檢測發酵乳中黃曲霉毒素b1和m1含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品檢測領域。具體地，本發明涉及檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml 含量的方法。更具體地，本發明涉及檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法 和檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素主要是由黃曲霉寄生曲霉產生的次生代謝產物，主要有B1、B1、G1、G2、 Ml以及M2。黃曲霉毒素存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別是容易污染花生、玉米、稻 米、大豆、小麥等糧油產品，是霉菌毒素中毒性最大、對人類健康危害極為突出的一類霉菌 毒素。
[0003] 然而，目前檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法仍有待改進。

【發明內容】

[0004] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提供一種檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法和一種檢測發酵乳中黃 曲霉毒素B1和Ml含量的方法。該方法操作簡便、快速、回收率高或者靈敏度高。
[0005] 需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：
[0006] GB5413. 37-2010《乳與乳制品中黃曲霉毒素毒素Ml的檢測方法》中對乳、奶粉、酸 奶、奶酪、奶油都有相應的檢測方法，此方法都是通過直接離心得到上清液，并將上清液通 過免疫親和柱。但是對于粘稠度較大、穩定性較高或者顆粒度較大的液體，不能直接通過免 疫親和柱。
[0007] 本發明的發明人經過大量實驗發現，預先利用甲醇-乙腈提取液對待測發酵乳進 行提取處理，然后將提取得到的提取液濃縮，并用緩沖液定容，隨后使定容得到的混合液通 過黃曲霉毒素總量免疫親和柱，得到洗脫液，最后利用液相色譜-質譜法對洗脫液進行檢 測。由此，本發明檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法和檢測發酵乳中黃 曲霉毒素B1和Ml含量的方法具有下列優點的至少之一：操作簡便、快速、回收率高和靈敏 度高。
[0008] 在本發明的第一方面，本發明提出一種檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的 預處理方法。根據本發明的實施例，該方法包括：（1)將所述發酵乳與提取液進行混合，其 中，所述提取液包括乙腈和甲醇，所述乙腈體積不小于甲醇體積；⑵將步驟⑴所得到的 混合物進行離心處理，并收集上清液；（3)將所述上清液進行濃縮處理，并利用緩沖液將所 述濃縮處理的產物進行定容，以便得到待凈化溶液；(4)利用免疫親和柱對所述待凈化溶 液進行凈化處理，得到洗脫液；以及（5)將所述洗脫液進行濃縮處理，并用乙腈-水溶液進 行定容，以便得到待測液。發明人發現，利用乙腈-甲醇溶液能夠有效地提取出發酵乳中的 黃曲霉毒素，此外，利用緩沖液將濃縮處理產物進行定容，同時可以中和發酵乳的酸，使其 酸性能夠在親和柱的承受范圍內，防止過酸的發酵乳破壞親和柱的親和能力。由此，根據本 發明實施例的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法具有下列優點的至少之 一：操作簡便、快速、回收率高和靈敏度高。
[0009] 根據本發明的實施例，上述檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法 還可以具有下列附加技術特征：
[0010] 根據本發明的實施例，所述乙腈和甲醇的體積比為8:2,基于1克所述發酵乳，所 述提取液的添加量為2~3毫升。由此，根據本發明實施例的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1 和Ml含量的預處理方法具有較簡便、快速的操作，較高的回收率或者較高的靈敏度。
[0011] 根據本發明的實施例，所述凈化處理包括：將所述待凈化溶液通過免疫親和柱，棄 流出液，然后用水淋洗免疫親和柱，棄流出液，再用乙腈洗脫免疫親和柱，得到洗脫液。由 此，根據本發明實施例的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法具有較簡便、 快速的操作，較高的回收率或者較高的靈敏度。
[0012] 根據本發明的實施例，所述緩沖液的pH值為7. 4~8. 5。由此，根據本發明實施例 的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法具有較簡便、快速的操作，較高的回 收率或者較高的靈敏度。
[0013] 根據本發明的實施例，在所述乙腈水溶液中，乙腈和水的體積比為1:9。根據本發 明實施例的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的預處理方法具有較簡便、快速的操作， 較高的回收率或者較高的靈敏度。
[0014] 在本發明的第二方面，本發明提出一種檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的 方法。根據本發明的實施例，該方法包括：（1)利用前面描述的預處理方法對發酵乳進行預 處理；以及（2)采用液相色譜-質譜聯用法對步驟（1)所得到的混合物進行檢測，并基于檢 測結果確定所述發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml的含量。由此，根據本發明實施例的檢測發 酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法具有下列優點的至少之一：操作簡便、快速、回收率 高和靈敏度高。
[0015] 根據本發明的實施例，上述檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法還可以 進一步具有下列附加技術特征：
[0016] 根據本發明的實施例，所述質譜的檢測條件包括：電離方式為電噴霧電離，正離 子；毛細管電壓為3. 5kV ;錐孔電壓為40V ;離子源溫度為120°C;錐孔反吹氣流量為50L/h ; 脫溶劑氣溫度為350°C;脫溶劑氣流量為500L/h ;電子倍增電壓為650V ;掃描方式為多離子 反應監測；針對黃曲霉毒素M1，離子選擇參數包括：母離子312. 9,子離子240. 7和284. 6， 碰撞能量是38和22,駐留時間是0. 05min ;針對黃曲霉毒素B1，離子選擇參數包括：母離子 329. 1，子離子259和273,碰撞能量是25和25,駐留時間是0. lmin。由此，根據本發明實施 例的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法可以進一步具有較簡便、快速的操作簡 便、較高的回收率或者較高的靈敏度。
[0017] 根據本發明的實施例，所述液相色譜的檢測條件包括：流動相流動速度：0. 3mL/ min ;色譜柱柱溫：40°C ;試液溫度：20°C ;進樣體積：10 yL ;流動相：A相，0. 1%甲酸溶液；B 相，乙腈溶液。由此，根據本發明實施例的檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法可 以進一步具有較簡便、快速的操作簡便、較高的回收率或者較高的靈敏度。
[0018] 本領域技術人員能夠理解的是，前面針對檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量 的預處理方法的特征和優點同樣適用于該檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的方法， 在此不再贅述。
[0019] 在本發明的第三方面，本發明提出一種檢測發酵乳中黃曲霉毒素B1和Ml含量的 方法。根據本發明的實施例，該方法包括：（1)稱取調制乳樣品l〇g于50mL離心管中，加入 25毫升提取液（乙腈和甲醇按體積比8:2)，得到混合液，將所述混合液高速振蕩2min，并 將得到的液體在5000轉/分鐘下離心5分鐘，收集上清液；（2)將所述上清液在45-48攝 氏度下旋轉蒸發到體積5升，再用磷酸二氫鈉緩沖液（pH值為7. 4~8. 5)定容到50毫升 并混勻，得到待凈化溶液，然后將待凈化溶液以2mL/min~3mL/min的流速通過黃曲霉毒素 總量免疫親和柱，棄流出液，然后用10毫升水以2mL/min~3mL/min的速度淋洗黃曲霉毒 素總量免疫親和柱，棄流出液，再用6毫升乙腈以2mL/min~3mL/min的速度洗脫黃曲霉毒 素總量免疫親和柱，得到洗脫液；（3)將所述洗脫液在氮吹儀下吹干，用乙腈-水溶液（乙 腈和水的體積比1:9)定容到lmL，渦旋混勻，過0. 22 μ m的有機濾膜，用液相色譜-質譜測 定，其中（3-1)質譜條件：電離方式為電噴霧電離，正離子；毛細管電壓為3. 5kV ;錐孔電壓 為40V ;離子源溫度為120°C ;錐孔反吹氣流量為50L/h ;脫溶劑氣溫度為350°C ;脫溶劑氣 流量為500L/h ;電子倍增電壓為650V ;掃描方式為多尚子反應監測；針對黃曲霉毒素M1， 離子選擇參數包括：母離子312. 9,子離子240. 7和284. 6,碰撞能量是38和22,駐留時間 是0.05min ;針對黃曲霉毒素B1，離子選擇參數包括：母離子329. 1，子離子259和273,碰 撞能量是25和25,駐留時間是0. lmin ; (3-2)液相色譜條件：流動相流動速度：0. 3mL/min ; 色譜柱柱溫：40°C ;試液溫度：20°C ;進樣體積：10 yL ;流動相：A相，0. 1%甲酸溶液；B相， 乙腈溶液。
[