一種β-羥丁酸的測定方法及其測定試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，具體涉及一種β-羥丁酸的循環酶測定方法及 其測定試劑盒。
【背景技術】
[0002] 酮體是甘油三酯的代謝產物。當體內的葡萄糖絕對或相對不足時，就會大量分解 體內的甘油三酯生成甘油和脂肪酸，脂肪酸在肝臟氧化生成能量和和酮體，該酮體包括2% 的丙酮、23%的乙酰乙酸和75%的β-羥丁酸，若體內酮體含量過高就會引起酮癥酸中毒。酮中 毒是一種危險生命的疾病。及時、準確地檢測酮體水平是預知酮癥酸中毒的很需要手段。酮 體也是檢測和控制糖尿病的重要標志物。
[0003] 酮體和血糖一樣，是檢測代謝控制的一項重要的標記物。I型糖尿病病人的最重要 的特征之一就是易發展成為酮癥酸中毒，這是由于胰島素相對或絕對缺乏，葡萄糖的利用 障礙，機體就過度消耗脂肪，產生大量的酮體，造成酮癥酸中毒，是一種威脅生命的疾病。Π 型糖尿病的后期，因胰島素治療無效，而過度消耗體內的甘油三酯，產生大量的酮體，形成 酮癥酸中毒。另外，糖尿病的孕婦更易發生酮癥酸中毒，是因為胎兒生長發育非常快，需要 大量的營養和能量，母體的高酮血癥容易發生死胎，或影響胎兒神經系統的發育。因此及時 準確地檢測酮體水平是十分關鍵的，是預知酮癥酸中毒的重要手段。
[0004] 上個世紀，我國在臨床上普遍使用的是以硝普鈉鹽為基礎的定性或半定量檢測方 法。此方法只能檢測丙酮和乙酰乙酸，但是這兩者含量都很低，約占總酮體的話30%以下，最 大的問題是兩者都不穩定，容易揮發和分解，因此，就造成了靈敏度低，重復性和特異性差， 容易出現假陽性或假陰性，造成誤診誤治。另外，在酮癥酸中毒的不同時期兩者的濃度與病 情的發展不呈一致性。而羥丁酸就不同了，它占酮體的75%左右，含量比較高，化學性質穩 定，最主要是檢測的濃度和病情的發展、恢復密切相關。
[0005] 酶法測定β_羥丁酸具有靈敏度高、特異性好、快速簡便等優點，成為臨床檢測常用 方法。酶法分為一步酶法和循環酶法。
[0006] 《全國臨床檢驗操作規程》（第四版），發明專利號為CN 200610151020.4、CN 200610151021.9和CN 99112967.9的專利所采用的是一步酶法： H-iii i .....m變空乙織乙竣羅頻麟 f 在340nm處檢測吸光度上升值，求出β-羥丁酸的量，該方法原理和試劑結構都簡單，因 為β-羥丁酸的含量很低，所以反應靈敏度差，重復性差，誤差比較大。
[0007] 發明專利號為CN 200910155638.1和CN1 201110267888.1的專利采用的是循環酶 法： 在β-羥丁酸脫氫酶反應的基礎上偶聯黃遞酶，使無色的氧化型硝基四氮唑藍生成紅色 的還原型硝基四氮唑藍，在505nm處檢測吸光度的變化，計算出β-羥丁酸的含量，反應過程 如下：
該反應循環進行，將產物進行放大，其靈敏度較一步法提高了 10倍，線性范圍也大幅提 高，但是增加了黃遞酶和氧化型INT，使試劑成本很高，而且氧化型INT溶解度差，也不穩定。 目前，常采用三試劑法，操作步驟繁瑣，穩定性仍不及動力學法，致使其在臨床上的推廣受 到限制。
[0008] 發明專利號為CN 201110267888.1的專利，在原有循環酶法基礎上添加保護劑，所 提供的試劑盒穩定性得到提高。由于乳酸、抗環血酸對反應產生干擾，還需添加抗干擾劑， 試劑成本相對較高。

【發明內容】

[0009] 本發明針對現有技術的上述不足，旨在提供一種線性范圍大、準確度和精密度高、 抗干擾性強、成本低、操作簡便的羥丁酸測定方法和測定用液體試劑盒。
[0010] 為解決上述技術問題，本發明所采用方法為:樣本中的β_羥丁酸被β_羥丁酸脫氫 酶和硫代氧化型輔酶I(Thio_NAD+)特異性氧化，生成乙酰乙酸和硫代還原型輔酶I(Thi〇-NADH);乙酰乙酸在β-羥丁酸脫氫酶及還原型輔酶I (NADH)存在下，又生成β-羥丁酸和氧化 型輔酶I (NAD+)，反應循環進行，產生大量的硫代還原型輔酶I (Thio-NADH)，通過405nm波長 下測定生成的Thio-NADH的吸光度變化來定量樣本中的β-羥丁酸含量，其反應方程式如下：
該方法對樣本中微量的β-羥丁酸起放大作用，β-羥丁酸的計算公式如下：
[0011] 該試劑盒由以下組分構成： β-羥丁酸脫氫酶 1-100 KU/L 緩沖液 5-500 mmol/L 表面活性劑 0.005-5% 穩定劑 0.005-50% 硫代氧化型輔酶 I (Thi〇-NAD+) 0.01-10mmol/L 還原型輔酶 0.01-10mmol/L。
[0012] 所述的還原型輔酶是NADH或NADPH中的一種。
[0013] 所述的緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖 液、Tr i s緩沖液、CAPS或MES緩沖液中的一種。
[0014] 所述的表面活性劑可以是TritonX-100、Brij-35或吐溫-20中的一種。
[0015] 所述的穩定劑是乙二醇、小牛血清白蛋白、甘露醇或山梨醇中的一種。
[0016] 本發明技術方案的實質特點和顯著進步主要體現在： 1) 采用循環酶法，靈敏度高、線性范圍大； 2) 采用硫代氧化型輔酶I代替常規循環酶法中的氧化型INT和黃遞酶，解決了氧化型 INT溶解性差且不穩定給試劑檢測帶來的步驟繁瑣、不穩定等缺陷。也有效避免了乳酸脫氫 酶、乳酸、抗環血酸等物質干擾。試劑盒成本大幅度降低，檢測準確性提高； 3) 該試劑盒配方簡單、穩定性強、操作簡便，通過生化儀可快速得到測定結果，便于行 業內廣泛推廣應用。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明主檢批線性曲線圖； 圖2為本發明反應曲線圖。 下面將結合【具體實施方式】進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限于下 列實施方式。 【具體實施方式】 [0018] 實施例1 β-羥丁酸的測定方法：樣本中的β-羥丁酸被β-羥丁酸脫氫酶和硫代氧化型輔酶I (Thi〇-NAD+)特異性氧化，生成乙酰乙酸和硫代還原型輔酶I(Thio-NADH);乙酰乙酸在β-羥 丁酸脫氫酶及還原型輔酶I (NADH)存在下，又生成β-羥丁酸和氧化型輔酶I (NAD+)，反應循 環進行，產生大量的硫代還原型輔酶I(Thio-NADH)，通過405nm波長下測定生成的Thio-NADH的吸光度變化來定量樣本中的β-羥丁酸含量，該方法對樣本中微量的β-羥丁酸起放大 作用，其反應方程式如下：
羥丁酸的測定試劑盒為雙試劑，分為試劑Α和試劑Β。
[0019]試劑 A: 磷酸鹽緩沖液(PH4.0) 5mmol/L Thio-NAD 0.01mmol/L 表面活性劑Brij-35 〇.5g/L 防腐劑 NaN3 〇.9g/L 試劑B: Tris 緩沖液(ρΗ9·0) 200mmol/L β-羥丁酸脫氫酶 1 KU/L NADH 0.04mmol/L 甘露醇 50g/L 其檢測方法是采用具有雙試劑功能的自動生化分析儀，操作如下： 溫度:37°C;波長:405nm/660nm;檢測方法:速率法;反應方向：正
計算： :r，T__i
實施例2 β-羥丁酸的測定方法同實施例1; β-羥丁酸的測定試劑盒為雙試劑，分為試劑Α和試劑Β。
[0020]試劑 A: MES 緩沖液(pH4.0) 8mmol/L Thi〇-NAD+ 0.05mmol/L TritonX-100 l.Oml/L 防腐劑 NaN3 〇.5g/L 試劑B: Caps 緩沖液(pH9.0) 200mmol/L β-羥丁酸脫氫酶 3 KU/L NADH 0.10mmol/L 穩定劑乙二醇 70ml/L 其檢測方法及計算公式同實施例1。
[0021 ] 實施例3 β-羥丁酸的測定方法同實施例1; β-羥丁酸的測定試劑，分為試劑Α和試劑Β。
[0022]試劑 A: 甘氨酸緩沖液(pH 4.5) 10mmol/L Thi〇-NAD+ 0.15mmol/L 吐溫-20 (Tween-20) 0.5g/L 防腐劑 NaN3 〇.9g/L 試劑B: Tris 緩沖液(ρΗ9·0) 300mmol/L β-羥丁酸脫氫酶 4 KU/L NADH 0.08mmol/L 小牛血清白蛋白（BSA) l.〇g/L 乙二醇 300ml/L 其檢測方法及計算公式同實施例1。
[0023]實驗數據： 1. 主檢批線性：
2. 主檢批精密度：

3.穩定批精密度：
【主權項】
1. 一種e-徑下酸的測定方法，其特征在于:樣本中的e-徑下酸被e-徑下酸脫氨酶和硫 代氧化型輔酶I (化io-NAD+)特異性氧化，生成乙酷乙酸和硫代還原型輔酶I (Thio-NADH); 乙酷乙酸在e-徑下酸脫氨酶及還原型輔酶I (NADH)存在下，又生成(6-?下酸和氧化型輔酶I (NAD+)，反應循環進行，產生大量的硫代還原型輔酶I (Iliio-NADH)，通過405nm波長下測定 生成的化io-NA畑的吸光度變化來定量樣本中的(6-?下酸含量，其反應方程式如下：該方法對樣本中微量的e-徑下酸起放大作用，e-徑下酸的計算公式如下：2. -種(6-?下酸測定試劑盒，其特征在于:該試劑盒由W下組分構成： e-徑下酸脫氨酶 1-100 KU/L 緩沖液 5-500 mmol/L 表面活性劑 0.005-5% 穩定劑 0.005-50% 硫代氧化型輔酶IUhio-NA護） O.Ol-lOmmol/L 還原型輔酶 0 .Ol-lOmmol/L。3. 根據權利要求2所述的一種(6-?下酸測定試劑盒，其特征在于:所述的還原型輔酶是 NADH或NADPH中的一種。4. 根據權利要求2所述的一種(6-?下酸測定試劑盒，其特征在于:所述的緩沖液可W是 憐酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、巧樣酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、CAPS或MES緩 沖液中的一種。5. 根據權利要求2所述的一種(6-?下酸測定試劑盒，其特征在于:所述的表面活性劑可 W是Tr i tonX-100、化i j -35或吐溫-20中的一種。6. 根據權利要求2所述的一種(6-?下酸測定試劑盒，其特征在于:所述的穩定劑是乙二 醇、小牛血清白蛋白、甘露醇或山梨醇中的一種。
【專利摘要】本發明涉及β-羥丁酸的循環酶測定方法及其測定試劑盒，利用β-羥丁酸脫氫酶與硫代氧化型輔酶Ⅰ特異性氧化β-羥丁酸，生成乙酰乙酸和硫代還原型輔酶Ⅰ。乙酰乙酸在β-羥丁酸脫氫酶及還原型輔酶Ⅰ存在下，又生成β-羥丁酸和氧化型輔酶Ⅰ。反應循環進行，產生大量的硫代還原型輔酶Ⅰ，通過在波長405nm條件下測定生成的硫代還原型輔酶的吸光度上升量率，可計算出β-羥丁酸含量，該方法對微量的β-羥丁酸起放大作用，具有靈敏度高、穩定性好、成本低等優點。該試劑盒由還原型輔酶、β-羥丁酸脫氫酶、硫代氧化型輔酶Ⅰ、緩沖液、表面活性劑和穩定劑組成。本發明可通過生化分析儀測定β-羥丁酸含量。
【IPC分類】G01N21/31
【公開號】CN105510255
【申請號】CN201510981872
【發明人】孟廣宇, 吉爽爽, 李豐盛
【申請人】江蘇邁源生物科技有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月24日