基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法，屬于分析化學技術領域。
【背景技術】
[0002]甲胎蛋白(a -fetoprotein，AFP)，是一種致癌糖蛋白，作為一種成人生理狀態的“分子標記”，并經常用作診斷肝細胞癌、卵黃囊腫瘤、生殖細胞腫瘤、胃癌的合適的生物標志物。目前檢測AFP的方法主要有放射免疫分析法和酶聯免疫法(ELISA)，但均存在一定的優缺點，適用范圍上也各有不同，所以臨床應用中需考慮這兩種方法都存在著一些不足之處。ELISA法檢測腫瘤標志物時，因蛋白質容易熱變性，所以很難檢測蛋白類腫瘤標志物，另ELISA法的靈敏度較低，而且耗力耗時；放射免疫分析法有時會出現交叉反應、假陽性反應，組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶，鹽及pH有時會影響結果等缺點。如何建立靈敏和特異的檢測腫瘤標志物的方法也是需要急需解決的一個難點問題，而納米材料是當今社會的研宄熱點，可以把納米材料作為一種新型探針，進行AFP的快速靈敏檢測是一大亮點。
[0003]由于自身尺寸大小，納米結構材料具有獨特的理化性質，成為當前材料研宄最活躍的領域之一。最近幾十年，銀納米粒子由于其獨特的物理化學性質(如小尺寸效應、表面效應、量子隧道效應、介電限域效應、宏觀量子隧道效應等)，尤其銀納米材料還具有良好的抗菌活性，已經成為許多基礎研宄與應用研宄所關注的對象。納米材料的自組裝是納米技術的一個研宄熱點，原因在于自組裝納米材料能夠表現出不同于單分散的納米粒子的獨特的光學、電學、磁學和化學性質，通過研宄自組裝材料的性質可以更好地理解宏觀材料的物理和化學性質。表面增強拉曼散射(SERS)是一種已被廣泛應用于化學和生物傳感的分析方法，相比于熒光技術檢測，由于表面增強拉曼光譜是一種通過非特異性的波長激光激發得到特定分子的指紋圖譜和它通過金屬粒子周圍拉曼信標保持其光的穩定性并提供化學鍵信息，因此SERS能夠收集較窄拉曼光譜的峰寬，具有更大的潛在生物標志物分析應用能力。
[0004]本發明首先通過在銀納米粒子的表面修飾甲胎蛋白的適配體及其互補序列，進行三聚體組裝，并對其拉曼性質進行了研宄和探討。加入不同濃度的甲胎蛋白溶液，對三聚體的拉曼信號進行測試，以達到對甲胎蛋白的傳感檢測目的，檢測線可達到0.097aM。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法。
[0006]本發明的技術方案，基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法，包括銀納米粒子的合成，銀納米粒子三聚體的組裝及結構表征、拉曼信號測試，用銀納米粒子三聚體檢測甲胎蛋白。具體步驟如下:
(I)銀納米粒子的合成:根據申請號201110274220.X公開的內容進行15 nm銀納米粒子的合成；取20mL超純水與5mL質量分數1%的聚乙烯吡咯烷酮混合，再加入0.6 mL
0.lmol/L的硼氫化鈉水溶液，此反應在冰浴中進行。然后，將5 mL質量分數為1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和5mL質量分數為0.15%的硝酸銀水溶液同時以30mL/h的速度用注射泵加入到上述溶液中，注意邊攪拌邊加入，待加入結束后，立即放入80°C水浴中生長2h,即得到15nm銀納米粒子。
[0007](2)銀納米粒子三聚體的組裝:取三管已濃縮好的15nm粒徑銀納米粒子溶膠，保證每管中每個銀納米粒子表面分別可控修飾一個甲胎蛋白的適配體及和其互補序列，進行雜交得銀納米粒子三具體；
通過電鏡TEM和拉曼光譜儀對銀納米粒子三聚體的結構及拉曼信號進行表征和測試； 適配體 5’ -SH-GGCAGGAAGA CAAACAGGAC CGGGTTGTGT GGGGTTTTAA GAGCGTCGCC TGTGTGTGGT CTGTGGTGCT GT-3’ ；
互補序列 1:5’ -SH-CCGGTCCTGT TTGTCTTCCT-3’，
互補序列 2:5’ -SH-GGCGACGCTC TTAAAACCCCA-3’ ；
(3)甲胎蛋白的檢測:將甲胎蛋白加入已組裝好的銀納米粒子三聚體中，反應lOmin，進行拉曼測試；
所述銀納米粒子三聚體的組裝:取三管50mL已濃縮好的銀納米粒子分別和50mL巰基修飾的甲胎蛋白的適配體及其互補序列進行偶聯，在室溫下過夜反應，分別在13000r/min離心15 min，棄上清，后用50mL的超純水分散沉淀，待用；
將50mL銀-適配體、50 mL銀-互補序列l、50mL銀-互補序列2于150mL的5 mM PB緩沖液中，雜交反應12h，組裝產物離心15 min，棄上清，后用10mL的超純水分散，進行TEM和拉曼表征。
[0008]所述甲胎蛋白的檢測:取10mL的銀納米粒子三聚體，加入ImL不同濃度的甲胎蛋白，使其終濃度在O?20aM (具體為0、0.2、0.5、1、2、5、10、20 aM)，反應10 min，進行拉曼測試。
[0009]本發明的有益效果:本發明基于拉曼信號作為檢測信號，不僅穩定而且檢測限低，而銀納米粒子在紅外區具有最強的等離子共振峰。本發明組裝了銀納米粒子三聚體并顯示較強的拉曼信號，基于強的拉曼強度進行甲胎蛋白的檢測，可以大大提高檢測的靈敏度。
【附圖說明】
[0010]圖1銀納米粒子三聚體組裝結構的TEM圖。
[0011]圖2不同濃度甲胎蛋白下銀納米粒子三聚體的拉曼信號。
[0012]圖3基于銀納米粒子三聚體組裝結構進行甲胎蛋白檢測標準曲線。
【具體實施方式】
[0013]實施例1基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法
(I)銀納米粒子三聚體的合成:根據申請號201110274220.X公開的內容進行15 nm銀納米粒子的合成；取20 mL超純水與5 mL質量分數1%的聚乙烯吡咯烷酮混合，再加入0.6mL 0.lmol/L的硼氫化鈉水溶液，此反應在冰浴中進行。然后，將5 mL質量分數為1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和5 mL質量分數為0.15%的硝酸銀水溶液同時以30mL/h的速度用注射泵加入到上述溶液中，注意邊攪拌邊加入，待加入結束后，立即放入80°C水浴中生長2h，即得到15nm銀納米粒子。
[0014]將合成好的10mL 15 nm的銀納米粒子在13000r/min離心15min，棄上清，后用200mL的超純水分散沉淀，待用。
[0015](2)銀納米粒子三聚體的組裝:取三管50mL已濃縮好的銀納米粒子分別和50mL巰基修飾的甲胎蛋白的適配體及其互補序列進行偶聯，在室溫下過夜反應，分別在13000r/min離心15min，棄上清，后用50mL的超純水分散沉淀，待用；
將50mL銀-適配體、50mL銀-互補序列l、50mL銀-互補序列2于150mL的5 mM PB緩沖液中，雜交反應12h，組裝產物離心15 min，棄上清，后用10mL的超純水分散，進行TEM和拉曼表征。
[0016](3)甲胎蛋白的檢測:取10mL的銀納米粒子三聚體組裝體，加入ImL甲胎蛋白溶液，終濃度范圍為0，0.2，0.5，1，2，5，10，20&11，反應10 min，進行拉曼測試。最低檢測限達0.097aMo
【主權項】
1.基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法，其特征在于包括銀納米粒子的合成，銀納米粒子三聚體的組裝及結構表征、拉曼信號測試，用銀納米粒子三聚體檢測甲胎蛋白；具體步驟如下: (1)銀納米粒子的合成:進行15nm粒徑銀納米粒子的合成； (2)銀納米粒子三聚體的組裝:取三管已濃縮好的15nm粒徑銀納米粒子溶膠，保證每管中每個銀納米粒子表面分別可控修飾一個甲胎蛋白的適配體及和其互補序列，進行雜交得銀納米粒子三聚體，通過電鏡TEM和拉曼光譜儀對銀納米粒子三聚體的結構及拉曼信號進行表征和測試； 適配體:5’ -SH-GGCAGGAAGA CAAACAGGAC CGGGTTGTGT GGGGTTTTAA GAGCGTCGCCTGTGTGTGGT CTGTGGTGCT GT-3’ ；互補序列 1:5’ -SH-CCGGTCCTGT TTGTCTTCCT-3’，互補序列 2:5’ -SH-GGCGACGCTC TTAAAACCCC A-3’ ； (3)甲胎蛋白的檢測:將甲胎蛋白加入已組裝好的銀納米粒子三聚體中，反應lOmin，進行拉曼測試。2.根據權利要求1所述基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法，其特征在于所述銀納米粒子三聚體的組裝步驟如下: 取三管50mL已濃縮好的15nm粒徑銀納米粒子分別與50 mL巰基修飾的甲胎蛋白的適配體及其互補序列進行偶聯，在室溫下過夜反應，分別在13000r/min離心15min，棄上清，后用50 mL的超純水分散沉淀，待用； 將50 mL銀-適配體、50 mL銀-互補序列1、50 mL銀-互補序列2于150 mL的5 mMPB緩沖液中，雜交反應12h，組裝產物為銀納米粒子三聚體，離心15min，棄上清，后用10mL的超純水分散，進行TEM和拉曼表征。3.根據權利要求1所述基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法，其特征在于甲胎蛋白的檢測步驟如下:取10mL的銀納米粒子三聚體，加Λ I mL不同濃度的甲胎蛋白，使其終濃度在0-20aM，反應lOmin，進行拉曼測試。
【專利摘要】基于銀納米粒子三聚體的表面增強拉曼散射效應超靈敏檢測甲胎蛋白的方法，屬于分析化學技術領域。本發明具體包括15nm粒徑銀納米粒子的合成、銀納米粒子修飾DNA、銀納米粒子三聚體的組裝，并對其進行TEM表征和拉曼信號測試。本發明首次通過組裝銀納米粒子三聚體，銀納米粒子三聚體具有強的拉曼信號，在外加甲胎蛋白后拉曼信號發生變化，用此拉曼信號的變化實現了甲胎蛋白的快速超靈敏檢測。
【IPC分類】G01N21/65
【公開號】CN104931478
【申請號】CN201510318722
【發明人】匡華, 付盼, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 胡擁明
【申請人】江南大學
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月11日