粒細胞髓過氧化物酶檢測芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及利用芯片測定粒細胞髓過氧化物酶的芯片。體現在本發明設計了分離粒細胞芯片，同時含有細胞酶反應結構，能夠分別測定粒細胞內髓過氧化物酶活性。
技術背景
[0002]細胞芯片是以細胞作為研究對象的一種生物芯片技術，它是為適應基因、分子時代對于探索生命科學需求而產生的新興技術。細胞芯片即保持傳統研究細胞方法的優點，又滿足了高通量、大樣本及快速獲取細胞信息等特點。可用于研究特定基因及表達蛋白質與疾病之間的相互關系，對于疾病珍斷、藥物治療靶點篩選、細胞定位、抗體藥物篩選等方面有廣泛的應用價值。
[0003]粒細胞可以表達髓過氧化物酶，表達髓過氧化物酶與粒細胞的氧化代謝有關。測定髓過氧化物酶的方法有底物顯色法、抗髓過氧化物酶抗體免疫標記法和髓過氧化物酶染色法，而這些方法只能夠測定整體總量或者對于細胞的髓過氧化物酶進行定位，不能夠同時分別測定粒細胞內表達髓過氧化物酶的活性。由于血液中存在10余種細胞，而骨髓中存在60余種類型細胞，能夠測定不同類型細胞髓過氧化物酶具有臨床意義。
[0004]2002年7月17日公開，授予樓屹的《快速檢測腎臟損害的尿蛋白芯片》專利號CN1359004A，公布了一種快速檢測腎臟損害的尿蛋白芯片的測定方法，它由載體盒面板、載體盒背板和蛋白質試紙條組成，所述的面板下端為進樣口、中部為觀察口以及進樣口和觀察口之間的控樣線，所述載體盒背板內有扇形排列的四個載體槽，載體槽內分別放置檢測白蛋白(ALB)、轉鐵蛋白(TF)、視黃醇結合蛋白(RBP)和尿NAG的尿蛋白試紙條，利用芯片技術集成化、高通量、并行的原理，將這些蛋白試紙條以平行或扇形方式任意組合，集成在一起，形成尿蛋白芯片，他能夠一次性同時檢測尿液中這四種蛋白。由于判定結果敏感度有限，本法測定結果只能夠達到半定量。
[0005]在2013年4月24日公開的黃曉波等發明專利《一種細胞微陣列芯片及其制備方法》，公開專利號CN103060175A，本專利公開了一種細胞微陣列芯片及其制備方法屬于細胞芯片技術領域。其特征是由海藻酸凝膠制備的海藻酸凝膠細胞微陣列芯片，操作簡便，可用于細胞組織化培養、化合物或藥物的高通量篩選、新基因的發現、以及蛋白質組學研究等。制備方法是:(I)在玻璃板上涂敷一層海藻酸鈉溶液，快速浸入氯化鈣溶液中，浸泡5?30分鐘形成凝膠模板。(2)制備一個上面排布有多個圓柱體的點陣模板，將圓柱體頂端浸泡在殼聚糖或聚賴氨酸溶液中5?30分鐘后取出。(3)將圓柱體頂端壓印在海藻酸凝膠模板上，通過靜電絡合反應形成絡合物點陣模板。(4)將絡合物點陣模板浸泡在細胞濃度為I X 15?I X 11ZL的培養液中培養4?16小時，形成海藻酸凝膠細胞微陣列芯片。
[0006]本發明的目的在于提供了一種粒細胞髓過氧化物酶檢測微流控芯片及其測定試齊U，可有效的克服以前芯片能夠測定細胞生物性過程中不能夠有效測定特定細胞類型表達生物信息的缺點。

【發明內容】

[0007]本發明解決的技術問題是克服了在利用芯片技術測定粒細胞髓過氧化物酶過程中由于體液中，細胞類型復雜難以準確測定粒細胞表達髓過氧化物酶活性。發明提出解決上述技術問題采用的技術方案是:本發明的配套試劑包括A:微流控溶液，lOOmmol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)。B:細胞懸液。C:髓過氧化物酶測定緩沖液包括:0.05mmol/L聯苯胺溶液:10%雙氧水溶液=10mmoI/L pH7.4PBS，三者間比例為I:1:5。
[0008]本發明試劑能夠有利于與粒細胞髓過氧化物酶作用。上述試劑類型限定為三種，另外限定試劑輸入的比例，測定過程中，A、B、C三種測定溶液輸入微流控芯片需要保持一定比例，其比例為A:B:C = 5:1:0.1的比例進行輸入。整體試劑輸入速度為500ul/min。
[0009]正常人血液中白細胞的數量在4.0 — 10.0X109/L,當感染或白血病時可以達到20.0-100.0X 19個/L以上，而在胸腔積液、腹腔積液中粒細胞的數量明顯減少，一般在1.0-4.0X 14個/L。在白細胞中存在嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞。在尿液中細胞更加復雜，包括粒細胞、鱗狀上皮細胞、立方上皮細胞等多種細胞。
[0010]粒細胞髓過氧化物酶檢測芯片部分包括芯片上蓋、框架、底座和細胞分離支柱。芯片框架為塑料材料制成框架結構，芯片底板為玻璃、高分子聚合材料、纖維素膜及石英玻片。
[0011]在底板上附框架和框架支架，材料為高分子聚合材料成分，框架(2)高度為1mm，附著框架支架高度也為1mm。上述的兩框架的厚度相同，但是底座與上蓋之間存在由支架組成的細胞分離通道，其之間的間距分別為:a = 9nm ；b = 15nm ；c = 20nm,和細胞收集通道
(15)、(16)、(17)，分離柱排列與底邊形成一定角度，有利于流體力學作用細胞進行分類，輸出通道內部空間可為圓形、橢圓形和方形，口徑可不同。
[0012]在芯片上蓋和底座之間的支架框架(2)和框架(3)，利用粘合劑將芯片粘合在上述兩框架之間粘合，同時保障芯片支架的結構，包括7個分離支柱，排列與底座之間形成10-35度斜角，各個支柱之間保持特定距離。
[0013]芯片支架(3)連接三個微流體輸入通道分別為流體輸入通道、細胞懸液輸入通道、髓過氧化物酶試劑通道；流體輸出通道和三個細胞收集通道，在分離柱排列通向收集細胞流出側面，芯片內收集液儲存空間為倒梯形、倒三角型空間，有利于細胞進行流出。
[0014]本芯片法測定粒細胞髓過氧化物酶的方法，實現單個細胞測定粒細胞中表達髓過氧化物酶活性，填補測定粒細胞酶活性的空白，其敏感度可以測定lOIU/cell以上。整個測定過程在I小時內完成，方法簡便、快速、穩定。
【附圖說明】
本說明書包括五幅附圖圖1芯片整體結構主視圖圖2芯片表蓋透視示意圖圖3芯片支架透視示意圖圖4芯片框架外托透視示意圖圖5芯片底座透視不意圖
【具體實施方式】
[0015]參見附圖1-5，本發明的粒細胞髓過氧化物酶檢測芯片主要由(I)、(2)、(3)和
(18)構成，配有三個微流控液體輸入通道(4)、(5)和￠)，三個細胞收集通道(15)、(16)和
(17)，一個微流控流體輸出通道(7)。芯片可采用有機材料，玻璃及石英材料等。下面以具體實實例進一步解釋發明，但不限制本發明范圍，本發明提供的一種粒細胞髓過氧化物酶檢測芯片和配套試劑。
[0016]芯片部分包括芯片上蓋(I)、芯片框架(2、3)，在框架上分別連接三個微流控流通輸入通道，三個細胞收集通道和一個流體輸出通道、底板(18)三部分。其中所述粒細胞髓過氧化物酶檢測芯片的框架為塑料框架(2、3)，所述的流體輸入和輸出通道為圓管形、方形通道。細胞收集通道為圓管形、方形管通道。流體輸入通道三個，而輸出為一個通道，總輸入流通口徑與輸出口徑總面積比例為1:1_10。框架中分離柱含有七個，各個支柱之間為圓形、橢圓形、方形，實用空間數量為六個，每個柱之間具有一定距離，a = 9nm ；b = 15nm ；c =20nm，柱的高度為1mm。柱之間排列呈現10-35度斜角。細胞收集空間可以為倒梯形、倒三角形。
[0017]本發明具體制備方法如下:
I芯片的制備
采用透光高分子有機材料，如聚苯乙烯等制備基片(I)，在其上采用微加工制備不規則形、方形或長方形的反應槽，按照設計要求設計輸入、輸出微流控通道的大小、形狀，同時規劃分離柱排列角度具有10-35度斜角。
2細胞芯片制備
將體液細胞制備一定含量的細胞懸液，例如血液與PBS的比例為1:1000-2000，按照輸入速度為500 μ Ι/min的速度進入細胞芯片。在輸入過程中，流體:細胞懸液:髓過氧化物酶試劑的比例為5:1:0.1的比例進行輸入。細胞收集
[0018]實例，2009年5月27日授予穆海東的名稱為《一種男性多腫瘤標志物檢測蛋白芯片的制備》公告號:CN201247246Y。2006年10月4日授予李澤松等的名稱為《肝纖維化相關血清標志物檢測蛋白芯片》公開號:CN1841068A。詳細的披露了一些抗原測定蛋白芯片的制備過程。
I其步驟主要是:
(1)準備硝基纖維素膜；
(2)設計芯片，確定點陣排列方式和點樣位置；
(3)點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝基纖維素膜上；
(4)裝配硝基纖維素膜，并且進行封閉、干燥、包裝、保存。
2測定具體制備步驟
(1)檢測指標抗原的確定
腫瘤標志物CEA是由六段相似很高的肽段組合而成，選擇其中A1+B1段基因工程表達；PSA、NSE, SCC-ag和CYFRA21-1均為長基因表達，FAP和CA19-9為腫瘤細胞分泌抗原。制備單克隆抗體。
(2)點樣制備具檢測指標涂層的膜芯片用Gesim點樣儀噴點，點樣整從384孔板吸出抗體噴點于纖維素膜上，點陣形式為10X5矩形陣列，當點直徑為0.1mm,點橫向間距為0.6mm,抗體陣列的大小為6mmXmm ;點樣后貼膜，封閉，最后將芯片干燥、包裝后于4°C保存。
【主權項】
1.所述測定粒細胞髓過氧化物酶檢測芯片，其特征在于配套試劑和芯片框架之間的粒細胞分離柱的高度和柱之間的間距。
2.根據權利要求(I)所述的粒細胞髓過氧化檢測芯片，其特征在于所述的芯片結構、框架(2)的分離支柱的結構和間距，含有三個微流控液體進樣通道(及以上)，一個液體輸出通道和三個細胞收集通道(及以上)。
【專利摘要】本發明涉及微流控細胞芯片的技術領域，公布了一種測定粒細胞表達髓過氧化物酶的芯片和測定試劑。細胞通過芯片結構和微流控流體使細胞分離并與特殊酶反應試劑作用，實現測定粒細胞內髓過氧化物酶活性。該配套試劑為一種化學混合溶液含有聯苯胺濃度為100mmol／L，雙氧水濃度為10％；芯片包括芯片底板、芯片框架和框架中細胞篩選支柱。夾在芯片蓋與底座之間支柱的間距和位置，支柱厚度為1mm，間距為a=9nm；b=15nm；c=20nm。在芯片框架側面分別連接微流控液體進入通道三個分別為流通進入通道、細胞進入通道和過氧化物酶試劑進入通道。流體流出通道。細胞收集通道，可收集小細胞、中細胞和大細胞。
【IPC分類】G01N33-573
【公開號】CN104569393
【申請號】CN201310521378
【發明人】孫續國, 孫朝, 蘭杰
【申請人】天津祿浩科技有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月28日