專利名稱：一種幽門螺旋桿菌抗體的免疫檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及傳染病免疫分析技術領域，特別涉及一種幽門螺旋桿菌抗體檢 測試劑盒及其纟企測方法。
背景技術：
幽門螺桿菌(HP)是人體胃粘膜內的一種螺旋狀的革蘭陰性細菌。HP菌體 光滑，呈S形，有4 6條鞭毛，易粘附在幽門附近的胃竇部及胃體部的粘膜上， 位于胃粘液的深層，不與胃酸直接接觸。HP在人與人之間通過經口途徑傳播， 具有活力的HP在河水中可存活1周，是慢性胃炎消化性潰瘍和非潰瘍性消化不 良的重要致病因素，臨床上可分為兩種類型I型和II型，其中I型菌抹致病 性極強易引起胃部疾病，II型感染后無一般臨床癥狀。
近年來的綜合研究證實該菌的感染率與胃炎及十二指腸潰瘍密切相關。 幽門螺旋桿菌感染胃入十二指腸后，在正常粘膜上不斷繁殖，逐漸侵害粘膜、 出現皺褶和肥厚；抑制胃液及十二指腸液的正常分泌，破壞了粘膜正常的防御 功能。本菌能迅速水解尿素后又產生大量氨，氨能直接或間接的使粘膜細胞受 損，這些因素導致了胃及十二指腸的病變，HP可產生多種酶類如尿素酶、過氧 化酶、蛋白酶、磷脂酯等。其中尿素酶可分解尿素產生氨，氨即保護細菌不受 胃酶侵襲，又對胃粘膜細胞有直接毒性作用。過氧化酶能抑制一些殺菌物質的 形成。而蛋白酶、脂肪酶等可破壞胃粘膜的完整性。HP產生的空泡毒素可導致 胃粘膜空泡變性。HP是慢性胃炎、消化性潰瘍的重要致病原因之一，并且和胃 癌的發病也有著密切的關系。1986年世界胃腸病學會第八屆會議上便提出了 HP 感染是慢性胃炎的重要病因之一 。
臨床上十二指腸潰瘍患者中有95%呈幽門螺^走桿菌感染陽性，80%胃癌患者感染幽門螺旋桿菌。在我國普通人群中，成年人幽門螺旋桿菌感染率在60%
以上，兒童感染率也高達50%,我國人群感染率比發達國家高出20~40個百分 點。幽門螺旋桿菌感染率高的根本原因是人們缺乏對幽門螺旋桿菌危害的認識， 并在很大程度上不了解幽門螺旋桿菌還會傳染。同時，胃病患者應及時到醫院 進行無創的幽門螺旋桿菌檢測， 一旦發現有感染，只要接受為期兩周的規范化 治療，即可使90%以上幽門螺旋桿菌感染者得到根治，而且復感染率極低。 目前檢測幽門螺旋桿菌(HP)的方法可歸納為兩大類
(1) 非侵入性的方法
①以免疫學法檢測血清中的HP抗體已有多種方法檢測，但公認以酶聯免 疫吸附試驗和免疫印跡試驗為優，優點是特異高，可接近100%,且能進行定量 分析，缺點是不能鑒別既往感染及現疫病人，主要適用于流行病學調查。
a尿素呼氣試驗原理是HP在體內產生尿素酶，用13C或14C標記的尿素 由受試者服下后，即分解產生帶同位素標記的二氧化碳，收集呼氣標本，用液 體閃爍計數器或用氣體核素質譜儀檢測標記的二氧化碳，靈敏度極高，可定量， 患者無痙，方法簡單快速，對檢測HP是否根治十分可靠。因"C有少量放射性 物質，目前均用13(3尿素呼氣試驗。
Q)PCR4全測測胃液、粘膜中HP的尿素酶(UReA)基因和毒素相關蛋白 A (CagA)基因。
(2) 侵入性的方法
這類方法主要需要通過內鏡采取胃粘膜組織來檢測HP。 M夬速尿素酶法原理是HP具有豐富的尿素酶，分解尿素產生氨，使反應 變成堿性，由PH指示劑顯色，該法簡便，快速，靈敏，但有些細菌亦會有尿素 酶，因此有假陽性可能。
0細菌培養法取胃粘膜活組織作HP培養，該法準確可靠，但培養費時。 。病理學檢測法胃粘膜組織切片染色檢查，以銀染色法最佳，檢測率高， 結果可靠。
目前，檢測幽門螺旋桿菌的方法繁多，但還沒有一種快速不需要任何i殳備且可區分弱毒林和強毒林的檢測方法的報道。如能建立該種方法，則能使檢測 過程中的樣品處理簡單，不需要專門儀器和人員培訓，非專業技術人員按照說 明書即可操作，并可迅速觀察結果，易于在中小型企業、基層普及與推廣應用 及現場快速檢測，并能區分弱毒林和強毒林，對于幽門螺旋桿菌的防治具有重 大的臨床意義。

發明內容
本發明的目的在于克服上述技術缺陷，提供一種幽門螺旋桿菌抗體的免疫 檢測試劑盒及其檢測方法。該方法筒單快速不需要任何設備，易于在中小型醫 院、基層普及與推廣應用，且可以區分弱毒抹和強毒株。
為實現本發明的目的，采用如下的技術方案
本發明的一種幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒，包括盒體、印跡膜、酶 標二抗、標準條帶卡、顯色底物、顯色劑、終止液、洗液、反應槽，其特征在
于，在印跡膜上有質控線和檢測線，并在檢測線上固定有幽門螺桿菌抗原。
所述印跡膜為具有蛋白吸附能力的膜載體。優選的，印跡膜為硝酸纖維素 膜或聚偏氟乙烯膜。
所述幽門螺桿菌抗原包括細胞毒素蛋白(CagA )、空泡細胞毒素蛋白(VacA) 和幽門螺旋桿菌尿素酶A單位蛋白和幽門螺旋桿菌尿素酶B單位蛋白。
通過檢測空泡細胞毒素蛋白(VacA)的抗體確定是弱毒抹還是強毒株感染。 檢測到空泡細胞毒素蛋白(VacA)的抗體就是強毒林感染，沒有檢測到空泡細 胞毒素蛋白(VacA)的抗體的就是弱毒林感染。
所述酶標二抗為酶標i己抗人IgG。
所述的標準條帶卡上標注了對應于所述印跡膜相應位置上的抗原和質控線 的蛋白及其分子量。
所述的顯色底物為過氧化氫或過氧化脲；顯色劑為四曱基聯苯胺或二氨基 聯苯胺。
所述的終止液為能夠使酶促反應終止的物質，強酸(硫酸、鹽酸)、強堿(氫氧化鈉、氫氧化鐘)、絡合劑(乙二胺四乙酸鈉)或表面活性劑(十二烷基磺酸 鈉)。
所述的洗液為磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液或者三羥基氨基曱烷-鹽酸緩 沖液。
印跡膜為整張或者整巻的膜，尺寸不定，經過轉印或者噴涂后干燥，經過 封閉處理，干燥后按所需規j格切成條狀。
標準條帶卡由電腦模擬制作，印跡線使用相應的設備噴涂而成或者經電泳 轉印而成。
反應槽為非天然材料的人工聚合材料制備而成，寬度和容量根據印跡膜條 的尺寸制定。
上述幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒的^r測方法是先將樣品用稀釋液稀 釋，稀釋后的樣品滴加在印記膜上，與印跡膜上相應的抗原結合形成"抗原-抗體" 復合物，經過洗液洗滌去除非特異性的抗體，加入酶標二抗，形成"抗原-抗體-酶標二抗"復合物，經過洗液洗滌去除未結合的酶標二抗，加入顯色底物和顯色 劑，反應后加入終止液，然后與標準條帶卡對比確定抗體的種類。
本發明的優點是利用該試劑盒檢測幽門螺桿菌筒單快速，不需要任何設 備，易于在中小型醫院、基層普及與推廣應用，且可以區分弱毒抹和強毒抹。


圖l是幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試紙的示意圖2是幽門螺桿菌抗體的免疫檢測的一個優選實施例的檢測結果圖。
具體實施例方式
為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應
實施例一幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒的制備 1.印跡膜的制備A噴涂法將細胞毒素蛋白(CagA)、空泡細胞毒素蛋白(VacA)、幽門 螺旋桿菌尿素酶A單位蛋白和幽門螺;5走桿菌尿素酶B單位蛋白使用劃膜緩沖液 稀釋至所需濃度，使用劃膜儀在特定的位置上將所需的蛋白劃上，固定后經過 封閉、干燥切條，加干燥劑密封保存。
B轉印法將所有的抗原經過含十二烷基磺酸鈉(SDS)、巰基乙醇的樣品 處理液稀釋后沸水煮沸至一定時間，上樣至電泳槽，經過濃縮膠的濃縮和分離 膠的分離成不同的條帶，電泳后的膠經過轉印技術轉印至印跡膜上，轉印后的 印跡膜經含1%牛血清白蛋白、5/萬疊氮鈉2。/。蔗糖的0.01M PH7.2 PBS溶 液封閉處理后干燥，干燥的印跡膜按需要的規^各切成膜條加干燥劑密封保存即 可。
如圖l所示，是幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試紙的直觀示意圖，由上到下， 膜上的蛋白條帶依次為細胞毒素蛋白(CagA)、空泡細胞毒素蛋白(VacA)、 幽門螺旋桿菌尿素酶A單位蛋白和幽門螺旋桿菌尿素酶B單位蛋白以及質控蛋 白。
2. 酶標二抗的制備
純化的人IgG經過弗氏佐劑乳化后形成油包水的乳化物，該乳化物經皮下 或皮內免疫哺乳動物，產生特異性的抗人IgG特異性抗體，經過親和純化后制 得純化的抗人IgG，純化的IgG經過化學反應與具有催化活性的酶形成偶聯物， 經過沉淀法純化去除沒有偶耳關的的酶，然后經過ConA-agrose 4B親和層析柱去 除沒有和酶結合的抗人IgG,即得純化的酶標抗人IgG二抗，加等量的中性甘油 -20匸凍存。
3. 標準條帶卡的制備
根據印跡膜上各個條帶的位置和質控條帶的位置及顏色深淺經過電腦模擬 顏色后打印而成，寬度長度與印跡膜條相同。
4. 過氧化脲-DAB顯色底物的制備
稱取0.3g過氧化脲溶于1000ml 0.005M PH4.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩 沖液中，充分溶解即制得過氧化脲底物，稱取0.3g 二氨基聯苯胺(DAB )干粉溶解于1000ml 0.005MPH2.8的三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液中，充分溶解即 制得DAB顯色劑。
5. 纟冬止液的制備
稱取5g EDTA 二鈉鹽溶解于1000ml水中即得終止液。
6. 洗液的制備
稱取28.65g十二水磷酸氫二鈉，3.12g磷酸二氫鈉，100g氯化鈉，lg硫 柳汞，20ml吐溫-20加水1 OOOml充分溶解即得濃縮洗液。
實施例二幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒的檢測方法
1. 洗液配制將整瓶濃縮洗液按照稀釋至一定體積；
2. 在含有印跡膜條的反應槽中加入稀釋好的洗液lml和待檢血清10ul;
3. 置搖床上室溫下(25。C左右)搖動至一段時間棄去槽內液體，加入洗液lml, 一分鐘后棄去槽內液體，如此反復4次，最后在吸水紙上拍干液體；
4. 在有膜條的反應槽內加入酶標二抗溶液l毫升置搖床上室溫下(25。C左右) 搖動至說明書規定的時間棄去槽內液體，加入洗液lml, —分鐘后棄去槽內液體， 如此反復4次，最后在吸水紙上拍干液體；
5. 分別加入顯色底物和顯色劑一定體積，搖床上搖動至質控帶和^r測區域有清 晰顯色時加入終止液然后再搖動兩分鐘；
6. 用自來水沖洗掉槽內液體，取出印跡膜條，置吸水紙上待吸干水后和標準條 帶卡進行比對判斷結果；
7. 將印跡膜上起始線與標準條帶起始線對齊，觀察陽性顯色條帶和對應的標準 帶位置比對即可判斷顯色區帶是幽門螺旋桿菌的何種抗體。
圖2是幽門螺桿菌抗體的免疫檢測的一個優選實施例的檢測結果圖，用該 試劑盒檢測空泡細胞毒素抗體陽性、尿素酶A抗體陽性和尿素酶B抗體陽性的 樣本，檢測結果如圖2,將該檢測結果條帶與標準卡比對，表明，該樣品為空泡 細胞毒素抗體陽性、尿素酶A抗體陽性、尿素酶B抗體陽性的樣本。實施例三幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒的特異性、敏感性、均一行、 穩定性檢測試驗
1. 特異性
取4每毒抗體、乙肝抗體、丙肝抗體、艾滋病抗體、類風濕因子、大腸桿菌 抗體、金黃色葡萄球菌抗體陽性的血清使用試劑盒進行檢測無交叉反應。
2. 每i:感性
經過與進口酶免試劑盒比對，該試劑盒達到酶免試劑盒同等水平。
3. 均一性
取同 一 陽性標本使用同 一批號試劑盒進行二十次檢測無肉眼可見的差異， 使用不同批號的試劑盒沖企測二十次也無肉眼可見的明顯差異。
4. 穩定性
試劑盒穩定性采用生物制品檢定所推薦的37 。C加速破壞試驗進行考核， 37。C加速破壞六天相當于4。C一年，經過加速破壞后與4。C保存的試劑盒比對無 肉眼可見差異，該試劑盒有效期暫定為一年。
最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本 發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而 不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
權利要求
1、一種幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒，包括盒體、印跡膜、酶標二抗、標準條帶卡、顯色底物、顯色劑、終止液、洗液、反應槽，其特征在于，在所述印跡膜上有質控線和檢測線，并在所述檢測線上固定有幽門螺桿菌抗原。
2、 根據權利要求l所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述印跡膜為具 有蛋白吸附能力的膜載體。
3、 根據權利要求2所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述印跡膜為硝 酸纖維素膜(NC)或聚偏氟乙烯膜(PVDF)。
4、 根據權利要求1所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述幽門螺桿菌 抗原包括細胞毒素蛋白CagA、空泡細胞毒素蛋白VacA、幽門螺旋桿菌尿素酶A 單位蛋白和幽門螺旋桿菌尿素酶B單位蛋白。
5、 根據權利要求1所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述酶標二抗為 酶標記抗人IgG。
6、 根據權利要求1所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的標準條帶 卡上標注了對應于所述印跡膜相應位置上的所述幽門螺桿菌抗原和所述質控線 上的蛋白及其分子量。
7、 根據權利要求1所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的顯色底物 為過氧化氫或過氧化脲；所述的顯色劑為四曱基聯苯胺或二氨基聯苯胺。
8、 根據權利要求1所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的終止液為 硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、氬氧化鉀、乙二胺四乙酸鈉或十二烷基磺酸鈉。
9、 根據權利要求1所述的免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述的洗液為磷 酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液或者三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。
10、 權利要求1所述的幽門螺桿菌抗體的免疫檢測試劑盒的檢測方法，其 特征在于，樣品稀釋后，將所述印跡膜浸泡在稀釋后的樣品中孵育，然后洗滌， 再加入所述的酶標二抗孵育，再次洗滌，加入所述的顯色底物和所述的顯色劑， 反應后加入所述的終止液，然后與所述的標準條帶卡對比確定抗體的種類。
全文摘要
本發明公開了一種幽門螺旋桿菌抗體的免疫檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包括盒體、印跡膜、酶標二抗、標準條帶卡、顯色底物、顯色劑、終止液、洗液、反應槽，在印跡膜上有質控線和檢測線，并在檢測線上固定有細胞毒素蛋白(CagA)、空泡細胞毒素蛋白(VacA)和幽門螺旋桿菌尿素酶A單位蛋白和幽門螺旋桿菌尿素酶B單位蛋白。檢測時，先將樣品與印跡膜上相應的抗原結合形成“抗原-抗體”復合物，洗滌后，加入酶標二抗，再洗滌，加入顯色底物和顯色劑，反應后加入終止液，然后與標準條帶卡對比確定抗體的種類。該方法簡單快速不需要任何設備，易于在中小型醫院、基層普及與推廣應用，且可以區分弱毒株和強毒株。
文檔編號G01N33/569GK101435821SQ20081022016
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月19日 優先權日2008年12月19日
發明者周炬華, 李紹旭 申請人:周炬華;李紹旭