檢測男性生育力的凝集素組合物及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測男性生育力的凝集素組合物，所述凝集素組合物包括如下凝集素中的兩種或多種：Jacalin、GHA、MPL、ACL、VVL和ABA。本發明還提供了一種檢測男性生育力的試劑盒，包括所述凝集素組合物和PBS洗滌液。本發明利用以上6種凝集素的結合與不同人精子樣本結合強度的差異，通過流式細胞儀、熒光顯微鏡、液態芯片等方法檢測熒光強弱來評價精子的質量，實現對男性生育力的評價，為男性不育分子機制的研究以及男性不育病因診斷提供理論依據。
【專利說明】檢測男性生育力的凝集素組合物及其試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種凝集素組合物及其試劑盒，具體地，涉及一種檢測男性生育力的凝集素組合物及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]在哺乳動物中，精子從睪丸中生成在穿過附睪過程中，其表面覆蓋上高密度的糖分子，從而形成20-60nm厚的糖萼，大部分的糖殘基附著在蛋白質上，這些糖蛋白有的整合在精子膜上，有的松散地連在精子表面。目前，有關人精子表面糖萼的結構圖譜未知，僅知道精子胞膜糖萼的結構與男性生育力密切相關。在食蟹猴中，高度糖基化的β -defensinl26 (DEFB126)從附睪體部分泌并覆蓋在整個精子表面，是精子糖萼的主要糖蛋白成分，在精子穿過宮頸黏液，逃避女性生殖道的免疫監視以及免疫反應，介導精子與輸卵管上皮細胞的結合等方面起重要的作用。在人類中，約有20%的男性，其DEFB126基因編碼區發生兩個核苷酸缺失的移碼突變，并且發生純合突變(del/del)的男性其自然生育力顯著降低。
[0003]目前，研究細胞表面糖結構的技術手段不多，主要是利用凝集素與寡糖的特異性結合的流式細胞儀技術(flow cytometry, FCM)和突光顯微鏡的技術。其中，花生凝集素(PNA)和豌豆凝集素(PSA)可以特異性識別精子的頂體糖蛋白，而用于檢測精子的頂體反應能力。但目前沒有用凝集素芯片方法對人精子表面糖結構圖譜做全面的分析，以及通過凝集素芯片篩選不同生育力男性精子表面的差異結合凝集素，從而獲得一種可用于男性生育力篩查的凝集素組合物及其試劑盒，目前現有技術中沒有該同類產品。

【發明內容】

[0004]本發明解決的問題在于提供一種與人精子表面糖結構特異性結合的凝集素組合物，利用不同生育力男性精子細胞與此凝集素組合的結合強度不同，評價男性的生育力，為男性不育分子機制的研究以及男性不育病因診斷提供理論依據。本發明還提供了一種主要組成成分為上述凝集素組合、用于篩查男性生育力的試劑盒。
[0005]本發明通過以下技術方案實現:
[0006]一種檢測男性生育力的凝集素組合物，包括如下凝集素中的兩種或多種:Jacalin、GHA、MPL、ACL、VVL 和 ΑΒΑ。優選的，所述 Jacalin、GHA, MPL、ACL、VVL 和 ABA 標記有熒光材料。更優選的，所述熒光材料為FITC、AIeXaFluor488或熒光納米微球。
[0007]—種檢測男性生育力的試劑盒，包括上述凝集素組合物和PBS洗滌液。
[0008]在本發明中，Jacalin指木菠蘿全緣石楠凝集素，(Artocarpus integrifolia,AIA), GHA 指棉花凝集素(Gossypium hirsutum agglutinin), ACL 指尾穗覓凝集素(Amaranthus caudatus lectin), MPL 指澄桑凝集素(Maclura pomifera lectin), VVL 指蠶豆凝集素(Vicia villosa lectin)和ABA指雙孢子蘑燕凝集素(Agaricus bisporus)。
[0009]與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:由于DEFB126基因缺陷會導致男性生育力下降，而在本發明中用凝集素芯片篩選出6種凝集素，與DEFB126突變型的精子結合下降。用FITC標記(或其它突光標記探針,如AIexaFluor488)的這6種凝集素與待檢測精子樣本孵育結合，經流式細胞儀、液態芯片或熒光顯微鏡檢測樣品的熒光強度，從而判定男性的生育力。本發明通過將這些凝集素組合作為男性生育力低下的篩查方法應用于臨床，能夠評價精液中精子表面糖結構指紋圖譜的變化，為男性不育分子機制的研究以及男性不育病因診斷提供理論依據。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0011]圖1為與人精子有特異結合的凝集素結果圖；
[0012]圖2為根據DEFB126雙堿基缺失突變分類的不同基因型的男性精子與凝集素結合的差異圖；
[0013]圖3為用于評估男性生育力的凝集素熒光信號結果圖。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。
[0015]為了便于研究因糖萼變化導致不育男性的精子表面糖結構的變化，本發明用精子表面糖蛋白主要組成之一-β-防御素126蛋白(DEFB126)，以DEFB126表達缺陷型作為病例組，分析因糖蛋白變化導致糖鏈圖譜的變化，尋找可以作為男性不育檢測指標的糖結構圖譜的變化規律。下面結合具體的凝集素芯片的檢測對本發明做進一步的詳細說明。
[0016]實施例1、人精子的采集和熒光標記
[0017]步驟(1)精液樣本的分組
[0018]抽提男性全血或精子中的基因組DNA，按如下引物序列，及熒光定量PCR條件，對DEFB126基因編碼區的rsl40685149位點進行基因分型，將精液樣本分為野生型組，雜合型組和純突變組，在2支qPCR管中分別用2W/W、2D/D引物擴增，擴增完成后，分析數據；qPCR反應體系的具體配方如表1所示，qPCR擴增程序如表2所示:
[0019]2ff/ff_169bp的正向引物:如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
[0020]2ff/ff_169bp的反向引物:如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0021]2D/D_295bp的正向引物:如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0022]2D/D_295bp的反向引物:如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
[0023]表1
【權利要求】
1.一種檢測男性生育力的凝集素組合物，其特征在于，包括如下凝集素中的兩種或多種:Jacalin、GHA、MPL、ACL、WL 和 ΑΒΑ。
2.根據權利要求1所述的凝集素組合物，其特征在于，所述Jacalin、GHA、MPL、ACL、WL和ABA標記有熒光材料。
3.根據權利要求2所述的凝集素組合物，其特征在于，所述熒光材料為FITC、AIexaFluor488或熒光納米微球。
4.一種檢測男性生育力的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1、2或3所述凝集素組合物、PBS洗滌液。
【文檔編號】G01N21/64GK103472044SQ201310415501
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】施惠娟, 陶生策, 辛愛潔, 周樹敏, 程莉, 刁華, 施長根, 袁瑤, 吳斌, 顧一驊, 于合國, 王鵬 申請人:上海市計劃生育科學研究所, 上海交通大學