采集熒光圖像。
[0009]步驟S5:空間光調制器的相位控制圖像設置為光照方向為0°、相位為時，第I探測器和第II探測器采集熒光圖像。
[0010]步驟S6:空間光調制器的相位控制圖像設置為光照方向為0°、相位為時，第I探測器和第II探測器采集熒光圖像。
[0011](2)重構超分辨率圖像步驟:
步驟S1:對圖像采集步驟(I)中第I探測器采集到的6張原始圖像進行圖像亮度均一化處理以消除由于光源強度波動引起的成像亮度的影響；
步驟S2:對上述圖像進行傅里葉變換操作，獲得相應的頻譜信息；
步驟S3:由各方向的三個相位圖像對應頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出O級，+1級和-1級頻譜成像信息；
步驟S4:由分離出O級與+1級或-1級頻譜的重疊區域的信息確定結構光照明的空間頻率k0與初始相位；
步驟S5:將分離出的+1級頻譜平移+k0，將分離出的和-1級頻譜平移_k0 ;
步驟S6:將平移后的+1級和-1級頻譜與O級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜擴寬；
步驟S7:對上一步驟得到的擴寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得第I探測器采集的超分辨圖像。
[0012]步驟S8:對圖像采集步驟(I)中第II探測器采集到的6張原始圖像進行圖像亮度均一化處理以消除由于光源強度波動引起的成像亮度的影響；
步驟S9:對上述圖像進行傅里葉變換操作，獲得相應的頻譜信息；
步驟SlO:由各方向的三個相位圖像對應頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出O級，+1級和-1級頻譜成像信息；
步驟Sll:由分離出O級與+1級或-1級頻譜的重疊區域的信息確定結構光照明的空間頻率k0與初始相位；
步驟S12:將分離出的+1級頻譜平移+k0，將分離出的和-1級頻譜平移_k0 ;
步驟S13:將平移后的+1級和-1級頻譜與O級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜擴寬；
步驟S14:對上一步驟得到的擴寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得第II探測器采集的超分辨圖像。
[0013]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:本發明公開一種雙通道結構光照明超分辨成像方法與裝置，利用該裝置通過合理的采集及重構超分辨率圖像方法，克服了現有技術中探針都只局限于在傳統型的雙通道熒光顯微鏡上進行探測，所獲得圖像的空間分辨率受衍射極限限制的缺陷，可以在超空間分辨率尺度測量細胞膜上脂筏的多相性。
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明實施例方案的原理示意圖；
圖2為本發明實施例提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統在光照方向為90°、相位為O時的空間光調制器的控制圖像；
圖3為本發明實施例提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統在光照方向為90°、相位為時的空間光調制器的控制圖像；
圖4為本發明實施例提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統在光照方向為90°、相位為時的空間光調制器的控制圖像；
圖5為本發明實施例提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統在光照方向為0°、相位為O時的空間光調制器的控制圖像；
圖6為本發明實施例提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統在光照方向為0°、相位為時的空間光調制器的控制圖像；
圖7為本發明實施例提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統在光照方向為0°、相位為時的空間光調制器的控制圖像；
圖中激光器，2-第I反射鏡，3-第II反射鏡，4-第I透鏡，5-光闌，6-第II透鏡，7-空間光調制器，8-第III透鏡，9-擋光板，10-第IV透鏡，11-熒光顯微鏡，12-第V透鏡，13-第I 二色鏡，14-物鏡，15-樣品臺，16-第VI透鏡，17-第II 二色鏡，18-第I帶通濾光片，19-第II帶通濾光片，20-第I探測器，21-第II探測器。
【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步詳細的說明。
[0016]參見附圖1，本發明實施例一提供的雙通道結構光照明超分辨顯微成像系統包括普通熒光顯微鏡11，普通熒光顯微鏡11包括依次設置的第V透鏡12、第I 二色鏡13、物鏡14、樣品臺15、第VI透鏡16。該成像系統還包括光源1、第I反射鏡2、第II反射鏡3、第I透鏡4，光闌5，第II透鏡6，空間光調制器7、第III透鏡8、擋光板9、第IV透鏡10、第II 二色鏡17、第I帶通濾光片18、第II帶通濾光片19、第I探測器20和第II探測器21。激光入射到空間光調制器7的入射角度< 10°，擋光板9用于阻擋空間光調制器的O級衍射光而允許+1級衍射光和-1級光通過。
[0017]由光源I發射的光依次經過第I反射鏡2、第II反射鏡3、第I透鏡4，光闌5，第II透鏡6，空間光調制器7、第III透鏡8、擋光板9、第IV透鏡10后，經過普通物鏡14后，激發的熒光經第II 二色鏡17分成兩路，一路經第I帶通濾光片18、第I探測器20接收