一種抗bpi-anca抗體檢測試紙條的制備方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫分析檢測領域。具體而言，本發明涉及一種檢測BPI-ANCA的免疫 層析檢測試紙的制備方法及應用。
【背景技術】
[0002] 炎癥性腸病（inflammatoryboweldisease，IBD)是一種病因尚不十分清楚的 慢性非特異性腸道炎性疾病，包括潰瘍性結腸炎（Ulcerativecolitis，UC)和克羅恩病 (Crohn'sdisease，CD)。克羅恩病于 1932 年由Crohn、Ginzterg和Oppenheime最早描 述，故得此名。1973年，世界衛生組織醫學科學國際組織委員會將本病定名為Crohn病。其 特點為病因未明，多見于青年人，表現為肉芽腫性炎癥病變，合并纖維化與潰瘍。可侵及全 胃腸道的任何部位，包括口腔、肛門，病變呈節段性或跳躍性分布，并可侵及腸道以外，特別 是皮膚。臨床表現因病變部位、范圍及程度不同而多樣化，病程緩慢，易復發。
[0003] IBD是北美和歐洲的常見病，近30年來日本IBD發病率亦呈逐步增高趨勢，我國雖 尚無普通人群的流行病學資料，但近10多年來本病就診人數呈逐步增加趨勢則非常明顯。 IBD的臨床表現復雜多樣，不僅有消化道癥狀，還可有腸外表現。由于癥狀為腹痛、腹瀉、便 血等非特異性腸炎表現，⑶與UC、以及IBD與結核性腸炎等其他腸道慢性疾病很難鑒別診 斷，特別在缺乏組織學證據時，需有更多相對特異性的標志物為診斷提供幫助。研宄發現， 多種非侵入性的生物活性標志物對IBD的診斷及炎癥活動性的評價具有重要意義。
[0004] 明確具有診斷價值的血清特異性抗體標記物包括核周型抗中性粒細胞抗體 (pANCA)、抗釀酒酵母抗體（ASCA)、抗胰腺腺泡抗體（PAB)、抗細胞外膜蛋白復合物抗體 (OmpC)、12抗體和鞭毛蛋白（包括CBirUFlaX和A4-Fla2)等。其中抗中性粒細胞胞漿抗 體（anti-neutrophilcytoplasmicantibody，ANCA)ANCA是以中性粒細胞和單核細胞胞衆 成分為抗原的自身抗體。研發發現，與IBD相關的ANCA抗原蛋白主要包括通透性殺菌蛋白 BPI-ANCA、髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，MP0-ANCA)，以及PR3-ANCA。王瓊等報道（齊齊 哈爾醫學院學報2010年第31卷第23期），約46. 9%的pANCA陽性的UC患者為BPI-ANCA 抗體陽性，而⑶患者中PBI-ANCA抗體陽性率只有3. 3%，提示該指標可用于有效鑒別UC和 CD。BPI是一類陰離子抗菌蛋白，由于BPI有結合脂多糖、中和內毒素的作用，是宿主反應 中中性粒細胞殺滅革蘭陰性桿菌的活性蛋白。因此它是粒細胞防御和清除外界感染的重要 因子。UC患者BPI-ANCA抗體的出現可能與機體在某種微生物感染后，觸發中性粒細胞BPI 的合成和釋放增加，而機體的免疫識別及調節的異常可產生針對BPI的自身抗體。
[0005] 現有BPI-ANCA的檢測方法主要有兩種：間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescenceassay,IIF)和酶聯免疫吸附法（Enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA)oELISA法檢測可用于高通量標本測定，靈敏度也比較高，目前也被廣泛認可， 但其操作比較繁瑣，需要多次加樣洗滌及孵育步驟，完成整個實驗過程需要3小時左右，需 要酶標儀，對于實驗人員專業技術要求比較高，同時受到各種環境條件的影響，對實驗帶來 諸多不便。
[0006] 間接免疫熒光檢測技術是把抗原細胞固定在載玻片上，熒光染色用熒光顯微鏡進 行觀察，該技術具有高特異性，但由于顯微鏡觀察需要主觀判斷，對檢驗人員的要求高，并 且依賴于熒光顯微鏡，使用不便。
[0007] 免疫層析法（Immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術，其 原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區帶，當該干燥的纖維 素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至 固定有抗體的區域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，形成肉眼可見的檢 測帶。現有的免疫層析試紙條產品常用的示蹤標記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等， 其中以納米金應用最為廣泛，納米金也稱為膠體金。
[0008] 以膠體金作為失蹤標記物的免疫層析技術特稱為免疫膠體金技術（Immune colloidalgoldtechnique，GICT)。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血 酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定 的膠體狀態而得名。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢 固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質 結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物 理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而 使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。
[0009] 表面帶活性基團的彩色膠乳微球也可以作為免疫層析的示蹤劑，與膠體金技術一 樣，彩色膠乳標記免疫層析技術也具有操作簡便、試劑穩定、快速出結果、可室溫保存等優 點。彩色膠乳標記是將不同直徑范圍〇.IUM~IUM彩色膠乳微球與含有羧基、氨基、羥基 等酯類或其他大分子物質共價結合，使這些大分子標記上顏色，當在檢測線或質控線上富 集停留后形成肉眼可見的彩色條帶。
[0010] 與現有技術ELISA和IFA相比，免疫層析法檢測的優點主要包括：（1)使用方便 快速，便于基層使用和現場使用，所有反應能在20分鐘內完成；（2)成本低，不需要特殊的 儀器設備；（3)應用范圍廣，可適應多種檢測條件；(4)可以進行多項檢測，若陽性樣本比較 難獲得，多項檢測可以節省樣品，降低成本；（5)標記物穩定，標記樣品在4°C貯存兩年年以 上，無信號衰減現象；(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發色試劑，省卻了酶標的致癌性 底物及終止液的步驟，對人體無毒害。
[0011] 在自體免疫性疾病診斷方面，已出現較多的免疫層析試紙，但基于抗BPI-ANCA抗 體檢測的免疫層析試紙在國內外市場上仍沒有問世。

【發明內容】

[0012] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有方法的不足，將免疫層析法應用到抗 BPI-ANCA抗體的檢測中，采用間接免疫法來實現對樣品中的抗BPI-ANCA抗體進行檢測，通 過把BPI-ANCA抗原蛋白包被在結合墊或分析膜的檢測帶上，實現對樣品中抗BPI-ANCA抗 體的高特異、高靈敏度、高準確性的檢測，快速篩查抗BPI-ANCA抗體陽性標本，為臨床炎癥 性腸病等自體免疫性疾病提供快速的輔助診斷。
[0013] 本發明的目的之一在于提供一種快速、準確的抗BPI-ANCA抗體的免疫層析檢測 試紙條及制備方法，目的之二是提供一種基于免疫層析技術的抗BPI-ANCA抗體檢測方法。
[0014] 作為本發明第一個方面的一種抗BPI-ANCA抗體的免疫層析檢測試紙條，包括樣 品墊、結合墊、分析膜、吸水墊和底板，分析膜上設置檢測帶和質控帶，所述底板的上部貼合 有分析膜，分析膜上部的兩端分別貼合有結合墊和吸水墊，結合墊上部的一端貼合有樣品 墊。
[0015] 所述的結合墊（2)包被膠體金標記物或彩色膠乳標記物。
[0016] 所述的結合墊為1層（圖1)或2層（圖2)，其中2層時錯落與分析膜搭接。
[0017] 所述檢測帶⑷設1條或2條，用于同時或分別檢測BPI-ANCA抗體的IgG型和 IgA型。
[0018] 所述抗BPI-ANCA抗體的免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 步驟I.BPI-ANCA抗原蛋白的制備
[0020] 步驟2.結合墊⑵制備
[0021] (1)納米金標記物的制備：用納米金溶液標記BPI-ANCA抗原蛋白、抗人IgG抗體、 抗人IgA、葡萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（ProteinG)，以及其他與質控帶C線能形 成免疫復合物的蛋白。
[0022] (2)彩色膠乳標記物的制備：用帶活性氨基或羧基基團的彩色膠乳標記BPI-ANCA 抗原蛋白、抗人IgG抗體、抗人IgA葡萄球菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（ProteinG)，以 及其他與質控帶C線能形成免疫復合物的蛋白。
[0023] (3)結合墊（2)制備：玻璃纖維膜或聚脂膜作為結合墊，先用含BSA和糖的緩沖液 預處理并烘干，將步驟（1)制備的納米金標記物或膠乳標記物，用噴涂儀噴涂在預處理的 玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。
[0024] 步驟3.分析膜（3)制備
[0025] (1)檢測帶T線⑷制備：根據結合墊標記蛋白類型選擇檢測帶T線包被蛋白，如 結合墊上的結合蛋白含BPI-ANCA，檢測帶T線的包被蛋白是抗人IgG或/和IgA。如果結 合墊上含有抗人IgG或/和IgA，檢測帶T線包被蛋白為BPI-ANCA。
[0026] (2)質控帶C線（5)制備：根據結合墊的標記蛋白類型選擇質控帶的包被蛋白，如 結合墊標記蛋白是單一的BPI-ANCA，質控帶C線的包被蛋白為抗BPI-ANCA的抗體；如果結 合墊標記蛋白是單一的抗人IgG或IgA抗體，質控帶C線的標記蛋白為對應的抗人IgG或 IgA抗體的抗體；或者其他結合墊標記蛋白形成免疫復合物的蛋白。
[0027] 步驟4.樣品墊制備
[0028] 將玻璃纖維