一種河豚毒素免疫親和柱及其制備方法
【專利說明】
[0001]技術領域:
本發明涉及一種河豚毒素的免疫親和柱及其制備方法，屬于水產毒素檢測領域。
[0002]【背景技術】:
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是豚魚類(俗稱河豚魚)、其它多種海洋生物以及蠑螈、火蜥蜴、青蛙、蟾蜍、扁形蟲等動物體內含有的一種生物堿(氨基全氫喹唑啉型化合物)，是自然界中所發現的毒性最大的神經毒素之一，其分子式為CnH170sN3，分子量為319，是小分子量、非蛋白質的神經性毒素，其毒性比劇毒的氰化鈉還要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。河豚毒素對腸道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神經末梢和神經中樞，阻礙神經傳導，從而引起神經麻痹而致死亡。其具體作用機制是通過與鈉離子通道受體結合，阻斷電壓依賴性鈉通道，從而阻滯動作電位，導致與之相關的生理活動的阻礙，主要是神經肌肉的麻痹，河豚毒素對呼吸和心血管的抑制是對中樞和外周神經共同作用的結果。河豚毒素的化學性質穩定，一般烹調手段難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施。因此TTX的檢測具有非常重要的現實意義。
[0003]TTX檢測技術主要包括以小鼠檢測法為代表的生物檢測技術；以熒光分光光度法、液相色譜檢測法為代表的儀器檢測技術。小鼠檢測法是利用河豚毒素的毒性特點進行的小鼠毒性檢測的方法，方法簡便，但定量不準確且重復性差、目標性差，已少用。熒光分光光度法是最早建立的測定TTX的儀器方法，操作簡便，但靈敏度低、專一性差。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。是定量分析真菌毒素最常用的方法。
[0004]在使用高效液相色譜檢測河豚毒素時，需要先將河豚毒素樣品進行凈化處理。目前常用的凈化處理方法就是固相萃取法，也叫柱層析法。是目前真菌毒素凈化使用最廣泛的方法。其中，免疫親和柱方法的分析速度快，靈敏度高，分離效率和回收率高，不需要劇毒的真菌毒素標準物來標定，安全可靠。因而成為最常用的方法。
[0005]用于目前制備免疫親和純化柱的方法大概有:溴化氰活化直接偶聯法、環氧氯丙烷法、過碘酸鈉法等。這些方法的基本原理都是將載體基質進行化學活化后，將抗體偶聯到載體上。但是由于偶聯是非特異性的，抗體的任何部位都有可能和載體偶聯，方向性是不可控制的。勢必影響親和純化柱純化河豚毒素的效率。
[0006]
【發明內容】
:
本發明的目的在于提供一種河豚毒素免疫親和柱及其制備方法和用途。
[0007]為了達到上述目的，在本發明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動物抗體的Fc部位相結合。并且具有很高的親和力。我們克隆了蛋白G的基因序列，并且對其密碼子進行了優化、重組后，在大腸桿菌中表達出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G。將基因重組的蛋白G偶聯到載體上后，再將河豚毒素抗體偶聯到蛋白G上，制備出了河豚毒素一蛋白G—載體，再用交聯劑將載體進行交聯。交聯后的載體裝柱后就形成了高親和力的河豚毒素免疫親和柱。該親和柱操作簡便，純化河豚毒素效率高。樣本經過簡單的處理后就可以進行純化，得到純度很高的河豚毒素。用于高效液相色譜檢測。
[0008]具體操作如下:
本發明最大的優勢就是利用了蛋白G與Ig抗體特異性結合的特點，IgG抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，抗體分為Fab區和Fc區，其中，Fab區是抗原結合的區域。
[0009]蛋白G是鏈球菌細胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fc區域有特異性的結合能力。蛋白G與抗體結合后，抗體的Fab區域游離在外，不影響抗體的抗原結合能力。經過我們基因優化重組后的蛋白G，1個分子的蛋白G可以結合3個分子的IgG抗體，具有很高的抗體親和力。并且只有抗體能與蛋白G結合，其余蛋白均不能與蛋白G結合，特異性很高。以此蛋白G為基礎制備的免疫親和柱具有特異性好，河豚毒素結合量大，純化效率高的特點。
[0010]河豚毒素免疫親和柱及其制備方法說明如下:
1.載體活化
選擇瓊脂糖載體，sepharose4B,以環氧氯丙燒活化法進行活化。
[0011 ] 取2%的預溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4B,用20倍體積的蒸懼水充分沖洗,洗去殘存的乙醇，用漏斗過濾掉水分。
[0012]稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的環氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉NaBH4，5毫升，在25°C下搖床反應8小時。
[0013]反應后，用大量的蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環氧氯丙烷。
[0014]2.將蛋白G與活化載體sepharose4B的偶聯
將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯緩沖液(0.1M的NaHC03,0.8M NaCl，PH8.9)洗滌3次。加入2mg/ml的蛋白G，室溫偶聯4小時。
[0015]將偶聯好的瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次。偶聯有蛋白G的瓊脂糖載體sepharose命名為蛋白G_sepharose。
[0016]3.抗河豚毒素抗體與蛋白G-sepharose載體上的蛋白G連接
蛋白G與抗體具有特異性的親和力，在一定的反應條件下，將偶聯有蛋白G的瓊脂糖凝膠與抗體進行連接。將抗體連接于瓊脂糖上。由于蛋白G與抗體的結合部位是抗體的Fc區域，抗體的抗原結合區不受影響，充分保證了抗體的抗原結合能力。
[0017]將抗河豚毒素抗體溶于20mM、PH7.4的PBS中，終濃度2mg/ml。將抗體加入用20Mm PH7.4的PBS緩沖液洗滌過的蛋白G_s印harose中。室溫結合30分鐘。
[0018]結合后的載體用PBS洗滌。連接有抗體的載體命名為抗體一蛋白G—sepharose ο
[0019]4.載體交聯
將抗體一蛋白G— s印harose用0.1M PH9.0的硼酸緩沖液洗滌3次。然后加入0.1MPH9.0的硼酸緩沖液，在緩沖液中加入交聯劑如庚二亞氨酸二甲酯(DMP)至終濃度20mM。室溫交聯1小時。
[0020]加入50mM，PH9.0的乙醇胺終止反應。并用50mM的乙醇胺封閉10分鐘。
[0021]交聯后的抗體一蛋白G—sepharose載體用20mM, PH7.4的PBS洗滌3次。
[0022]5.裝柱
將交聯后的抗體一瓊脂糖載體根據需要裝入層析柱中，可根據需要制備不同容量的河豚毒素親和純化柱。