一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測用試劑盒，特別是用于檢測鏈霉素的化學發光試劑盒。包括盒體、設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑，所述酶標板的各孔包被有包被抗原；所述試劑包括：鏈霉素單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體、鏈霉素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光液；酶標板選擇乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發光酶標板，酶標板的各孔包被有以鏈霉素與卵清蛋白偶聯制成的包被抗原。本發明的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準確的特點，與傳統的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數量綴，有望在動物性食品（動物組織、水產品）中的鏈霉素藥物殘留檢測中發揮重要作用。
【專利說明】一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測用試劑盒，特別是用于檢測鏈霉素的化學發光試劑盒。
【背景技術】[0002]隨著現代經濟的迅速發展，現代養殖業近年來也迅速發展，由此引起的抗生素的濫用導致的大量藥物殘留已經成為威脅人類健康的嚴重經濟社會問題。動物源性食品中抗菌素污染的問題已引起全世界廣泛關注，許多國家均對各種動物源性食品中的抗菌素殘留提出限量標準。我國農業部在2002年公告的《關于動物性食品中獸藥最高殘留限量的通知》中，規定了 92種動物性食品中獸藥最高殘留限量，其中鏈霉素(Tylosin)在雞、豬、牛的肌肉、脂肪、肝、腎組織中的最高殘留限量為200yg / kg。鏈霉素對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、類菌介質和某些病毒有抑制作用，尤其對禽敗血支原體、多殺性巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌極其有效。鏈霉素主要通過抑制細菌細胞內蛋白質的合成而發揮作用隨著其廣泛應用，在動物性食品中的殘留問題也日益突出。
[0003]因此殘留檢測方法是非常有必要的，很多國家已經為此而建立了一些藥物殘留的監測方法。包括傳統的儀器法，微生物檢測法和新興的酶聯免疫檢測法(ELISA)。傳統檢測藥物殘留的儀器分析方法包括HPLC、LC-UV, LC-Ms和LC-MS-MS等。這些方法優點是準確、穩定、特異性好，可以作為標準方法，但儀器設備昂貴，笨重，需要大量的溶劑，對操作人員要求很高，樣品前處理復雜、費時、費力、不易普及，不適合對大規模的樣品進行即時檢測。微生物檢測法雖然可以進行大量樣品的即時檢測，但是特異性差，不能進行準確的定性定量分析。酶聯免疫檢測法(ELISA)克服了以上方法的缺點，是一種快速、靈敏、方便的檢測方法，可以用于大量樣品的即時檢測，有著廣闊的發展前景。在酶聯免疫基礎上結合化學發光分析的酶聯免疫檢測法(CL一ELISA)，有著更高的靈敏度，更寬的線性范圍，更適合藥物殘留檢測。

【發明內容】

[0004]為了解決上述技術問題，本發明提供一種具備較高的靈敏度、特異性、而且具有較高的反應速度的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體、設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑，所述酶標板的各孔包被有以鏈霉素藥物與卵清蛋白偶聯制成的包被抗原；所述試劑包括:鏈霉素單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體、鏈霉素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光液；酶標板選擇乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發光酶標板，酶標板的各孔包被有以鏈霉素與卵清蛋白偶聯制成的包被抗原。
[0006]其中所述包被抗原濃度優選1.5ug/mL,所述鏈霉素系列標準溶液從鏈霉素純品中稀釋得到，所用稀釋液為含有10%甲醇的0.05mmol/L、pH-7.4的PBS，鏈霉素標準品濃度分別是 0ng/mL,0.2ng/mL,0.4ng/mL, 1.2ng/mL, 3.6ng/mL 和 10.8ng/mL,所述百分比為體積百分比。
[0007]所述鏈霉素單克隆抗體是由鏈霉素藥物與牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單克隆抗體，其鏈霉素單克隆抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的單克隆抗體，將所得鏈霉素單克隆抗體用洗滌溶液稀釋成1:60000的工作濃度。
[0008]所用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶一羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1:3000的工作濃度。
[0009]所述化學發光溶液包括A液和B液，其中，A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.0OlM PH-8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為IOOmL含2.1g檸檬酸、2.82g無水Na2HPO4和0.64mL濃度0.75%的過氧化氫脲的溶液。
[0010]所述濃縮磷酸鹽緩沖液由5.74g NaH2PO4.2H20 和 32.6g Na2HPO4.12H20 溶于 IL去離子水中制得。
[0011]所述濃縮洗滌液為按體積百分比在0.05%，pH為7.4，濃度為0.lmol/L的鹽緩沖液中添加0.05%的吐溫-20后制得。
[0012]所述的包被溶液為:1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于IL水中，并調節pH為
9.5后制得，所述的封閉溶液為:10g OVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量百分比為0.02%
的NaN3后制得。
[0013]所述酶標板采用將鏈霉素藥物-OVA偶聯物置于設定的包被溶液中，在37°C恒溫箱中反應包被，包被液采用的是pH-9.5的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液。
[0014]本發明中微孔板中所包被的鏈霉素藥物-OVA在堿性環境下可以很好的結合在微孔板塑料表面上，可以經受多次洗板，采用的包被抗原濃度為1.5ug/mL，包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優選0VA，需加入NaN3防止變質。
[0015]本發明申鏈霉素單克隆抗體溶液是決定本發明中鏈霉素酶聯免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。
[0016]本發明中涉及的鏈霉素單克隆抗體溶液可以用洗滌溶液稀釋成1:60000的工作濃度。
[0017]按照上述鏈霉素單克隆抗體溶液濃度制備的試劑盒可以達到很好的線性范圍。
[0018]本發明的原理是將抗體一抗原反應的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結合起來，利用酶催化底物的化學發光反應檢測產物濃度。
[0019]有益效果:本發明的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準確的特點，與傳統的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數量綴，有望在動物性食品(動物組織、水產品)中的鏈霉素藥物殘留檢測中發揮重要作用。
【具體實施方式】
[0020]一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體、設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑，所述酶標板的各孔包被有以鏈霉素藥物與卵清蛋白偶聯制成的包被抗原；所述試劑包括:鏈霉素單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體、鏈霉素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光液；酶標板選擇乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學發光酶標板，酶標板的各孔包被有以鏈霉素與卵清蛋白偶聯制成的包被抗原。
[0021]其中所述包被抗原濃度優選1.5ug/mL,所述鏈霉素系列標準溶液從鏈霉素純品中稀釋得到，所用稀釋液為含有10%甲醇的0.05mmol/L、pH-7.4的PBS，鏈霉素標準品濃度分別是 0ng/mL,0.2ng/mL,0.4ng/mL, 1.2ng/mL, 3.6ng/mL 和 10.8ng/mL,所述百分比為體積百分比。
[0022]所述鏈霉素單克隆抗體是由鏈霉素藥物與牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單克隆抗體，其鏈霉素單克隆抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的單克隆抗體，將所得鏈霉素單克隆抗體用洗滌溶液稀釋成1:60000的工作濃度。
[0023]所用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶一羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1:3000的工作濃度。
[0024]所述化學發光溶液包括:A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為
0.0OlM PH-8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為IOOmL溶液含檸檬酸2.1g,的無水Na2HP042.82g，0.75%的過氧化氫脲0.64mL的溶液，采用辣根過氧化酶標記底物發光系統，
主要是魯米諾一過氧化氫系統。
[0025]所述濃縮磷酸鹽緩沖液為5.74g的NaH2PO4.2H20、32.6g的Na2HPO4.12H20溶于IL去離子水中。
[0026]所述濃縮洗滌溶液為按體積分數0.05%將吐溫-20添加至pH-7.4，0.1mol/L鹽緩沖液中制成。
[0027]所述的包被溶液為:1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調節PH_9.5制得，所述的封閉溶液為:10g OVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量比為0.02%的NaN3。
[0028]本發明中包被酶標板采用將鏈霉素藥物-OVA偶聯物置于設定的包被溶液中，以設定的濃度，在37°C恒溫箱中反應包被，本發明包被液采用的是pH-9.5的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液。
[0029]本發明中微孔板中所包被的鏈霉素藥物-OVA在堿性環境下可以很好的結合在微孔板塑料表面上，可以經受多次洗板，采用的包被抗原濃度為1.5ug/mL，包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優選0VA，需加入NaN3防止變質。
[0030]本發明申鏈霉素單克隆抗體溶液是決定本發明中鏈霉素酶聯免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。
[0031]本發明中涉及的鏈霉素單克隆抗體溶液可以用洗滌溶液稀釋成1:60000的工作濃度。
[0032]檢測步驟:
1)加樣:向酶標板中加入50μ L/孔的鏈霉素系列標準濃度溶液或樣品溶液，然后加入鏈霉素抗體工作液50 μ L/孔，室溫(25°C )恒溫孵育2.5h;
2)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入280μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
3)加酶標二抗:每孔加入酶標二抗工作液IOOuL,室溫恒溫孵育1.5h ；
4)洗滌:傾出孔中液體，向酶標板中加入280μ L/孔的洗滌液，靜置5min后拍干，重復三次；
5)加發光液:每孔加入發光液IOOuL；
6)檢測:用化學發光免疫分析儀測定每孔的發光強度。
[0033]結果判斷: 以所測得的標準品發光值，除以第一個標準(O標準)的發光值再乘以100，得到抑制率(Β/Β0)，以抑制率為縱坐標，鏈霉素濃度的對數為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。
[0034]試劑盒具體組分的制備
I)鏈霉素半抗原
購自美國Sigma公司。
[0035]2)鏈霉素免疫原的制備
稱取40mg羰基二咪唑，用0.8ml丙酮充分溶解，加入25mg鏈霉素單克隆抗體37°C振蕩反應3h后，真空干燥過夜；加入Iml用0.2 mo I/LpH 8.0的硼酸緩沖液溶解的BSA IOmg,4°C振蕩3d ;用0.2mol/LPH8.0的硼酸緩沖液透析2 d，加入柳硫汞，置4°C保存；采用紫外掃描法進行鑒定，BSA在280 nm處應有一明顯吸收峰；而鏈霉素單體紫外掃描圖譜，在225nm處應有一明顯吸收峰；BSA—鏈霉素偶聯物經紫外掃描，若最大吸收峰發生藍移，可初步認定偶聯物結合成功。
[0036]3)單克隆抗體的制備
I動物免疫:用上述制備出的免疫原按IOOug/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6?8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復合物IOOug/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0037]2細胞融合:按常規方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，然后在45秒內緩慢加入預熱的融合劑(PEG4000)進行融合，用HAT培養基懸浮均勻，再加入適量的飼養細胞，培養于96孔培養板，于37°C，5% CO2培養箱中培養，5天后用HT培養基半換液，9天時候進行全換液。
[0038]3雜交瘤細胞的篩選:細胞融合后，待細胞長到培養孔面積的1/2時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預先用方陣法常規滴定其最佳包被濃度和陽性血清稀釋度)包被酶標板，加入被測孔培養上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，鄰苯二胺(OPD)進行顯色反應。篩選出的陽性孔再用間接競爭ELISA方法篩選，先將細胞上清與100 u g/mL的蘇丹紅等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標板中。同時用PBS取代蘇丹紅對照，其余步驟同上。若經蘇丹紅阻斷后的0D450nm值下降到對照孔的50%以下，則判為陽性，經2?3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進行亞克隆化。
[0039]4單克隆抗體制備:將2?3次亞克隆建株后的雜交瘤細胞擴大培養，收集上清液用間接ELISA測定效價，凍存；并取8?10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL/只，7?10日后腹腔注射雜交瘤細胞I?2X106/只，7?10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測定效價，并凍存備用。
[0040]實際樣品中鏈霉素的檢測
1、樣本前處理
(一)肌肉、肝臟等組織前處理方法
用均質器均質樣本；稱取3g均質后的組織樣本到50mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL乙酸乙酯，用振蕩器振蕩lOmin，3000g以上，室溫(20?25°C )離心IOmin ;移取4mL上層有機相至IOmL干凈的玻璃管中，于50?60°C水浴氮氣吹干，加入ImL正己烷，用渦旋儀渦動lmin，再加ImL復溶工作液，用渦旋儀渦動10S，3000g以上，室溫離心IOmin ;除去上層有機相，取下層5 OL用于檢測。
[0041](二)原奶處理方法
將原奶樣品回溫到室溫(25±2°C)后，上下顛倒20次以上，使其充分混勻；(注:切勿采用劇烈的方式混勻，否則將產生沉淀，影響結果)然后去50 u I上述混合后的樣品于2ml離心管中，再加入950ul樣品稀釋液，上下顛倒20次以上混勻，最后去50ul進行檢測。
[0042](三)蛋處理方法
取50uL均質后的全蛋品于離心管中，加入950uL去離子水，充分渦動10s，取50uL進行檢測。
【權利要求】
1.一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體、設在盒體內的酶標板和設在盒體內的試劑，其特征在于:所述酶標板的各孔包被有包被抗原；所述試劑包括:鏈霉素單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體、鏈霉素系列標準溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學發光液；所述酶標板為乳白色不透明的聚苯乙烯96孔化學發光酶標板，酶標板的各孔包被有以鏈霉素與卵清蛋白偶聯制成的包被抗原。
2.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述包被抗原以鏈霉素藥物與卵清蛋白偶聯制成，其濃度為1.5ug/mL,所述鏈霉素系列標準溶液從鏈霉素純品中稀釋得到，所用稀釋液為含有10%甲醇的0.05mmol/L、pH為7.4的 PBS,鏈霉素標準品濃度分別是 0ng/mL,0.2ng/mL,0.4ng/mL, 1.2ng/mL, 3.6ng/mL 和10.8ng/mL,所述百分比為體積百分比。
3.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述鏈霉素單克隆抗體是由鏈霉素藥物與牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單克隆抗體，其工作濃度為為1:60000。
4.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶一羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1:3000的工作濃度。
5.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述化學發光溶液包括A液和B液，其中，A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.0OlMPH-8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為IOOmL含2.1g檸檬酸、2.82g無水Na2HPO4和0.64mL濃度0.75%的過氧化氫脲的溶液。
6.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述濃縮磷酸鹽緩沖液由5.74g NaH2PO4.2H20和32.6g Na2HPO4.12H20溶于IL去離子水中制得。
7.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述濃縮洗滌液為按體積百分比在0.05%, pH為7.4，濃度為0.lmol/L的鹽緩沖液中添加0.05%的吐溫-20后制得。
8.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述的包被溶液為:1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于IL水中，并調節pH為9.5后制得，所述的封閉溶液為:10g OVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量百分比為0.02%的NaN3后制得。
9.如權利要求1所述的一種鏈霉素的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于:所述酶標板采用將鏈霉素藥物-OVA偶聯物置于設定的包被溶液中，在37°C恒溫箱中反應包被，包被液采用的是pH-9.5的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液。
【文檔編號】G01N33/577GK103645322SQ201310673607
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】王善普, 劉姍姍, 鄭鳴, 王宇東, 智雪玲 申請人:洛陽萊普生信息科技有限公司