一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法
【專利摘要】本發明公開了一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，通過樣品干燥、提取、離心處理后上清液干燥、復溶、經固相萃取柱后進行淋洗、洗脫、收集洗脫液、干燥再進行復溶、過濾后進入液質聯用儀進行定性或定量檢測。本發明在銀杏葉注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、血塞通粉針等品種中驗證了方法的線性、靈敏度、回收率、精密度及重現性，結果表明本發明檢測方法的上述指標均良好。本發明方法為首次應用于中藥注射劑中多種真菌毒素的檢測與分析，具有快速、簡便、適用性廣等特點，對于控制中藥注射劑的風險、提高患者的用藥安全性具有重要的意義。
【專利說明】
一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于中藥檢測領域，涉及一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方 法，具體涉及采用液相色譜串聯質譜法測定中藥注射劑中10種真菌毒素的方法，
【背景技術】
[0002] 中藥注射劑作為傳統醫藥理論與現代生產工藝相結合的產物，在心腦血管、腫瘤、 呼吸道等疾病治療中一直發揮著極其重要的作用。從上世紀四十年代問世以來，中藥注射 劑的生產工藝愈加規范科學，有效性也在使用中得到了驗證和肯定，然而在近年來的臨床 使用中，隨著不良反應的日益暴露，其安全性已經成為業內目前最為關心的問題。
[0003] 目前我國僅對少數中藥材中黃曲霉毒素進行了限量，我國《藥用植物及制劑外經 貿綠色行業標準》中規定中成藥及藥材中黃曲霉毒素Bl<5iig ? kgH;2010年版中國藥典規 定陳皮、僵蠶、胖大海、酸棗仁、桃仁五種藥材需要檢測黃曲霉毒素，規定黃曲霉毒素出不得 過5yg ? kg一S黃曲霉毒素出、82、61、62總量不得過10辟*1^一1。
[0004] 藥材從生長、采集、貯存以及加工過程中均可能污染各種真菌并產生真菌毒素。中 藥注射劑的生產原料大多為中藥材及其提取物，一旦原材料受到真菌毒素的污染，常規的 方法一般無法將其徹底去除，往往會不可避免的污染注射劑成品。
[0005] 如果人們攝入的中藥被真菌毒素污染，則非但不能達到防病治病的效果，反而可 能深受其害。雖然真菌毒素殘留作為痕量外源性有毒有害物質一般不表現出急性毒性，但 通常有較強的蓄積性，致癌、致畸、致突變作用明顯，并且由于使用中藥的人大多患有疾病 或者體質虛弱，抵抗力不如健康人群，加之中藥注射劑獨特的給藥方式，真菌毒素造成的危 害可能更為嚴重。
[0006] 由于中藥注射劑往往基質復雜，且含有很多如表面活性劑等成型用輔料，加之真 菌毒素種類繁雜，含量通常為ng級，這樣的特點要求檢測方法必須靈敏度高，對多種毒素盡 可能同時做出分析，以節省時間、成本和提高結果的全面性、可靠性。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，該方法 先對注射劑樣品進行提取凈化處理，然后采用液相色譜串聯質譜法測定樣品中多種真菌毒 素的含量。
[0008] 本發明通過以下步驟實現：
[0009] (1)取適量中藥注射劑液體或固體樣品，進行干燥;干燥方法為氮氣吹干、冷凍干 燥或旋蒸中的任意一種；
[0010] (2)加入提取溶劑，進行提取;提取溶劑為80 %~100 %乙臆-水溶液(v/v )，提取方 式為振蕩、禍旋、超聲中的任意一種；
[0011] (3)提取后，進行離心處理，取部分上清液進行干燥；
[0012] (4)將干燥后的樣品用純水或低濃度有機溶劑的水溶液進行復溶;復溶用低濃度 有機溶劑為0.1%~5%乙腈-水溶液&八)或0.1%~20%甲醇-水溶液&八）；
[0013] (5)復溶液緩慢通過已活化好的固相萃取柱，然后用水或PBS溶液或低濃度有機溶 劑水溶液進行淋洗;固相萃取柱為Waters HLB多功能柱；
[0014] (6)以適量洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液;洗脫劑為甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙 腈中的任意一種；
[0015] (7)將洗脫液進行干燥，并用30%乙腈溶液溶解，過濾，進入液質聯用儀進行定性 或定量檢測;檢測方法為同位素內標稀釋法。
[0016] 所述的中藥注射劑為銀杏葉注射液、丹紅注射液、銀杏達莫注射液、參麥注射液、 丹參川芎嗪注射液、醒腦靜注射液、血栓通注射液、川芎嗪注射液、疏血通注射液、康艾注射 液、參芪扶正注射液、香菇多糖注射液、艾迪注射液、炎琥寧注射液、痰熱清注射液、喜炎平 注射液、血必靜注射液、舒血寧注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、雙黃連注射液或血塞通 粉針。
[0017] 所述的真菌毒素是黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、 赭曲霉毒素A、霉酸酸、T2毒素、玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇、嘔吐毒素。
[0018] 注射劑通常分為水針和粉針兩種，成品的生產實際上是原藥材的提取純化過程， 然而，大量的有效成分、色素及藥用輔料對于痕量的毒素測定來說，仍存在著嚴重的基質干 擾，大量預實驗表明，直接稀釋進樣或稀釋后通過固相萃取柱的方法，檢測效果均不理想， 因此，本發明將干燥后的樣品先進行提取，以期達到更好的凈化效果。
[0019] 提取溶劑的選擇尤為重要，適合提取溶劑的選擇原則是，對有效成分等有著較小 溶解性的同時，對毒素有著良好的溶解性。通過對多種注射劑品種及真菌毒素的基質效應 及提取效率的考察，高濃度的乙腈溶液成為了理想的選擇，加入后，能沉淀大部分雜質，顯 著提高檢測的靈敏度。
[0020] 在固相萃取柱的選擇上，本發明比較了Romer Mycosep226和Waters HLB柱對多種 真菌毒素的回收效果，結果發現，Romer Mycosep226對0TA的回收率極低，而Waters HLB柱 對各毒素的回收率均較高，故最終選擇Waters HLB柱。
[0021] 本發明方法中色譜分離采用反相色譜柱，比較了Waters BEH-C18色譜柱（100* 2.10mm，1.7mi)'Waters BEH-C8色譜柱（100*2.10mm，1.7wn)、Kinetex 1.7yXB-C18 100A柱 三種色譜柱，分離效果均良好。
[0022] 本發明分別在三臺液質儀（日本SMMADZU LCMS-8030、日本SMMADZU LCMS-8050、 加拿大IONIC 3Q 120)上考察了通用性，結果表明，即使在靈敏度及抗干擾能力較差的 LCMS-8030液質儀上，方法學各指標也都能達到要求。
[0023]本發明在銀杏葉注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、血塞通粉針等品種中驗證了 本發明方法的線性、靈敏度、回收率、精密度及重現性，結果表明本發明檢測方法的上述指 標均良好。本發明方法為首次應用于中藥注射劑中多種真菌毒素的檢測與分析，具有快速、 簡便、適用性廣等特點，對于控制中藥注射劑的風險、提高患者的用藥安全性具有重要的意 義。
【附圖說明】
[0024] 圖1為混合對照品溶液的總離子流圖，圖中1 .G2，2 ? G1，3 ? B2，4 ? B1，5 ? 0TA，6 ? T2， 7.MPA，8.ZAN，9.ZEN，10.D0N〇
[0025] 圖2為加標供試品溶液的總離子流圖，圖中1 ? G2，2 ? G1，3 ? B2，4 ? B1，5 ? OTA，6 ? T2， 7.MPA，8.ZAN，9.ZEN，10.D0N〇
[0026] 圖3為供試品溶液的總離子流圖。
【具體實施方式】
[0027] 本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。
[0028] 實施例1
[0029] 1、實驗儀器與試劑
[0030]液相色譜-串聯質譜儀：日本SMMADZU島津公司液相色譜一串聯三重四極桿串聯 質譜儀^^一8050，配有電噴霧離子源(￡31);111^柱((^13@，3(^，6011^);微孔濾膜(30八八-114,0.22_，上海安譜科學儀器有限公司）。氮氣吹干儀（N-EVAPTM112型，美國 Organomation Associates，Inc公司）；分析天平（BS2202/TE-612-L/CP225D型電子天平，德 國Sartorius公司）；超聲波清潔器(KQ-500E型）；高速禍旋儀(WH-861型Vortex Shaker，上 海華利達公司）
[0031]甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。黃曲霉毒素混合對照品溶液(美國SUPELC0公司 批號：LB80734黃曲霉毒素 GhGi 濃度分別為 0 ? 3μg/ml、1 ? 0μg/ml、0 ? 3μg/ml、1 ? Oyg/ ml)、赭曲霉毒素A(美國R0MER公司批號S11263Z濃度100μg/ml)、T-2毒素（J&K公司批號： LHA0M26濃度100μg/ml)、霉酚酸（美國R0MER公司批號L13331A濃度100μg/ml)、玉米赤霉烯 酮(美國R0MER公司批號S10404Z)、玉米赤霉烯醇(美國R0MER公司批號S10207Z)、脫氧雪腐 鐮刀菌烯醇(FLuka公司提供，批號：SZE8150XV)。5種同位素內標均購自于美國R0MER公司： 13C-B1 (批號 I13202A 濃度 0.5邱/1111)、13(：-(^^(批號1130846濃度10辟/1111)、13(：-12(批號 I13022T 濃度 25μg/ml)、13C-ZEN(批號 I12505B 濃度 25μg/ml)、13C-D0N(批號 I13084A 濃度 25 μg/ml)。銀杏葉注射液樣品購自杭州市場。
[0032] 2實驗方法
[0033] 2.1色譜及質譜條件
[0034] 2.1.1色譜條件
[0035] Waters BE1H-C18色譜柱（100*2 ? 10mm，1 ? 7ym);流動相為甲醇(B)_5mmol/L醋酸銨 (A)，梯度洗脫（此處百分比為有機相B相）：0~6min，25% ;6~8min，70%~95% ;8~ 8.51^11，95%~100%;8.5~9.5111111，100%;9.5~9.6，100%~25% ;9.6~12111111，25%。流 速:0.3mL ? min-1;柱溫40°C ;進樣量1此，結果見附圖1。
[0036] 2.1.2質譜條件
[0037] 質譜檢測采用正負兩種離子模式，進行多反應監控模式(MRM)檢測。黃曲霉毒素等 15種真菌毒素質譜條件見表1。
[0038]表1. 15種真菌毒素的質譜參數
[0040] 2.2對照品及供試品溶液的配制
[0041 ] 2.2.1對照品溶液的制備
[0042]將10種毒素溶解后以特定比例混合，于40°C下氮氣吹干，用30%乙腈復溶，配制成 含有黃曲霉毒素B2、G2為15ng/mL，黃曲霉毒素B1、G1、赭曲霉毒素A、T-2毒素、霉酚酸為 50ng/mL，玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇為250ng/mL，脫氧雪腐鐮刀菌稀醇為lyg/mL的混合 對照品工作液。將5種毒素內標溶液以特定比例混合，以30%乙腈稀釋成混合內標工作液 (13081、1300了八、130了2、13(：-2￡113(：-〇0咐農度分別為4〇1^/11^、4〇1^/11^、4〇1^/11^、 200ng/mL、800ng/mL)。
[0043] 使用30 %乙腈進行稀釋，配成一系列的對照品溶液_20°C下避光保存。
[0044] 2.2.2供試品溶液的制備
[0045]量取相當于生藥量2g的銀杏葉注射液，置于50ml離心管中，加入混合內標工作液 100ul，混勻，于50°C下氮吹至近干，精密加入90%乙睛10ml，超聲提取30min，提取完成后， 12000rm離心10min，移取上清液5ml，于45°C氮氣吹干，用乙腈500yL復溶后加水稀釋至 25ml，渦旋混勻，待上樣。
[0046] 提取稀釋液緩慢通過已用3ml甲醇和3ml水活化的HLB柱，流速約lmL/min，加入roS 緩沖液5mL淋洗，靜置30min后，用含0.2 %甲酸的乙腈5ml洗脫，收集洗脫液，于45°C下氮氣 吹干，加入30 %乙腈溶液lml，超聲30s，渦旋lmin，通過0.22mi微孔濾膜即得。
[0047] 3實驗結果
[0048] 3.1方法學考察
[0049] 3.1.1線性關系
[0050]以同位素內標工作液（濃度為40ng/ml)50ul分別加入至6個進樣瓶中，氮氣吹干 后，取混合對照品工作液，以30%乙腈稀釋成6個不同濃度的對照品溶液(濃度分別為1、2、 5、10、20、50即/111〇，超聲10 8，渦旋11^11，進入液質聯用檢測，以色譜峰峰面積以)為縱坐標， 進樣濃度(X，ng ? mL-1)進行線性回歸。線性范圍及回歸方程見表2,3。
[0051 ]表2.線性系列混合對照品溶液濃度表
[0054]表3. 10種毒素線性實驗結果
[0056] 3.1.2儀器精密度
[0057]取線性3號樣品，平行進樣6次，計算其相對標準偏差，結果見表4，表明儀器精密度 良好，達到檢測要求。
[0058]表4. 10種毒素的精密度結果
[0061 ] 3.1.3回收率
[0062]銀杏葉注射液移取相當于2g藥材的樣品，一式6份，按低、中、高三種濃度水平分別 精密加入加樣回收率用混合對照品溶液(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃 曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、T-2毒素、霉酚酸、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮及嘔吐毒素），按照 擬訂方法制備供試品溶液并測定含量，計算加樣回收率，結果見表5及附圖2,表明回收率試 驗結果良好。
[0063]表5.銀杏葉注射液10種真菌毒素的回收率試驗結果
[0065] 3.1.4定量限
[0066] 取低濃度回收率的供試品溶液測定信噪比，以信噪比10:1計算方法定量限。
[0067]表6. 10種真菌毒素在銀杏葉注射液中的定量限
[0070] 3.1.5銀杏葉注射液檢測結果
[0071]采用本方法對30份銀杏葉注射液樣品進行了 10種真菌毒素的同時檢測。結果表 明：絕大多數樣品中毒素檢測結果為陰性，結果見附圖3,僅在10號樣品中分別檢出2.41iig/ kg的OTA和4?95yg/kg的MPA。
【主權項】
1. 一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在于，通過以下步驟實現： (1)取中藥注射劑液體或固體樣品，進行干燥； ⑵加入提取溶劑，進行提取;提取溶劑為80 %~100 %乙臆-水溶液(v/v); (3) 提取后，進行離心處理，取上清液進行干燥； (4) 將干燥后的樣品用純水或低濃度有機溶劑的水溶液進行復溶，低濃度有機溶劑為 0· 1 %~5%乙腈-水溶液(v/v)或0.1%~20%甲醇-水溶液(v/v); (5) 復溶液緩慢通過已活化好的固相萃取柱，然后用水或PBS溶液或低濃度有機溶劑水 溶液進行淋洗； (6) 用洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液； (7) 將洗脫液進行干燥，并用30%乙腈溶液溶解，過濾，進入液質聯用儀進行定性或定 量檢測。2. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述的真菌毒素是黃曲霉毒素 Bl、黃曲霉毒素 B2、黃曲霉毒素 Gl、黃曲霉毒素 G2、赭曲霉 毒素 A、霉酸酸、T2毒素、玉米赤霉稀酮、玉米赤霉稀醇、嘔吐毒素。3. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述的中藥注射劑為銀杏葉注射液、丹紅注射液、銀杏達莫注射液、參麥注射液、丹參川 芎嗪注射液、醒腦靜注射液、血栓通注射液、川芎嗪注射液、疏血通注射液、康艾注射液、參 芪扶正注射液、香菇多糖注射液、艾迪注射液、炎琥寧注射液、痰熱清注射液、喜炎平注射 液、血必靜注射液、舒血寧注射液、刺五加注射液、黃芪注射液、雙黃連注射液或血塞通粉 針。4. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(1)中干燥方法為氮氣吹干、冷凍干燥、旋蒸中的任意一種。5. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(2)中提取方式為振蕩、渦旋、超聲中的任意一種。6. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(5)中固相萃取柱為Waters HLB多功能柱。7. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(6)中洗脫劑為甲醇、乙腈、酸化甲醇、酸化乙腈中的任意一種。8. 根據權利要求1所述的一種同時檢測中藥注射劑中多種真菌毒素的方法，其特征在 于，所述步驟(7)中檢測方法為同位素內標稀釋法。
【文檔編號】G01N30/06GK105891373SQ201610407940
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月12日
【發明人】陳勇, 李勁, 吳永江, 劉雪松, 欒連軍, 王龍虎
【申請人】浙江大學