酵母硒總硒、無機硒、有機硒含量的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酵母硒中硒含量，尤其是有機硒含量的測定方法。
【背景技術】
[0002] 1974年，美國食品藥品監督管理局（FDA)開始允許在畜禽和豬飼料中添加硒。至 此，無機硒和有機硒的研宄與應用進入了更加開闊的領域（Ullrey，1992)。獲得有機硒最經 濟的來源之一是通過酵母富集無機硒（Neve，1998)。酵母能夠吸收碳、氮、磷、硫和礦物質以 及微量元素，因為硒與硫是同族元素，在物理及化學特性上具有相似性，使得其在酵母細胞 生物合成反應中取代硫（Jian Zheng，2003)，富硒酵三母就是在酵母培養過程中加入亞硒 酸鈉等形式的無機硒，使之轉化為有機硒形式并在酵母中富集而生產出的一種微生物發 酵產物(蔣守群，2006)。富硒酵母中所能達到的最大硒量約為3000 mg/kg (Demirci，1999; Gassner，1999)，而商業富硒酵母的含硒量一般為500~2000 mg/kg ( 0? 05%~0? 20%)( Schrauzer, 2006)。我國的飼料添加劑品種目錄（2013)中將亞硒酸鈉和酵母硒作為礦物 元素飼料添加劑用于養殖動物補硒劑。亞硒酸鈉作為硒添加劑，硒源豐富，價格較低，但是 存在生物有效性低、中毒量與需要量之間范圍小、毒性大、易污染環境等缺陷，因而被嚴格 限制其使用量(劉恒，2014)，歐盟等一些國家和地區已經限制或禁止使用亞硒酸鈉作為硒 的營養補充劑(劉娜，2010)，例如瑞典已限制其在乳豬料中使用。而日本則禁止在動物飼料 中添加亞硒酸鈉(沈銀書，2008)。富硒酵母作為有機硒飼料添加劑，具有硒利用率高、毒性 低、對環境污染小等優點，其添加效果大大優于亞硒酸鈉，因而受到廣泛的關注，并呈現逐 漸取代亞硒酸鈉在飼料中添加的趨勢(沈銀書，2008)。
[0003]目前，酵母硒的有機硒含量測定方法還沒有形成國家標準。常用的總硒的含量 測定是基于分光光度法分析硒與有機試劑間形成的苤硒腦衍生物，如3,3-二氨基聯苯 胺（Porcella，1991)、雙硫腙（0 &11^611，1980)、鄰苯二胺(周建波，1993)、2,3-二氨基萘 (Juana, 2004)、6_ 氨基-1-萘酷 _3_ 橫酸（Ramachandran，1993 ;Manish，1994)、2, 3-二 氨基-1，4_二溴代萘（]〇1^1188011，1995);氫化物發生-原子吸收光譜法（1&188〇116165〇1， 1991 ;Ragnar，1987)和原子熒光光譜法（高建忠，2006 ;王世成，2013)，也被報道用于硒 的測定，氫化物-原子熒光光譜法成為我國國家標準食品中硒的測定法的標準（GB/T 5009.93-2010)。
[0004]對于有機硒樣品中總硒的測定，我國國家標準食品中硒的測定法（GB/T 5009. 93-2010)和飼料中硒的測定（GB/T 13883-2008)中，將試樣置于消化瓶或燒杯中加入 20 mL混合酸，再用電熱板加熱煮沸消化，后用用氨水或鹽酸調至淡紅橙色（pHl. 5~2. 0)，并 用甲酚紅溶液來做指示劑。上述方法中，20 ml混合酸帶來環境污染和資源浪費；消化是否 完成則以觀察消化過程中產生的濃白煙來判定，由于沒有一個明確的指標，大多數情況下 都是憑借經驗做出判斷，使判定結果很難精確，受主觀因素影響很大；硒在上述消化過程中 很容易揮發損失，使測定結果難于保證；另外由于樣品消化液本底的干擾，指示劑對顏色變 化很難判斷，同時指示劑的加入也會帶來干擾的可能。
[0005] 國家標準方法中尚無無機硒的測定方法，文獻報道先用緩沖鹽或酸來提取(高建 忠，2006)，再采取總硒的測定方法來進行測定；也有報道為了測定硒酵母中有機硒的含 量，首先建立了一種無機硒和有機硒的鑒別方法，再采用透析處理法使硒酵母中的無機 硒和有機硒得以分離。上述提取方法耗時較長且十分繁瑣。

【發明內容】

[0006] 針對現有硒檢測技術的不足，本發明提供一種酵母硒總硒、無機硒、有機硒含量的 測定方法。
[0007] -種酵母硒總硒含量的測定方法，稱取50 mg的酵母硒于100 mL的圓底燒瓶中， 加入1 mL的質量百分比為69%的濃硝酸，再加入2 mL質量百分比為70 %~72%的高氯酸， 置于沸水浴中磁力攪拌lh;結束冷卻后，加入8. 4 mL濃度為6 mol/L的HCL，再置沸水浴中 反應10 min，將上述溶液轉移到容量瓶中，并用水定容至100mL，取出2.0 mL加入至錐形瓶 中，再加入30~40mL的水，調節pH至1. 5~2. 0,接著加入3 mL EDTA混合液搖勻，后加入 3 mL DAN (2, 3-二氨基萘）溶液，搖勻，置于沸水中保持5 min，取出冷卻至室溫，然后全部 轉移到125 mL分液漏斗中，加10 mL環己燒振蕩2.0 min，靜置分層后，用激發光波長376 nm、發射光波長520 nm測定環己烷層的熒光強度，從而得到酵母硒中總硒含量。
[0008] 所述的調節pH至1. 7~1. 9。
[0009] -種酵母硒無機硒含量的測定方法，稱取25 mg的酵母硒于100 mL的圓底燒 瓶中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，置于沸水浴中磁力攪拌10 min，冷卻后調節pH至 1.5~2.0,接著加入3 mL EDTA混合液搖勻，后加入3 mL DAN溶液，搖勻，置于沸水中保持5 min ;取出冷卻至室溫，全部轉移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL環己烷振蕩2. 0 min，靜 置分層后，用激發光波長376 nm、發射光波長520 nm測定環己烷層的熒光強度，從而得到 酵母硒中的無機硒含量。
[0010] 一種酵母硒有機硒含量的測定方法，總硒含量根據所述方法測定，無機硒含量根 據所述方法測定，相差得到有機硒的含量。
[0011] 本發明的有益效果 本發明得到了有機硒含量測定方法：對總硒的測定使用了 3 mL混合酸，大大減少了混 合酸的用量；對總硒和無機硒含量的測定避免了使用電熱板加熱煮沸消化，消解和提取在 加蓋的圓底燒瓶中水浴進行，該操作可以避免強氧化還原性酸對實驗室環境的污染，同時 可防止硒的揮發損失，得到較高回收率，同時有效提高樣品前處理的可操作性和準確性；取 消了甲酚紅指示劑的使用，用pH計來監測酸性環境，避免了樣品對指示劑顏色變化的判斷 造成干擾，同時也減少了指示劑對待測液的干擾的可能性；通過測定環己烷萃取層的熒光 值可計算硒的含量，避免了使用成本較高的原子熒光分光譜儀的使用，使普通實驗室能夠 用該方法完成硒樣品中有機硒含量的檢測；總硒和無機硒的測定時間大大縮短，總硒的消 化和無機硒的提取同時在約一個小時可以完成。
【附圖說明】
[0012] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進一步詳細的說明； 圖1為硒標準溶液的標準曲線及線性方程。
【具體實施方式】
[0013] 方法原理 樣品中的硒可能以不同的化學形式存在，包括無機硒和有機硒。樣品經酸加熱消化后， 在鹽酸介質中，將試樣中的硒統一還原成四價硒，四價硒在微酸性條件下與2,3_二氨基萘 (DAN)生成苤硒腦絡生物，用環己烷萃取。用熒光光度計在激發波長為376 nm、發射波長為 520 nm條件下測定熒光強度，從而計算出樣品中的硒含量。
[0014] 總硒含量測定方法，準確稱取50 mg左右的酵母硒于100 mL的具塞圓底燒瓶中， 加入1 mL的濃硝酸（69%)，再加入2 mL的高氯酸（70 %~72%)，再置沸水浴中磁力攪拌lh; 冷卻后加入8.4 mL HCL(鹽酸濃度為6 mol/L)，再置沸水浴中反應10 min。我國國家標準 食品中硒的測定法（GB/T 5009. 93-2010)和飼料中硒的測定（GB/T 13883-2008)將試樣置 于消化瓶或燒杯中加入20 mL混合酸，再用電熱板加熱煮沸消化。20 ml混合酸帶來環境 污染和資源浪費；消化是否完成以觀察消化過程中產生的濃白煙來判定，由于沒有一個明 確的指標，大多數情況下都是憑借經驗做出判斷，使判定結果很難精確，受主觀因素影響很 大；硒在上述消化過程中很容易揮發損失，使測定結果難于保證；由于樣品消化液本底的 干擾，指示劑對顏色變化很難判斷，同時指示劑的加入也會帶來干擾的可能。
[0015] 本方法將上述溶液無損轉移到容量瓶中，并用純水定容至500 mL，取出2. 5 mL加 入至錐形瓶中，再加入30~40mL的水，用氨水溶液和3 mol/L鹽酸調節pH至1.7~1.9,上述 國標用氨水或鹽酸調至淡紅橙色（PHI. 5~2. 0)，并用甲酚紅溶液來做指示劑，由于樣品消化 液本底的干擾，指示劑對顏色變化很難判斷，同時指示劑的加入也會帶來干擾的可能。
[0016] 用0. 1 mol/L鹽酸溶液稀釋定容至100 mL，接著加入3 mL EDTA混合液搖勻，后 加入3 mL DAN溶液，搖勻，置于沸水中保持5 min。取出冷卻至室溫(一般為25攝氏度)，全 部轉移到125 mL的分液漏斗中，加10 mL環己燒振蕩2. 0 min，靜置分層后，于焚光分光光 度計上