一種用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒。
【背景技術】
[0002] 肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球發病率逐年增長，已超過62. 6萬/年， 居于惡性腫瘤的第5位；死亡接近60萬/年，位居腫瘤相關死亡的第3位。PLC在我國高 發，目前，我國發病人數約占全球的55% ;在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二。因此， 肝癌嚴重威脅我國人民健康和生命。肝臟是人體最大的實質性器官，承擔人體的各類重要 代謝功能，因此，肝臟一旦出現惡性腫瘤將導致未及生命的嚴重后果。又由于肝臟具有豐富 的血流供應，與人體的重要結構如下腔靜脈、門靜脈、膽道系統等關系密切；肝臟惡性腫瘤 發病隱匿，侵襲性生長快速，其治療甚為困難。因此，早期發現、早期診斷對肝癌的治療及其 重要。大量的研究已經證實，在肝癌患者的早期，血清中有數種分子水平已經發生了明顯的 變化，比如：AFP、AFP-L3、CK19、SCCA、DCP、GP73等明顯上升。因此，通過對血清中這些分子 水平的定量檢查可以作為肝癌預測的一個有效手段。
[0003] AFP是目前診斷原發性肝癌最重要的腫瘤標記物，已被廣泛用于肝癌的普查、診 斷、判斷治療效果和預測復發中，但AFP的敏感性和特異性較差，據文獻報道，陽性率僅為 60-70%，并存在假陽性。
[0004] AFP-L3為AFP的異質體。有研究認為，AFP-L3比AFP具有更高的特異性，其敏感 性和特異性分別為36至96%和89至94%。研究表明，AFP-L3與肝功能不佳，腫瘤低分化 程度及生物學惡性行為相關。
[0005] 細胞角蛋白19(CK19)表達于膽管上皮，肝臟干細胞，是膽管上皮標志物。CK19在 惡性上皮細胞中，激活的蛋白酶加速了細胞角蛋白的降解，使得大量細胞角蛋白片段釋放 入血，可作為腫瘤鑒別診斷的參考指標，并能提未腫瘤的分化程度。
[0006] 鱗狀細胞癌抗原（SCCA)鱗狀細胞癌抗原（SCCA)是從宮頸鱗狀上皮細胞癌組織提 取的腫瘤相關抗原TA-4,正常人血清含量極微< 2. 5 μ g/L。SCCA是鱗癌的腫瘤標志物，適 用于宮頸癌、肺鱗癌、食管癌、頭頸部癌，膀胱癌的輔助診斷，治療觀察和復發監測。
[0007] 異常凝血酶原（DCP)是產生于腫瘤細胞的不正常的凝血酶原，與正常凝血酶原相 比，DCP的分子結構特點是其Gla domain結構域中的一個或多個Glu殘基（Glu residus) 沒有被完全羧化（Y-carboxylated)成為Gla,從而失去凝血功能。大約50至60%的HCC 患者DCP水平升高。由于肝病本身可以引起AFP水平的增高，但不能導致DCP水平的增高， 所以DCP診斷HCC比AFP更特異。
[0008] 高爾基蛋白73 (GP73)是存在于高爾基體的一種跨膜蛋白。研究表明，在正常的人 體肝組織中，GP73主要由膽管上皮細胞表達，而肝細胞表達很少甚至不表達。肝細胞受到 病毒感染后可引起GP73的表達上調，在肝癌患者血清中GP73水平顯著升高。GP73診斷肝 癌的敏感性為69%，特異性為75%。
[0009] 血管內皮生長因子（VEGF)，可在體內誘導血管新生（induce angiogenesis in vivo)。VEGF對單核細胞和造骨細胞也是化學趨化因子。在體內，VEGF能誘導血管生成和 增加血管滲透性。基于這些體外與體內的活性，VEGF被認為在傷口愈合、胚胎發育、固體瘤 的生長與轉移等過程有重要作用。
[0010] ct -L巖藻糖苷酶（AFU)是一種溶酶體酸性水解酶，在HCC患者中其血清活性較肝 硬化，慢性肝炎等良性肝病及健康對照組均有明顯升高，診斷HCC的敏感性為75-90%，且 與腫瘤大小無關，對直徑小于2cm HCC的敏感性高于AFP，特異性為79-90%。
[0011] 肝癌的早期的發現率低，主要與早期肝癌的癥狀不明顯以及目前市場上缺乏有效 的檢測手段有關。目前，臨床上肝癌的確診主要通過影像學方法如PET-CT、病理活檢來驗 證。PET-CT檢查費用昂貴，而侵入性活檢對患者來講是極其痛苦的。因此，開發其它有效的 檢測手段是極其必要的。血清學檢測已經成為臨床診斷的一個常規手段。而且，大量的研究 證實，在早期的肝癌患者體內相應的腫瘤標志物的水平明顯上升。比如：AFP、DCP、AFP-L3、 SCCA。所有的這些指標已經成為臨床檢測項目。然而，大量的回顧性研究已經發現，單個指 標的腫瘤標志物對腫瘤的敏感性和特異性都是很低的，因此，通過多個指標的聯合檢測有 可能提高腫瘤檢測的敏感性和特異性。

【發明內容】

[0012] 針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種用于檢測肝癌標志物的抗體芯 片試劑盒，該試劑盒采用抗體芯片技術，能夠同時檢測8種肝癌標志物，避免傳統單個指標 檢測方法樣本使用量大、檢測時間長的弊端，具有檢測速度快、樣本用量少、靈敏度高、穩定 性好等優點，能在普通實驗室推廣和應用。
[0013] 本發明一種檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒，包括：由用于點樣的標準載玻片、 用于防止漏液的軟質硅膠墊、劃分為若干個小格的硬質框架、U形框夾形成的反應槽，所述 U形框夾從兩側將由下至上放置的尺寸對應的所述硬質框架、所述軟質硅膠墊和所述標準 載玻片夾緊在一起，以致所述標準載玻片貼緊封閉所述硬質框架的底部，使所述硬質框架 上的每個小格形成一個小的反應槽，各個小的反應槽里的標準玻片結合有相應濃度的特異 性抗體；所述硬質框架劃分為2 X 8或4 X 16個小格，形成16或64孔框架；所述特異性抗體 為針對選自如下8種腫瘤標志物的抗體：AFP、AFP-L3、DCP、AFU、GP73、SCCA、CK19、VEGF。
[0014] 根據本發明所述的用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述特 異性抗體是采用以下步驟固定于玻片：
[0015] 1)特異性抗體與含有1. 4至2 %酪蛋白的pH7. 4磷酸鹽緩沖液混合形成抗體混合 物；
[0016] 2)于抗體混合物中將每個抗體含量以0. 01至2ng固定于所述點樣孔，每個抗體設 置2至4個重復孔；
[0017] 3)抗體芯片點陣排布于玻片，玻片每平方厘米點10至100個特異性抗體。
[0018] 根據本發明所述的用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述玻 片包括陽性對照孔和陰性對照孔；陽性對照孔為對應特異性抗體的具有相應濃度的生物素 化IgG抗體，每個反應的生物素化的IgG抗體的濃度一致，以便于標準化檢測；陰性對照孔 為具有相應濃度的生物素化的無關抗體，每個反應的生物素化的無關抗體的濃度一致，以 便于標準化檢測。
[0019] 根據本發明所述的用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述樣 本處理液為包含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液，用于裂解細胞沉淀物，可處理血漿、 血清、尿液、咽拭子、細胞培養物、組織等樣本。
[0020] 根據本發明所述的用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的進一步特征，利用熒 光素作為檢測信號，通過比較未知樣品和標準樣本的信號來確定樣品中的目標抗原的濃 度。
[0021] 根據本發明所述的用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的進一步特征，利用 Genepix Pro 6.1軟件獲取芯片上所有點的信號強度，利用電子表格版的分析軟件計算每 個蛋白的表達水平和標準曲線，利用陽性對照信號標準化，背景閾值設置對照組的平均強 度加上2倍標準偏差（SD)進行統計，表達水平高于背景加上2XSD的蛋白用于校正的T檢 驗分析。
[0022] 根據本發明所述的用于檢測肝癌標志物的抗體芯片試劑盒的進一步特征，采用全 自動點樣儀器，各特異性抗體蛋白質的排布可以按照實驗設計需要進行調整，根據不同的 蛋白質芯片排布陣列，控制全自動點樣儀，制備出所需要的中間產品。
[0023] 本發明采用了玻片式抗體芯片平臺與定量抗體芯片平臺。通過在標準大小的玻片 上固定多個特異性捕獲抗體，并用16或64孔的框架形成的多通量的芯片。