專利名稱：抗體作疫苗的新用途的制作方法
技術領域：
本發明描述了可與抗腫瘤相關抗原的抗體結合的并且可在特殊配體上經免疫親和純化法從含抗體的個體體液回收的抗體在生產用于個體、自身預防或治療接種的抗癌組合物的用途。免疫親和純化法所用的配體是可抗一種或多種腫瘤相關抗原的抗體或其衍生物。而且，本發明涉及含有由免疫親和純化法獲得的抗體或該抗體體外脈沖的樹突狀細胞的藥物組合物。
人的獲得性免疫系統由兩大部分組成即體液免疫和細胞免疫。獲得性免疫應答基于B和T淋巴細胞的克隆選擇，并且原則上可識別任何抗原和形成免疫記憶。在接種時，可以充分利用獲得性免疫系統的這些特點。
每個B細胞都能夠產生具有一定結合特異性的抗體。這種抗體也作為特殊受體存在于可生產抗體的B細胞膜上。針對被識別為外來抗原的體液免疫應答是基于可產生能夠結合各個抗原表位的抗體的B細胞的選擇性激活。在B細胞的分化過程中，DNA重排對抗體的多樣性起決定性作用。
在人血清中存在大量各種各樣特異性、同種型和亞類的抗體。血清中所有免疫球蛋白的總濃度為15到20mg/ml；即大約100g具有各種各樣特異性的免疫球蛋白一直循環在血液中。顯示出所有不同特異性抗體的精確含量是不可能的。所有組成成分理論上可能是1011左右。一般地，某些抗體可以結合相類似的不同抗原，盡管這些抗原具有不同的親和性和抗體親抗原性。
在這些不同特異性的分布和重要性方面，免疫系統必須通過內源性調節機制保持內環境的穩定。主要的機理是25年前由Niels Jerne假設的“獨特型網絡”(Jerne，Ann.Immunol.(《免疫學年報》)125C(1974)，373-389)存在抗獨特型抗體，它可針對各種決定抗體結合特異性的抗體的獨特型，因此能夠在抗原識別有意義的范圍內與第一種抗體的獨特型結合。Jerne提出淋巴細胞上獨特型特異的受體間的相互作用決定了免疫系統的調節。因為在免疫應答過程中已經顯示出也形成了針對主要由免疫應答所誘發的抗體的抗獨特型抗體，所以確實明顯發生了這些相互作用。由于存在抗每個抗體的抗獨特型抗體，所以在抗體的獨特型方面，淋巴細胞基本上不耐受。
在免疫學意義中，一些抗獨特型抗體可以表示抗原的“內部圖像”。所以這類抗體可作為標稱抗原替代物用來免疫接種，因為免疫接種所誘發的抗體可以與標稱抗原部分結合。在很長一段時間內，都在使用這種方法，尤其是在癌癥免疫療法中。10多年來，有許多有關接種單克隆抗獨特型抗體來誘發針對腫瘤相關抗原的免疫應答的臨床前和臨床計劃(摘要參見Bhattacharya-Chatterjee，Foon；癌癥的抗獨特型抗體疫苗的療法；Cancer Treat.Res.(《癌癥治療研究》)94(1998)，51-68)。這些單克隆抗獨特型抗體大多數是鼠源性的。但是也有人單克隆抗獨特型抗體的試驗(例如，Fagerberg等，PNAS 92(1995)，4773-4777)。
對患有B細胞淋巴瘤的患者嘗試治療性免疫接種是一種特殊情況。在這類疾病中，可產生具有獨特型特征的特異性免疫球蛋白的并且在其細胞膜上也攜帶著該免疫球蛋白作為受體的某些B細胞克隆是退化的。這種抗體是單克隆并對個體B細胞淋巴瘤來說可以當作腫瘤特異性抗原。當這種患者特異性自身抗體在細胞培養基中產生并作為疫苗以適當免疫原形式接種時，它已經顯示出可以誘發抗該抗體獨特型的免疫應答，該免疫應答能夠對B細胞淋巴瘤具有影響(Reichardt等，Blood.(《血液》)93(1999)，2411-2419)。
總之，可以說●可模仿腫瘤相關抗原的人單克隆抗獨特型抗體，作為疫苗能夠誘發癌癥患者的免疫應答，該免疫應答可能針對該腫瘤的伴生抗原。借助雜交瘤技術或人B細胞的無限增殖，這種人單克隆抗體已經從在被動免疫療法中給予(大多數鼠源性)抗腫瘤抗體的并已經建立了相應免疫應答的患者中獲得。其他患者可以用該方式所產生的人單克隆抗獨特型抗體免疫接種。●由B細胞淋巴瘤所產生的并因此有特定獨特型的人抗體，作為個體疫苗，能夠以患者特異性方式誘發免疫應答，該免疫應答可能針對B細胞淋巴瘤。這種患者特異性抗體必須借助雜交瘤技術或B細胞淋巴瘤細胞的無限增殖分別獲得。該抗體的用途自然局限于B細胞淋巴瘤的治療。
所以，盡管已經公知某些物種的單克隆抗獨特型抗體也能夠用于免疫接種產生抗體的相同物種的個體，但在任何情況都必需要操作和培養細胞。所以，這種方法耗費時間并只能局限于單克隆抗體。
因此，顯然需要能提供可有效和廣泛適用任選腫瘤的個體療法以及預防癌癥的裝置和方法。
所以，作為本發明基礎的技術問題是提供有效的裝置和方法，它們可以在不同種腫瘤的構架內分別用于治療癌癥和預防癌癥。
該技術問題已經由在權利要求中所提供的特征的實施方案所解決。
所以，本發明涉及抗體在生產適合治療性或預防性接種的抗癌疫苗的組合物的用途，其特征在于該抗體可以用免疫親和純化法從含有抗體的體液中回收，其中可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
與現有技術中所描述的方法相比，本發明的用途具有的優點是不用細胞培養基生產抗獨特型抗體，這使得本發明的構思可能被廣泛而有效地使用并不局限于單克隆抗體。
在每個人的血液中，例如以很大總量存在的抗體庫包括各種可能的結合特異性抗體。這樣，該抗體庫基本上也包括抗例如(已知的或也是新的)針對任意腫瘤相關抗原(TAA)的鼠源性單克隆抗體(Ab1)獨特型的抗體(Ab2)。按照免疫網絡，每個人的相同抗體庫也包括一定量的針對自身Ab2的獨特型的抗體，稱之為Ab3抗體。按照網絡理論，Ab3能夠結合外源Ab1所限定的腫瘤相關抗原。利于Ab3的Ab2/Ab3平衡移動一定會導致免疫系統能夠更好地識別和攻擊攜帶該抗原的腫瘤細胞。
現在本發明的基礎為這種免疫平衡的移動是通過以免疫接種疫苗形式給予個體自身Ab2部分實現的。就這種自身免疫接種疫苗來說，能夠選擇性地刺激那些可產生Ab3的B細胞。對這種免疫接種疫苗來說，只需要按照公知方法使用適當的疫苗佐劑進行配制的少量的Ab2部分。
所以本發明所用的抗體是來自含有抗體的體液并且針對免疫親和純化法所用的抗-TAA抗體的Ab2抗體。含有抗體的體液是例如血液、血漿、血清、淋巴液、惡性滲出液等。體液優選血清。體液可以源于具有包含抗體的體液的任意動物。優選有脊椎動物，更優選哺乳動物，最優選是人的體液。
因為接種自身抗體所誘發的免疫應答是由這些抗體的結合區即它們的獨特型所決定的，只要這些抗體片段或衍生物仍包括各個起始抗體的獨特型，這些抗體的片段或衍生物基本上也能夠用來替代完整的抗體部分成功地接種。這樣，術語“抗體”也含有具有相同結合特異性的這類抗體的片段或衍生物。例如，不作為限定，下列所提到的例如按照本身已知的生物化學方法(例如經酶裂解)所產生的F(ab)’2片段和F(ab)’片段。術語“衍生物”包含例如按照本身已知的化學或生物化學方法所產生的抗體衍生物，例如為了增加親脂性以摻入到脂質體中而在游離氨基功能團上用脂肪酸酰胺化的抗體。特別是，術語“衍生物”還包括用化學方法將抗體或抗體片段與可提高免疫應答的分子偶合所生成的產物，其中的分子例如是破傷風類毒素、假單胞桿菌屬外毒素、脂質A的衍生物、GM-CSF、IL-2，或者用化學方法將抗體或抗體片段與可提高免疫應答的多肽如GM-CSF、IL-2、IL-12、C3d等偶合所生成的產物。借助免疫親和純化法將抗體從例如來自人血清的含有抗體的體液中純化可以使用本領域熟練技術人員公知的方法進行(Clin.Chem.(臨床化學)4591999)，593；J.Chem.Technol.Biotechnol.(化學技術生物技術雜志)48(1990)，105)。將TAA-特異性抗體或該抗體的混合物固定于固相中。該固相是能夠讓抗體與其結合而在結合特性上幾乎沒有損失的膜、凝膠或類似物。Ab2可以分批或以流通方法結合到固定的抗體。免疫親和純化可以在色譜層析裝置上自動進行或借助人工方法進行。但也可以想到借助含有固化抗體的簡單裝置人工、自動或半自動進行。在實施例1中所述的免疫親和色譜層析中，一般每毫升所用血清能夠獲得3到10μg免疫球蛋白。一般，用這種方法所獲得的抗體部分由IgM和IgG組成。所以，從采血可接受的量例如50ml生成的25ml左右的血清中可能獲得大約0.08到0.25mg的Ab2。該量基本上滿足接種。如果希望大量回收Ab2，可以將本身已知的技術如血漿除去法與免疫親和純化法結合使用。如果使用好幾種具有不同特異性的抗體，可以同時使用這些固定的抗體或平行或連續進行各免疫親和純化。
在本發明的構架內，術語“腫瘤相關抗原”是優選用腫瘤細胞表現出的結構和可能從非惡性組織中將其分化出的結構。優選這種腫瘤相關抗原位于腫瘤細胞的細胞膜上或膜內。但是，沒有規定這種抗原也存在于非退化細胞上。例如腫瘤相關抗原可以是多肽，尤其是糖基化的蛋白或多肽的糖基化部分。可以表示腫瘤相關抗原的其他結構例如是糖脂。這些包括例如神經節苷脂如GM2。而且，通過改變癌癥細胞特征的細胞膜的脂質組份也能夠表示腫瘤相關抗原。
抗不同腫瘤相關抗原的各種各樣的抗體早已為人所知或能夠用公知方法生產(例如雜交瘤技術、噬菌體展示技術)。
在優選的實施方案中，將由免疫親和純化法所獲得的抗體以自身個體疫苗的意義給予其體液被回收的個體接種。
所以，本發明另外一種完整組成是用免疫親和純化體液中存在的抗體來實現從個體體液如血液中的回收Ab2部分。一種或多種抗腫瘤相關抗原的抗體/抗體類可以用作配體。
在本文中，個體可以是任意動物，優選脊椎動物，更優選哺乳動物，最優選人。
在另外優選的實施方案中，免疫親和純化可以同時使用好幾種針對各種腫瘤相關抗原和/或抗一種或多種腫瘤相關抗原的各種表位的抗體。如果好幾種特別是抗不同腫瘤相關抗原或抗不同表位的單克隆抗體同時用于免疫親和純化存在于體液的Ab2，可以獲得由不同Ab2組成的部分，它基于所選的一套腫瘤相關抗原和它同時作為疫苗起動抗所有這些腫瘤相關抗原或表位的免疫應答的用途。因此，在向識別一套(經常共同表達)腫瘤相關抗原或表位的一步中移動免疫平衡。這類步驟自然增加了所誘發的免疫應答的作用并基本減少了腫瘤抗原陰性變體的形成(“腫瘤逃逸”)，因為腫瘤細胞極不可能同時中止好幾種抗原的表達。
上述方法基本上是基于所有已知的或最新發現的腫瘤相關抗原。唯一的前提是可得到能用作免疫親和純化配體的針對這類抗原的一種或多種抗體，優選單克隆抗體。基本上所有可能類型的抗體特別是多克隆或單克隆抗體都是適合的，優選單克隆抗體。也能夠使用多克隆和單克隆抗體的混合物。并且，例如鼠源性單克隆抗體和來自其他物種(例如大鼠)的抗體都是能夠使用的。而且，抗腫瘤相關抗原的鼠-人嵌合、人源化的或人單克隆抗體也能夠使用。用于免疫親和純化法的抗體性能是由它們的結合區即它們的獨特型決定的。這樣，只要這些抗體片段仍保持各起始抗體的獨特型，這些抗體的片段基本上也能夠替代完整的抗體用于成功的免疫親和純化。例如，但不限定為，包括按照本身已知的生物化學方法(酶裂解法)或按照本身已知的分子生物學方法生產的F(ab)’2片段、F(ab)’片段和Fv片段。實際上，也可以使用各種抗體或片段的混合物。
腫瘤相關抗原的選擇和針對這些抗原的用于免疫親和純化法的抗體的選擇取決于將進行接種抗這些腫瘤適應證的抗原特征。
下列已知的和經常在各種尤其是表皮腫瘤上表達的腫瘤相關抗原進行了舉例性列舉。本文所述的自身接種的方法的使用也決不局限于這些抗原上皮細胞粘合分子(Ep-CAM)癌胚抗原(CEA)路易斯Y碳水化合物唾液酸Tn碳水化合物球H碳水化合物神經節苷酯如GD2/GD3/GM2前列腺特異性抗原(PSA)CA 125CA 19-9CA 15-3TAG-72EGF受體神經細胞粘合分子(N-CAM)Her2/Neu受體D 97CD 20CD 21現已描述了抗上述所有抗原(大多數數個)尤其是單克隆抗體基本上適合用作前述免疫親和純化法回收Ab2的配體。而且在例如DeVita等也描述了腫瘤相關抗原(Eds.，“癌癥的生物療法”，第二版，第3章腫瘤抗原的生物學，Lippincott公司，ISBN 0--6(1995))。
在優選的實施方案中，腫瘤相關抗原是一種在上皮源性癌細胞上、神經內分泌源性癌細胞或血液形成系統的癌細胞上可經常被表達或共同表達的位于膜上的分子。
在另外優選的實施方案中，按照本發明所生產的組合物適合于該組合物所含抗體的多次給藥。本文所述的從個體體液中回收自身疫苗的方法自然不是只局限于一次單一使用。
重復這些步驟，例如在用免疫親和純化法回收第一次自身疫苗后幾周，再取體液如血液和制備新的自身疫苗并給藥，能夠促進用第一次接種所觸發的免疫性所有組成部分向有效抗腫瘤的方向移動。在這種方法中，確保了經常考慮個體疫苗中免疫平衡的相應狀況。這種方法可以在適當的間隔內(例如開始每隔4到8周，然后隔6個月)反復進行。
本文所述的用于接種自身抗體的新組合物和方法基本上適合于治療和預防兩種目的。對癌癥患者反復的治療性接種能夠抑制新轉移瘤的形成并且至少能夠減緩該疾病的播散。治療性自身接種尤其可用于下列疾病階段疾病的早期階段，例如原發腫瘤的成功手術后(輔助階段)，本文所述的自身接種可破壞剩余的播散的腫瘤細胞并防止形成新的轉移瘤。所以，這類患者不復發的時間和總生存時間被延長了。任選地，在適當間隔借助這種自身接種和所給予的加強免疫注射可能會終生保護避免轉移瘤的形成。
如果轉移瘤已經形成，使用本文所述的組合物或自身接種可控制轉移瘤的進一步擴散和形成。疾病狀況就會得到穩定，從而生活質量得到維持且壽命得以延長。
本文所述的自身接種方法也能夠用于為了診斷或治療在之前已經給予抗腫瘤相關抗原的單克隆抗體的患者和抗這些抗原已經形成免疫應答的患者。所以，在將該抗體用作配體的免疫親和純化法中，以大于非治療性個體時的量獲得針對(Ab2)的抗體。用這些Ab2接種會促進內部可能已經產生的Ab3的形成。許多年前就已經有人假設并分析了用針對腫瘤相關抗原(Ab1)的鼠源性抗體的被動免疫療法，經靜脈對癌癥患者給藥，經Ab2的誘導來內部誘導具有潛在抗腫瘤特性的Ab3(例如，Koprowski等，PNAS 81(1984)，216-19)。
本文所述的組合物和自身接種基本上也作為預防劑，能夠用于增加健康個體對癌癥疾病的預防。這種方法對高風險組(這些包括例如有形成某些癌癥遺傳傾向的個體，這些遺傳傾向可以用相應的試驗不斷地測定出來)尤其有益。
由于相應疫苗優選是從個體體液例如血清中產生的，在獨特型網絡方面會考慮每一個體的免疫狀況，這一事實是本文所述個體自身接種方法的主要優點。
而且，結果，免疫過的個體不能與外來抗原接觸，而只能以可影響免疫平衡調節的適當形式用內源性組份治療。
在按照本發明的優選實施方案中，由免疫親和純化法所獲得的抗體可與適當的疫苗佐劑一起配制成制劑。
按照疫苗的常例，自身抗體部分或其片段和衍生物與疫苗佐劑一起制備成制劑。這類佐劑可促進免疫應答。這類佐劑的例子包括，但不限定為含鋁佐劑，尤其是氫氧化鋁(例如Alu-gel)、脂多糖的衍生物、卡介苗(BCG)、QS-21、脂質體制劑、含有免疫系統已經形成強烈的免疫應答抗另外抗原的制劑，如任選在脂質體制劑中的破傷風類毒素或流感病毒組份。
為了提高免疫應答，疫苗制劑也可以與相應的優選可維持免疫應答形成的人的細胞因子一起給藥。具體來說，但不僅僅是，要提到的粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)。這種細胞因子通過激活抗原處理的細胞(例如樹突狀細胞)刺激有效的免疫應答。
任選通過使用本身已知的和已經公開的方法，也能夠用在體外培養的自身樹突狀細胞溫育自身抗體部分。隨后將用這種方法脈沖的樹突狀細胞給予各個個體。用這種方法可能會形成特別有效的免疫應答。
在按照本發明用途的優選實施方案中，將組合物中所含的抗體與佐劑混合，然后將其加熱處理，優選在70到121℃的溫度范圍內。所用的佐劑優選是含鋁佐劑。盡管這種加熱處理使蛋白抗原變性，但是由于結合了佐劑蛋白的免疫原性部分也可能以正確形式存在于免疫系統中。為了達到加熱處理的優點，不是絕對需要使蛋白變性。大家都知道蛋白的熱變性不僅依賴于溫度，而且還依賴于蛋白經受該溫度的時間。而且，還有其他生化參數如離子強度、離子組成、pH值、混合物中活性表面的種類和含量，都會引起蛋白變性。可能有抗體不變性或不完全變性的條件和/或使用對佐劑表面上有其他影響例如較少脫附的條件。
用佐劑和隨后熱處理產生疫苗制劑的方法的另外優點是在整個制劑中感染性病原體可能會變弱或失活。這種優點對疫苗制劑的生產、儲藏和發送是非常重要的。所以，就已知和未知的傳染性疾病病原體而言，就有較好的安全性。而且，因為疫苗的微生物保藏已經通過加熱進行了，所以如果使用相應的包裝時，可以將其罐裝而不加防腐劑。
這種制劑的其他優點是當加熱到至少使部分抗體變性時，潛在地增加了抗體的免疫原性。抗原性的提高也就增加了免疫原性，尤其在該蛋白被識別為機體的自身蛋白時。
其他優點是通過加熱失活又潛在地穩定了抗體佐劑絡合物，即蛋白抗原的脫附不會象在沒有加熱處理的抗原佐劑制劑中的那樣快。這一優點也能允許自身免疫接種之間有較大間隔。
按照本發明所生產的組合物可以按照公知方法例如作為疫苗經皮下或肌肉內注射給藥。
而且，本發明涉及含有用免疫親和純化法從含有抗體體液中回收的抗體的藥物組合物，其中將可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
正如上文所述的，這種組合物適合作為抗癌的治療性或預防性接種的疫苗。
就藥物組合物的制備、組份、制劑、給藥類型等方面的優選實施方案而言，相同部分使用早已在本發明用途方面作了解釋。
最后但一樣重要的是，本發明也涉及含有從體外已經培養的個體的分離出的樹突狀細胞的藥物組合物，其中該樹突狀細胞已經用免疫親和純化法從含有抗體的相同個體的體液中回收的抗體體內溫育。
另外，本發明也涉及抗癌的治療性或預防性接種的方法，其中將用免疫親和純化法從含有抗體的體液，優選從相同個體的體液中獲得的抗體對個體給藥，其中將可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
而且，本發明還涉及抗癌的治療性或預防性的接種的方法，其中將已經體外培養的在試管內之前用免疫親和純化法從含有抗體的體液中回收的抗體溫育過的自身的、分離出的樹突狀細胞對個體給藥，其中將可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
與本發明用途中早已解釋過的相同之處用于該優選的實施方案。
本發明也涉及生產抗體制劑的方法，其特征在于用免疫親和純化法從含有抗體的體液中回收抗體，其中將可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
與本發明用途中早已解釋過的相同之處用于體液、用作配體的抗體以及腫瘤相關抗原。
免疫親和純化法可以按照本領域普通技術人員已知的方法進行。在這種情況，也使用本發明用途中早已提過的相同之處。
在本發明方法的優選實施方案中，同時將針對不同腫瘤相關抗原和/或這些抗原表位的好幾種抗體用于親和純化。在將好幾種抗體用于親和純化的方法中，可以同時使用它們，或者可以分別平行或系列進行免疫親和純化，即按照要求結合不同表位和/或抗原的特異性。這些要求起因于不同個體腫瘤上不同抗原的表達。
在特別優選的實施方案中，單克隆抗體在免疫親和純化法中作配體而在更特別優選的實施方案中用血清作體液。
本發明的方法優選是用于生產適用于抗癌的治療性或預防性接種的藥物組合物的抗體制劑的制備方法。
進一步，本發明涉及藥物組合物的制備方法，其中實施前述的本發明制備抗體制劑的方法并且隨后將這種方法所得到的抗體制劑與可藥用載體和/或適當的疫苗佐劑配制成制劑。
在優選實施方案中，將抗體制劑與佐劑優選與含鋁的佐劑混合，然后將其加熱處理，優選在70到121℃的溫度范圍內。
在本發明用途中早已提到的相同之處用于這種藥用或疫苗制劑的優選實施方案中。
在本申請中所引用的所有專利、公開出版物或數據庫公開的內容全部被引用到本申請說明書的內容中作參考。


圖1顯示了來自獼猴血清的抗體部分的免疫親和純化的層析譜(用固定化抗體17-1A)。
圖2顯示了用免疫親和純化法純化的抗體部分的層析譜(尺寸排阻層析法)。
圖3顯示了用在抗體17-1A17-1A ELISA親和純化所獲得的血清抗體的結合。
圖4顯示了獼猴自身接種的結果血清-Ig與KatoIII腫瘤細胞(細胞ELISA)的結合。
圖5顯示了用免疫親和純化法(混床抗-EpCAM/抗-LewisY)純化的抗體部分的層析譜(尺寸排阻層析法)。
圖6顯示了尺寸標準的層析譜(用尺寸排阻層析法分離的)。
下列物質是下列用于更加詳細地說明本發明而不是將其加以限定的
no.3598)細胞系KATO III人胃癌細胞系(ATCC HTB 103)偶聯緩沖液0.1M NaHCO30.5M NaClpH8.0純化緩沖液APBS def0.2M NaCl純化緩沖液B0.1M甘氨酸/HCl0.2M NaClpH2.9培養基ARPMI 1640+2g/l NaHCO3100U/ml青霉素G100μg/ml硫酸鏈霉素4mM谷氨酸10％胎牛血清(加熱失活)結合緩沖液15mM Na2CO335mM NaHCO33mM NaN3pH9.6不完全的PBS(def)138mM NaCl1.5mM KH2PO42.7mM KCl6.5mM Na2HPO4pH7.2固定溶液0.1％戊二醛的生理鹽水溶液洗滌緩沖液A2％NaCl0.2％Triton X-100不完全的PBS洗滌緩沖液B0.05％Tween 20不完全的PBS封閉緩沖液A5％胎牛血清(加熱失活)的不完全PBS封閉緩沖液B1％牛血清白蛋白0.1％NaN3的不完全PBS稀釋緩沖液A2％胎牛血清(加熱失活)的不完全PBS稀釋緩沖液B不完全的PBS染色緩沖液24.3mM檸檬酸51.4mM Na2HPO4pH5.0底物40mg二鹽酸鄰苯二胺100ml染色緩沖液20μl H2O2(30％)中止溶液4N H2SO4制劑緩沖液10％PBS def，pH＝6.090％生理鹽水溶液實施例1含有TAA特異性抗體的免疫親和柱的制備將7.5g CH-瓊脂糖4B(Pharmacia)懸浮于20ml的1mM HCl中15分鐘。然后在AG3燒結玻璃濾器上將凝膠先用1升的1mM HCl再用200ml的偶聯緩沖液洗滌。在5升的偶聯緩沖液中透析100mg的鼠源抗體17-1A(Panorex，貯存液10mg/ml；針對腫瘤相關抗原Ep-CAM)并用偶聯緩沖液調至5mg/ml。將該溶液與凝膠懸浮液混合于密封容器中，得到凝膠與緩沖液比為1∶2的適合于偶聯的懸浮液。該懸浮液于4℃旋轉24小時。然后，用3×30ml偶聯緩沖液洗掉多余的配體。于4℃用1M乙醇胺溫育1小時從而將所得到的反應基團封閉。然后，將凝膠與0.1M的Tris-HCl緩沖液于室溫旋轉1小時。最后，凝膠用不同pH值的緩沖液洗滌三輪。每輪由含有0.5M NaCl的pH4的0.1M的醋酸鈉緩沖液接著是含有0.5MNaCl的pH8的0.1M Tris-HCl緩沖液組成。凝膠貯存于4℃。
實施例2用免疫親和色譜層析法從血清中免疫親和純化抗體部分從獼猴取外周血液10ml并回收血清。整個步驟都是在無菌條件下進行。
在FPLC系統(Pharmacia)上進行免疫親和純化。將1ml按照實施例1所得到的凝膠裝填到Pharmacia的HR5/5柱上。用純化緩沖液A稀釋5ml血清至1∶10。該溶液以1ml/分鐘注入柱，然后用純化緩沖液A洗滌直到檢測器又達到UV基線(280nm)。用純化緩沖液B洗脫結合的免疫球蛋白，脫附后馬上用1M Na2HPO4中和該組分。圖1顯示了這種純化的層析圖(UV280nm)。
將50μl用這種方法所純化的抗體部分在尺寸排阻層析柱(SEC，Zorbax 250 GF)上分析。用220mM pH為7的磷酸緩沖液和10％的乙腈作流動劑。正如從這種分析的層析圖(圖2)中所看到的，抗體的部分包括大約3∶2的IgM和IgG。抗體部分的總量大約是40μg(與標準物比較用尺寸排阻層析法測定的)。在ELISA中測試這種方法所獲得的抗體部分與抗體17-1A(用作親和純化法的配體)的結合將100μl等份的針對腫瘤相關抗原的和用作親和純化的抗體(抗體17-1A；含10μg/ml的結合緩沖液的溶液)在微量滴定板孔于37℃溫育1小時。將該平板用洗滌緩沖液A洗滌6次后，加入200μl的封閉緩沖液并于37℃溫育30分鐘。洗滌上述平板后，用稀釋緩沖液A將被測試的100μl等份的親和純化的抗體部分以及作陰性對照的相同濃度的正常人的免疫球蛋白稀釋為1∶4到1∶65,000將其于37℃溫育1小時。洗滌上述平板后，加入100μl過氧化酶綴和的羊-抗-人-Ig抗體(Zymed)至稀釋緩沖液A中的稀釋度為1∶1000并于37℃溫育30分鐘。平板用洗滌緩沖液A洗滌四次并用染色緩沖液洗滌兩次。加入100μl特殊底物測定抗體的結合并在3分鐘后加入50μl中止溶液使顏色反應停止。在490nm的波長(參考測定的波長為620nm)處測定光密度(OD)，進行評估。
正如從圖3中所看到的，親和純化的抗體部分已經與抗體17-1A顯著結合而正常人免疫球蛋白實際上沒有結合。
實施例3含有純化抗體的疫苗制劑按照下列指示用氫氧化鋁作佐劑將親和純化獲得的抗體部分制備成制劑向3ml親和層析后得到的抗體溶液(包括大約40μg抗體)中加入1mg氫氧化鋁(水溶液；Alhydrogel，Superfos)并在“FILTRON”離心小管(MicrosepTM，截斷10KD)將懸浮液以4000×g離心30分鐘。接著，將該溶液用1ml制劑緩沖液懸浮兩次并在4000×g離心30分鐘。用制劑緩沖液補加懸浮液到0.5ml并且將該方法所得到的懸浮液以無菌方式灌封。
實施例4用自身免疫親和純化的抗體對獼猴的免疫接種按照實施例2和3所解釋的從獼猴血清中獲得的疫苗，將其在各獼猴背部皮下接種。在第一次接種前，采血5ml用于血清的回收(用于測定免疫應答特征的起始值)。2周后，再采血10ml用于回收血清。用4ml血清按照上述方法重復自身疫苗的回收。再在獼猴背上皮下注射最新獲得的疫苗。接種后4周，再采血5ml用于血清回收(用于測定兩次接種的作用)。
在細胞ELISA中分析該獼猴的前血清和第二次接種后4周的免疫血清，觀察是否抗體結合在KATO III細胞系上。為了這一目的，進行下列步驟將微量滴定板孔用100μl濃度為2×106細胞/ml于培養基A的KATOIII細胞系的細胞懸浮液于+37℃溫育過夜。吸取上清液后，將平板用每孔50μl固定溶液于室溫溫育5分鐘。吸取上清液后，向各孔中加入200μl封閉緩沖液B并將平板于室溫溫育1小時。用200μl洗滌緩沖液洗滌兩次后，將稀釋緩沖液B中稀釋度為1∶4到1∶56,000的被測試100μl等份猴子血清于37℃溫育1小時。用100μl的冰冷洗滌緩沖液B洗滌平板后，加入在稀釋緩沖液A中稀釋度為1∶1000的100μl過氧化酶綴和的羊-抗-人-Ig抗體(Zymed)并于37℃溫育45分鐘。將平板用100μl冰冷洗滌緩沖液B洗滌三次。加入100μl特異底物測定抗體的結合并在大約5分鐘后通過加入50μl中止溶液使顏色反應停止。在490nm波長(參照測定的波長為620nm)測定光密度(OD)，進行評價。
正如從圖4中所看到的，在以自體方式接種過的獼猴免疫血清中含有免疫球蛋白，這些免疫球蛋白能夠結合在Kato III腫瘤細胞上，而在相同動物前血清中幾乎檢測不到這類抗體。
由于上述試驗結果，舉例顯示了在針對腫瘤相關抗原的單克隆抗體上用免疫親和純化法獲得的個體自身抗體部分接種能夠觸發體液免疫應答，它可結合于表達該腫瘤相關抗原的人腫瘤細胞上。
實施例5用兩種不同TAA特異性抗體的免疫親和柱的制備按照標準技術將可與EP-CAM反應的單克隆鼠抗體和可與路易斯Y反應的單克隆鼠抗體都偶合到活化的CH瓊脂糖4B(Pharmacia Biotech，瑞典)7.5g CH瓊脂糖4B懸浮于20ml的1mM HCl 15分鐘并浸泡。在AG3燒結玻璃濾器上將凝膠用1升1mM HCl洗滌，然后用200ml偶聯緩沖液洗滌。在5升偶聯緩沖液中透析100mg鼠源性抗體(貯存液10mg/ml)并用偶聯緩沖液調至5mg/ml。將該溶液與凝膠懸浮液混合于密封容器中，得到凝膠與緩沖液比為1∶2的適合于偶聯的懸浮液。該懸浮液于4℃旋轉24小時。然后，用3×30ml偶聯緩沖液洗掉多余配體。用1M乙醇胺于4℃溫育1小時來封閉剩余的反應基團。然后，凝膠與0.1M Tris-HCl緩沖液于室溫旋轉1小時。最后，用具有不同pH值的緩沖液洗滌三輪。每輪由0.1M含有0.5M NaCl的pH4的醋酸鈉緩沖液接著用含有0.5M NaCl的0.1M的Tris-HCl緩沖液組成。凝膠存放于4℃。
將兩種相同體積的親和基質混合并將其填裝為免疫親和層析柱(System Akta，Pharmacia，瑞典)。
實施例6用兩種不同TAA特異性抗體同時免疫親和純化法從猴子血清中純化抗體從免疫學上幼稚的獼猴中每次采血20ml左右。9ml的各個血清用實施例5中所述的免疫親和層析柱(System Akta，Pharmacia，瑞典)純化。
使用的緩沖液純化緩沖液A
洗脫緩沖液純化緩沖液B用0.5M磷酸氫鈉溶液中和洗脫液。
用這種方法分級分餾含有高濃度的純化蛋白的洗脫液將50μl純化抗體部分在尺寸排阻層析柱(SEC，Zorbax 250GF)上分析。用220mM的pH7的磷酸緩沖液和10％的乙腈作流動劑(流速1.000ml/分鐘；波長214nm)。正如從該分析的層析圖(圖5)中所看到的，抗體部分包括比率為3∶2的IgM(保留時間6.963分鐘)和IgG(保留時間8.745分鐘)。抗體部分總量大約為50μg(與標準物作對照用SEC所測定的，圖6)。
實施例7純化抗體疫苗的不同制劑于離心分離(Centricon 10；Amicon，美國)用的超濾設備中制備疫苗。為了這一目的，用1mM磷酸鈉緩沖液0.86％NaCl pH6.0(NBK)離心分離來洗滌超率設備。然后將1ml緩沖液(NBK)裝入該設備并加入37μlAlhydro凝膠2％(Superfos Biosector，丹麥)。
加入實施例6的中和過的洗脫液后，按照Centricon指示進行離心分離和洗滌(用5ml緩沖液)。
然后，將疫苗重懸浮并用緩沖液補至550μl并以無菌方式灌封。
另外，重懸浮后，將疫苗用緩沖液補至545μl并加入5.μl乙基汞硫代水楊酸鈉貯存液(10mg/ml，Sigma，美國)。
疫苗制劑的第三種變形是在以無菌方式裝入玻璃小瓶后在高壓滅菌器中(121℃；20分鐘)加熱變性。
權利要求
1.抗體生產適合作疫苗治療性或預防性接種抗癌的藥物組合物的用途，其特征在于用免疫親和純化法從含有抗體的體液中回收抗體，其中可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
2.按照權利要求1的用途，其中藥物組合物是用來給從其體液中獲得抗體的個體以自身個體疫苗的意義給藥。
3.按照權利要求1或2的用途，其中體液是血清。
4.按照權利要求1到3中任意一項的用途，其中個體是人。
5.按照權利要求1到4中任何一個的用途，其中免疫親和純化法中同時使用數個針對不同腫瘤相關抗原和/或抗這些抗原的不同表位的抗體。
6.按照權利要求1到5中任意一項的用途，其中用作免疫親和純化法配體的抗體是單克隆抗體。
7.按照權利要求1到6中任意一項的用途，其中重復制備藥物組合物并用作為個體疫苗在適當間隔重復連續給藥。
8.按照權利要求1到7中任意一項的用途，其中腫瘤相關抗原是在上皮源性癌細胞上或神經內分泌源性癌細胞上或血液形成系統的癌細胞上被經常表達和/或共同表達的位于膜上的分子。
9.按照權利要求1到8任意一項的用途，其中將免疫親和純化法純化的抗體或其衍生物與適當的疫苗佐劑一起配制成制劑。
10.權利要求1到9任意一項的用途，其中該組合物還包括可促進免疫應答并可與抗體同時給藥的蛋白。
11.按照權利要求10的用途，其中該蛋白是人蛋白。
12.按照權利要求11的用途，其中人蛋白是粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)。
13.按照權利要求1到12中任何一個的用途，其中該組合物適合于用免疫親和純化法純化的抗體作為疫苗以皮下或肌肉內注射方式給藥。
14.按照權利要求1到13中任何一個的用途，其中組合物中所含抗體與佐劑混合并將其加熱處理。
15.分離的體外培養的個體樹突狀細胞生產適合于作為疫苗治療性或預防性接種抗癌的藥物組合物的用途，其中樹突狀細胞在試管內之前已經與用免疫親和純化法從相同個體的含抗體體液中獲得的抗體溫育，其中可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型的片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
16.一種含有從含抗體體液中用免疫親和純化法獲得的抗體的藥物組合物，其中可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型的片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
17.一種含有分離的體外培養的個體細胞的藥物組合物，其中樹突狀細胞在試管內之前已經與用免疫親和純化法從相同個體含抗體體液中獲得的抗體溫育，其中可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型的片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
18.一種生產抗體制劑的方法，其特征在于抗體是從含有抗體的體液中用免疫親和純化法獲得的，其中可識別一種或多種腫瘤相關抗原或其具有相同獨特型的片段的抗體用作免疫親和純化法的配體。
19.按照權利要求18的方法，其中親和純化中同時使用數個針對不同腫瘤相關抗原和/或抗這些抗原的表位的抗體。
20.按照權利要求18或19的方法，其中用于親和純化的抗體是單克隆抗體。
21.按照權利要求18到20的任何一種方法，其中體液是血清。
22.一種生產藥物組合物的方法，其特征在于按照權利要求18到21中任何一種的方法制備抗體制劑，將按照這種方法獲得的抗體制劑與可藥用載體和/或適當的疫苗佐劑制備成制劑。
23.按照權利要求22的方法，其中將抗體制劑與佐劑混合并將其加熱處理。
全文摘要
本發明涉及可與腫瘤相關抗原抗體結合并且可以用特殊配體的免疫親和純化法從個體體液中獲得的抗體在生產個體、自身、預防或治療接種的抗癌疫苗的用途。用于免疫親和純化的配體是腫瘤相關抗原的抗體或其衍生物。本發明進一步涉及含有免疫親和純化法生產的抗體或該抗體體外脈沖的樹突狀細胞的藥物組合物。
文檔編號A61P35/00GK1390138SQ00815789
公開日2003年1月8日 申請日期2000年11月15日 優先權日1999年11月16日
發明者H·洛伊博納, H·艾克特, G·希姆勒 申請人:伊格尼昂癌癥治療研發股份公司