專利名稱：參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜建立方法和質量控制方法
技術領域：
本發明涉及中藥指紋圖譜建立方法和質量控制方法技術領域，具體地說，本發明是一種參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜建立方法和質量控制方法。
背景技術：
中藥復方成分復雜，傳統的以單一成分作為指標進行質量控制手段越來越不能適應目前中藥質量控制的要求。在中藥現代化過程中，具有整體性和模糊性兩個基本特性的中藥指紋圖譜已成為現階段可較為全面反映中藥內在質量的有效手段。參芎葡萄糖注射液由丹參和鹽酸川芎嗪配伍組成，具有抗血小板聚集，擴張冠狀動脈作用，臨床用于閉塞性腦血管病及其它缺血性血管疾病的治療。參芎葡萄糖注射液現行質量標準(WS-10001-(HD-1136)-2002)的含量測定項目只對丹參素和鹽酸川芎嗪進行定量控制，難以全面反映制劑的化學成分特征。隨著我國藥品生產質量控制水平的提高和對注射劑安全、療效、質量可控等問題重視程度的不斷深入，國家食品藥品監督管理局相繼提出了“國家藥品標準提高行動計劃”和“中藥注射劑安全性再評價工作”，以全面提升藥品質量控制水平。因此，建立一種參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜質量控制方法，能更好地保證制劑批次間的質量均一性和穩定性，為參芎葡萄糖注射液的質量控制與綜合評價提供科學的參考依據。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，通過該方法建立參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜。本發明的目的之二在于提供上述參芎葡萄糖注射液原料的質量控制方法。本發明的目的之三在于提供一種參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法，通過該方法建立參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜。本發明的目的之四在于提供上述參芎葡萄糖注射液中間體的質量控制方法。本發明的目的之五在于提供一種參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜的建立方法，通過該方法建立參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜。本發明的目的之六在于提供上述參芎葡萄糖注射液制劑的質量控制方法。作為本發明第一方面的參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，由以下步驟組成I、對照品溶液的制備精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img · mL-1的對照品溶液；2、供試品溶液的制備取丹參藥材用水、甲醇或乙醇中的至少一種溶劑提出，定容得丹參藥材供試品溶液；3、供試品溶液的測定吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，得到丹參藥材的指紋圖譜；指紋圖譜檢測的色譜條件為:十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長為200 300nm ;柱溫為35°C 55°C ;進樣量為5 15 μ L ;流速為0.5 1.0mL.mirT1 ；4、對照指紋圖譜的建立:通過對10批次以上丹參藥材的指紋圖譜進行測定，確定其共有指紋特征峰，并經中藥指紋圖譜相似度評價軟件擬合建立丹參藥材對照指紋圖譜。在上述參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟2供試品溶液的制備過程具體如下:取過40目篩丹參藥材粉末0.5g，精密稱定，精密加入水25ml，稱定重量，加熱回流提取2h，放冷再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參藥材供試品溶液。在上述參芎葡萄糖 注射液原料的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟3供試品溶液的測定中,所述測定具體為=DiamonsilC18色譜柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m)；流動相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脫，O 7min, A2% 4% ；7 12min,A4% 18% ;12 15min,A18% 20% ；15 22min,A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱溫 4(TC，檢測波長230nm，進樣量10 μ L ;記錄60min色譜圖，即得到所需的丹參藥材指紋圖譜。在上述參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟3供試品溶液的測定中，在丹參藥材指紋圖譜中，以第15號峰丹酚酸B的峰面積最大，以丹酚酸B的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間:第I號共有峰的相對保留時間為0.097±0.0Olmin ’第2號共有峰的相對保留時間為0.111±0.0Olmin ；第3號共有峰的相對保留時間為0.123±0.0Olmin ;第4號共有峰的相對保留時間為0.198±0.002min ’第5號共有峰的相對保留時間為0.234±0.002min ’第6號共有峰的相對保留時間為0.271±0.003min ’第7號共有峰的相對保留時間為0.472±0.005min ；第8號共有峰的相對保留時間為0.491±0.005min ;第9號共有峰的相對保留時間為0.662±0.007min ;第10號共有峰的相對保留時間為0.687±0.007min ’第11號共有峰的相對保留時間為0.788±0.008min ;第12號共有峰的相對保留時間為0.813±0.008min ；第13號共有峰的相對保留時間為0.877±0.009min;第14號共有峰的相對保留時間為0.914±0.009min ;第15號共有峰的相對保留時間為Imin ’第16號共有峰的相對保留時間為1.047±0.0lmin ;第16號共有峰的相對保留時間為1.076±0.0lmin0在上述參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，在丹參藥材指紋圖譜中確定了 17個特征峰，其中峰5、7、13、
14、15、17分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在上述參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”對所得數據和圖譜進行處理即得到對照指紋圖譜。作為本發明第二方面的參芎葡萄糖注射液原料的質量控制方法，是將丹參藥材的指紋圖譜與丹參藥材對照指紋圖譜比較；經中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度應不得小于0.90。作為本發明第三方面的參芎葡萄糖注射液的中間體指紋圖譜的建立方法，由以下步驟組成:
I、對照品溶液的制備精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img · mL-1的對照品溶液；2、取丹參半成品，用水、甲醇或乙醇中的至少一種溶劑提取，定容，得供試品溶液；3、供試品溶液的測定吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，得到丹參半成品的指紋圖譜；指紋圖譜檢測的色譜條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長為200 300nm ;柱溫為35°C 55°C ;進樣量為5 15 μ L ;流速為O. 5 I. OmL · mirT1 ；4、對照指紋圖譜的建立通過對10批次以上丹參半成品的指紋圖譜測定，確定其共有指紋特征峰，并經中藥指紋圖譜相似度評價軟件擬合建立丹參半成品對照指紋圖譜。在上述參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟2供試品溶液的制備過程具體如下取丹參半成品O. 15g，精密稱定，加水溶解稀釋，定容至50mL，搖勻，上清液用O. 45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參半成品供試品溶液。在上述參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟3供試品溶液的測定中，所述測定具體為DiamonsilC18色譜柱(4. 6mmX250mm,5μ m);流動相乙腈(A) -O. 05%磷酸(B)，流速ImL · min—1，梯度洗脫，O 7min，A2% 4% ；7 12min, A4% 18% ；12 15min, A18% 20% ;15 22min, A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱溫40°C，檢測波長230nm，進樣量10 μ L ;記錄60min色譜圖，即得到所需的丹參半成品指紋圖
-i'TfeP曰。

在上述參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟3供試品溶液的測定中，在丹參半成品指紋圖譜中，以4號峰丹參素的峰面積最大，以丹參素的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間第I號共有峰的相對保留時間為O. 371 ±0. 003min ;第2號共有峰的相對保留時間為O. 423±0. 004min ;第3號共有峰的相對保留時間為O. 455±0. 004min ;第4號共有峰的相對保留時間為O. 754±0. 007min ;第5號共有峰的相對保留時間為Imin ’第6號共有峰的相對保留時間為I. 340±0. 013min ；第7號共有峰的相對保留時間為I. 509±0. 015min ’第8號共有峰的相對保留時間為
I.759±0. 017min ’第9號共有峰的相對保留時間為2. 462±0. 025min ;第10號共有峰的相對保留時間為2. 583±0. 026min ’第11號共有峰的相對保留時間為3. 033±0. 030min ；第12號共有峰的相對保留時間為3. 268±0. 033min;第13號共有峰的相對保留時間為
3.404±0. 034min ;第14號共有峰的相對保留時間為3. 732±0· 037min ;第15號共有峰的相對保留時間為3. 791 ±0. 038min ;第16號共有峰的相對保留時間為4. 010±0. 040min。在上述參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，在丹參半成品指紋圖譜中確定了 16個特征峰，其中峰5、
7、11、13、15、16分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在上述參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”對所得數據和圖譜進行處理即得到對照指紋圖譜。
作為本發明第四方面的參芎葡萄糖注射液的中間體質量控制方法，是將丹參半成品的指紋圖譜與丹參半成品的對照指紋圖譜比較，經中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度應不得小于0.90。作為本發明第五方面的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，由以下步驟組成:1、對照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img ^mL-1的對照品溶液；2、供試品溶液的制備:取參芎葡萄糖注射液制劑，用水、甲醇或乙醇中的至少一種溶劑提取，定容，得供試品溶液；3、供試品溶液的測定:吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，得到參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜；指紋圖譜檢測的色譜條件為:十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長為200 300nm ；柱溫為35°C 55°C ;進樣量為5 15 μ L ;流速為0.5 1.0mL.mirT1 ；

4、對照指紋圖譜的建立:通過對10批次以上參芎葡萄糖注射液原料或其中間體，或其制劑的測定，確定其共有指紋特征峰，并經中藥指紋圖譜相似度評價軟件擬合建立其對照指紋圖譜。在本發明參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法的一個優選實施例中，所述步驟2供試品溶液的制備為取過40目篩丹參藥材粉末0.5g，精密稱定，精密加入水25ml，稱定重量，加熱回流提取2h，放冷再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參藥材供試品溶液；取丹參半成品0.15g，精密稱定，加水溶解稀釋，定容至50mL，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參半成品供試品溶液；精密量取參芎葡萄糖注射液制劑10mL，加水稀釋，定容至25mL，搖勻，即得參芎葡萄糖注射液供試品溶液。在上述參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟3供試品溶液的測定中，所述測定具體為DiamonsilC18色譜柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m)；流動相乙腈(A)-0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脫，O 7min, A2% 4% ；7 12min,A4% 18% ;12 15min,A18% 20% ；15 22min,A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱溫 4(TC，檢測波長230nm，進樣量10 μ L ;記錄60min色譜圖，即得到所需的丹參半成品指紋圖譜。在上述參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟3供試品溶液的測定，在丹參藥材指紋圖譜中，以15號峰丹酚酸B的峰面積最大，以丹酚酸B的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間:第I共有峰的相對保留時間為0.097±0.0Olmin ’第2共有峰的相對保留時間為0.111±0.0Olmin ;第3共有峰的相對保留時間為0.123±0.0Olmin ;第4共有峰的相對保留時間為0.198±0.002min ；第5共有峰的相對保留時間為0.234±0.002min ;第6共有峰的相對保留時間為0.271 ±0.003min ;第7共有峰的相對保留時間為0.472±0.005min ;第8共有峰的相對保留時間為0.491±0.005min ;第9共有峰的相對保留時間為0.662±0.007min ;第10共有峰的相對保留時間為0.687±0.007min ;第11共有峰的相對保留時間為0.788±0.008min ；第12共有峰的相對保留時間為0.813±0.0OSmin;第13共有峰的相對保留時間為O. 877±0. 009min ’第14共有峰的相對保留時間為O. 914±0· 009min ;第15共有峰的相對保留時間為Imin ;第16共有峰的相對保留時間為I. 047±0. Ol ;第17共有峰的相對保留時間為 I. 076±0· Olmin ；在丹參半成品指紋圖譜中，以4號峰丹參素的峰面積最大，以丹參素的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間為第I共有峰的相對保留時間為O. 371±0. 003min ；第2共有峰的相對保留時間為O. 423±0. 004min ;第3共有峰的相對保留時間為
O.455±0. 004min ;第4共有峰的相對保留時間為O. 754±0. 007min ;第5共有峰的相對保留時間為Imin ;第6共有峰的相對保留時間為I. 340±0. 013min ;第7共有峰的相對保留時間為I. 509±0. 015min ’第8共有峰的相對保留時間為I. 759±0. 017min ;第9共有峰的相對保留時間為2. 462±O. 025min ;第10共有峰的相對保留時間為2. 583±O. 026min ；第11共有峰的相對保留時間為3. 033±0. 030min ;第12共有峰的相對保留時間為3. 268±0. 033min ;第13共有峰的相對保留時間為3. 404±0. 034min ;第14共有峰的相對保留時間為3. 732±0· 037min ’第15共有峰的相對保留時間為3. 791±0. 038min ’第16共有峰的相對保留時間為4. 010±0. 040min ;在參芎葡萄糖注射液指紋圖譜中，以5號峰鹽酸川芎嗪的峰面積最大，以鹽酸川芎嗪的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間為第I共有峰的相對保留時間為O. 302±0. 003min ;第2共有峰的相對保留時間為O. 347±0. 003min ’第3共有峰的相對保留時間為O. 618±0. 006min ;第4共有峰的相對保留時間為O. 822±0. OOSmin ;第5共有峰的相對保留時間為Imin ;第6共有峰的相對保留時間為I. 233±0. 012min ;第7共有峰的相對保留時間為2. 375±0. 023min ’第8共有峰的相對保留時間為2. 658±0. 026min ’第9共有峰的相對保留時間為3. 034±0. 030min ;第9共有峰的相對保留時間為3. 254±0. 032min。在上述參芎葡萄糖注 射液制劑的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟4對照指紋圖譜的建立，在丹參藥材指紋圖譜中確定了 17個特征峰，其中峰5、7、13、
14、15、17分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在丹參半成品指紋圖譜中確定了 16個特征峰，其中峰5、7、11、13、15、16分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在參芎葡萄糖注射液指紋圖譜中確定了 10個特征峰，其中峰4、5、6、7、8、9、10分別依次為丹參素、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在上述參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜的建立方法的一個優選實施例中，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”對所得數據和圖譜進行處理即得到對照指紋圖譜。作為本發明第六方面的參芎葡萄糖注射液制劑的質量控制方法，是將參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜與參芎葡萄糖注射液制劑對照指紋圖譜比較；經中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度應不得小于O. 90 ;將參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜進行比對，制劑指紋圖譜中各特征峰均須在原料和中間體指紋圖譜中得到追蹤，不得有色譜峰缺失。本發明針對現行參彎葡萄糖注射液質量標準的不足,首次提出對參彎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜進行測定，提供一種簡單、可靠、重復性好，可全面控制參芎葡萄糖注射液內在質量的中藥指紋圖譜測定方法。
本發明可實現在同一色譜條件下對參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜進行檢測，通過相關性研究說明指紋圖譜各特征峰的來源和歸屬，能用于參芎葡萄糖注射液產品質量控制和工藝條件控制，確保制備工藝的穩定性，更好地保證產品批次間的質量均一性和穩定性，提升制劑的質量控制水平。


圖1為混合對照品溶液圖譜。圖2為丹參藥材對照指紋圖譜。圖3為18批丹參藥材指紋圖譜相似度評價圖。圖4為丹參半成品對照指紋圖譜。圖5為13批丹參半成品指紋圖譜相似度評價圖。圖6為參芎葡萄糖注射液對照指紋圖譜。圖7為18批參芎葡萄糖注射液指紋圖譜相似度評價圖。圖8為原料(A)和中間體(B)指紋圖譜對比圖。圖9為中間體(A)和制劑(B)指紋圖譜對比圖。
具體實施例方式本發明所述的參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜質量控制方法是經過大量的篩選試驗得到的最佳方案，以下實驗研究為本發明的優選過程:一、色譜條件與系統適用性試驗1、儀器與試藥超快速液相色譜系統(UFLC，島津，包括二元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Lcsolution工作站)；AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);超純水機(四川沃特爾科技發展有限公司)。乙腈(德國MERCK公司)為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。丹參素鈉(批號8)，鹽酸川芎嗪(批號)，原兒茶醛(批號)對照品購于中國藥品生物制品檢定所；迷迭香酸(批號MUST-10120901 )，丹酚酸B (批號MUST-11031401 )，丹酚酸A (批號MUST-10012901)對照品購于北京恒元啟天化工技術研究院；丹參藥材采于四川省中江丹參藥材種植基地，由貴陽醫學院藥學院藥用植物與生藥學教研室龍慶德副教授鑒定；丹參半成品和參芎葡萄糖注射液(貴州景峰注射劑有限公司提供)。2、色譜條件的選擇試驗曾對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.5%乙酸等不同配比流動相系統進行考察，經等度或梯度試驗比較，結果表明，以乙腈-0.05%磷酸為流動相梯度洗脫分離效果較好，所檢測的各色譜峰既能達到基線分離，又縮短了分析時間。實驗中米用了 KromasilC18 (5.0mmX 200mm, 5 μ m,大連依利特)，HypersilC18 (5.0mmX 250mm，5 μ m,大連依利特)，InersilC18 (4.6mmX 250mm, 5 μ m,日本 GLSciencesInc.)和DiamonsilC18 (5.0mmX 250mm, 5 μ m,迪馬公司)色譜柱，結果以DiamonsilC18色譜柱的分離效果較好，指紋峰型基本一致，因此最終選擇了 DiamonsilClS柱。采用陣列二極管檢測器對丹參藥材、半成品和制劑的指紋圖譜檢測波長進行了選擇，結果表明檢測波長在230nm時，藥材、中間體及制劑的信息量較大，能兼顧各成分色譜峰的豐度、分離度和基線等。通過對儀器、流動相、檢測波長、柱溫等色譜條件進行優化考察的基礎上，獲得了能適用于參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑進行指紋圖譜檢測的相同色譜條件DiamonsilC18色譜柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m);流動相乙腈(A) -O. 05%磷酸(B)，流速ImL · mirT1,梯度洗脫，
O 7min,A2% 4% ；7 12min,A4% 18% ； 12 15min,A18% 20% ； 15 22min,A20% 23% ；22 32min，A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90%。柱溫40 °C，檢測波長230nm,進樣量10 μ L。二、對照品溶液的制備精密稱取丹參素鈉、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img · mL-1的對照品溶液。三、供試品溶液的制備I、丹參藥材供試品溶液的制備取過40目篩丹參藥材粉末(原料)約O. 5g，精密稱定，精密加入水25ml，稱定重量，加熱回流提取2h，放冷再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，上清液用微孔濾膜(O. 45 μ m)濾過，取續濾液，即得丹參藥材供試品溶液。2、丹參半成品供試品溶液的制備取丹參半成品(中間體)約O. 15g，精密稱定，加水溶解稀釋，定容至50mL，搖勻，上清液用微孔濾膜(O. 45 μ m)濾過，取續濾液，即得丹參半成品供試品溶液。3、參芎葡萄糖注射液供試品溶液的制備精密量取參芎葡萄糖注射液(制劑)10mL，加水稀釋，定容至25mL，搖勻，即得參芎葡萄糖注射液供試品溶液。四、指紋圖譜的測定與評價I、丹參藥材指紋圖譜的測定與評價從18批丹參藥材供試品指紋圖譜的檢測結果來看，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
12、13、14、15、16、17號峰在18批藥材中都在相同的相對保留時間處出現，其指紋峰面積之和占總量均大于90%，因而標定此17個色譜峰為共有特征峰。通過對照品比對試驗指認了6個色譜峰，其中峰5、7、13、14、15、17分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在丹參藥材指紋圖譜中，以15號峰丹酚酸B的峰面積最大，以丹酚酸B的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間為(單位為min) :1 (0.097±0.001) ；2(O. 111±0· 001)；3(0. 123±0· 001)；4(0. 198±0· 002)；5(0. 234±0· 002)；6(0. 271±0· 003)；7 (O. 472±0· 005) ;8 (O. 491 ±0. 005) ;9 (O. 662 ± O. 007 ) ; 10 (O. 687 ± O. 007 ) ; 11(O. 788±0. 008) ;12 (O. 813±0. 008) ;13 (O. 877±0. 009) ;14 (O. 914±0. 009) ; 15 (I);16 (I. 047±0. 01) ;17 (I. 076±0. 01)。2、丹參半成品指紋圖譜的測定與評價從13批丹參半成品指紋圖譜的檢測結果來看，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、
13、14、15、16號峰在13批丹參半成品中都在相同的相對保留時間處出現，其指紋峰面積之和占總量均大于95%，因而標定此16個色譜峰為共有指紋特征峰。通過對照品比對試驗指認了 7個色譜峰，其中峰5、7、11、13、15、16分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。在丹參半成品指紋圖譜中，以4號峰丹參素的峰面積最大，以丹參素的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間為(單位為min):1 (0.371 ±0.003) ;2(0.423±0.004) ;3 (0.455±0.004) ;4 (0.754±0.007) ;5 (I) ；6 (1.340±0.013);7 (1.509±0.015) ;8 (1.759 ± 0.017 ) ;9 ( 2.462 ± 0.025 ) ; 10 (2.583 ± 0.026 ) ; 11(3.033±0.030) ;12 (3.268±0.033) ; 13 (3.404±0.034) ; 14 ( 3.732±0.037) ; 15(3.791±0.038) ;16 (4.010±0.040)。3、參芎葡萄糖注射液指紋圖譜的測定與評價從17批供試品的檢測結果來看，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號峰在17批制劑中都在相同的相對保留時間處出現，其指紋峰面積之和占總量均大于95%，因而標定此10個色譜峰為共有指紋特征峰。通過對照品比對試驗指認了 7個色譜峰，其中峰4、5、6、7、8、9、10分別依次為丹參素、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。4、參芎葡萄糖注射液原料、中間體及制劑指紋圖譜相關性研究在相同色譜條件下對丹參藥材、丹參半成品和制劑進行指紋圖譜檢測，結果表明，制劑指紋圖譜中各特征峰除5號峰(鹽酸川芎嗪)來源于組方中的鹽酸川芎嗪原料藥外，其余特征峰均來源于組方中的丹參，均可在丹參藥材和丹參半成品中得到追蹤，無色譜峰缺失，制劑與藥材、半成品指紋圖譜有良好的相關性，見表I。表I藥材、中間體、制劑指紋圖譜相關性
權利要求
1.參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，由以下步驟組成: (1)、對照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img.mL-1的對照品溶液； (2)、供試品溶液的制備:取丹參藥材用水、甲醇或乙醇中的至少一種溶劑提出，定容得丹參藥材供試品溶液； (3)、供試品溶液的測定:吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，得到丹參藥材的指紋圖譜；指紋圖譜檢測的色譜條件為:十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長為200 300nm ;柱溫為35°C 550C ;進樣量為5 15 μ L ;流速為0.5 1.0mL.mirT1 ； (4)、對照指紋圖譜的建立:通過對10批次以上丹參藥材的指紋圖譜進行測定，確定其共有指紋特征峰，并經中藥指紋圖譜相似度評價軟件擬合建立丹參藥材對照指紋圖譜。
2.如權利要求1所述的參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)供試品溶液的制備過程具體如下:取過40目篩丹參藥材粉末0.5g，精密稱定，精密加入水25ml，稱定重量，加熱回流提取2h，放冷再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參藥材供試品溶液。
3.如權利要求1所述的參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(3)供試品溶液的測定中,所述測定具體為=DiamonsilC18色譜柱(4.6mmX 250mm,5μ m);流動相乙腈(A) -0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脫，O 7min，A2% 4% ；7 12min, A4% 18% ；12 15min, A18% 20% ;15 22min, A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱溫40°C，檢測波長230nm，進樣量10 μ L ;記錄60min色譜圖，即得到所需的丹參藥材指紋圖譜。
4.如權利要求1所述的參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(3)供試品溶液的測定中，在丹參藥材指紋圖譜中，以第15號峰丹酚酸B的峰面積最大，以丹酚酸B的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間:第I號共有峰的相對保留時間為0.097±0.0Olmin ’第2號共有峰的相對保留時間為0.111±0.0Olmin ；第3號共有峰的相對保留時間為0.123±0.0Olmin ;第4號共有峰的相對保留時間為0.198±0.002min ’第5號共有峰的相對保留時間為0.234±0.002min ’第6號共有峰的相對保留時間為0.271±0.003min ;第7號共有峰的相對保留時間為0.472±0.005min ；第8號共有峰的相對保留時間為0.491±0.005min ;第9號共有峰的相對保留時間為0.662±0.007min ;第10號共有峰的相對保留時間為0.687±0.007min ’第11號共有峰的相對保留時間為0.788±0.008min ;第12號共有峰的相對保留時間為0.813±0.008min ；第13號共有峰的相對保留時間為0.877±0.009min;第14號共有峰的相對保留時間為0.914±0.009min ;第15號共有峰的相對保留時間為Imin ;第16號共有峰的相對保留時間為1.047±0.0lmin ;第16號共有峰的相對保留時間為1.076±0.0lmin0
5.如權利要求1所述的參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，在丹參藥材指紋圖譜中確定了 17個特征峰，其中峰5、.7、13、14、15、17分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。
6.如權利要求1所述的參芎葡萄糖注射液原料的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(4)對照指紋圖譜的建立中，采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”對所得數據和圖譜進行處理即得到對照指紋圖譜。
7.參芎葡萄糖注射液原料的質量控制方法，是將權利要求1至6任一項權利要求所述的丹參藥材的指紋圖譜與丹參藥材對照指紋圖譜比較；經中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度應不得小于0.90。
8.參芎葡萄糖注射液的中間體指紋圖譜的建立方法，其特征在于，由以下步驟組成: (1)、對照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img.mL-1的對照品溶液； (2)、取丹參半成品，用水、甲醇或乙醇中的至少一種溶劑提取，定容，得供試品溶液； (3)、供試品溶液的測定:吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，得到丹參半成品的指紋圖譜；指紋圖譜檢測的色譜條件為:十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長為200 300nm ;柱溫為35°C 55°C ;進樣量為5 15 μ L ;流速為0.5 L OmL.mirT1 ； (4)、對照指紋圖譜的建立:通過對10批次以上丹參半成品的指紋圖譜測定，確定其共有指紋特征峰，并經中藥指紋圖譜相似度評價軟件擬合建立丹參半成品對照指紋圖譜。
9.如權利要求8所述的參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)供試品溶液的制備過程具體如下:取丹參半成品0.15g，精密稱定，加水溶解稀釋，定容至50mL，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參半成品供試品溶液。
10.如權利要求8所述的參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(3)供試品溶液的測定中，所述測定具體為DiamonsilC18色譜柱(4.6mmX 250mm, 5 μ m);流動相乙腈(A) -0.05 %磷酸(B)，流速 ImL.mirT1,梯度洗脫,O 7min，A2% 4% ；7 12min，A4% 18% ;12 15min，A18% 20% ；15 22min，A20% 23% ；22 32min，A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱溫40°C，檢測波長230nm，進樣量10 μ L ;記錄60min色譜圖，即得到所需的丹參半成品指紋圖譜。
11.如權利要求8所述的參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(3)供試品溶液的測定中，在丹參半成品指紋圖譜中，以4號峰丹參素的峰面積最大，以丹參素的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間 第I號共有峰的相對保留時間為0.371±0.003min ’第2號共有峰的相對保留時間為0.423±0.004min ；第3號共有峰的相對保留時間為0.455±0.004min ;第4號共有峰的相對保留時間為0.754±0.007min ;第5號共有峰的相對保留時間為Imin ’第6號共有峰的相對保留時間為1.340±0.013min ’第7號共有峰的相對保留時間為1.509±0.015min ;第8號共有峰的相對保留時間為1.759±0.017min ;第9號共有峰的相對保留時間為2.462±0.025min ；第10號共有峰的相對保留時間為2.583±0.026min ’第11號共有峰的相對保留時間為3.033±0.030min ;第12號共有峰的相對保留時間為3.268±0.033min ’第13號共有峰的相對保留時間為3.404±0.034min ;第14號共有峰的相對保留時間為3.732±0.037min ；第15號共有峰的相對保留時間為3.791±0.038min;第16號共有峰的相對保留時間為4.010±0.040min。
12.如權利要求8所述的參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(4)對照指紋圖譜的建立中，在丹參半成品指紋圖譜中確定了 16個特征峰，其中峰5、7、11、13、15、16分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A0
13.如權利要求8所述的參芎葡萄糖注射液中間體的指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟4對照指紋圖譜的建立中，采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”對所得數據和圖譜進行處理即得到對照指紋圖譜。
14.參芎葡萄糖注射液的中間體質量控制方法，是將權利要求8-13任一項權利要求所述的丹參半成品的指紋圖譜與丹參半成品的對照指紋圖譜比較，經中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度應不得小于0.90。
15.參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，其特征在于，由以下步驟組成: (1)、對照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A適量，加甲醇溶解，稀釋制成濃度分別為Img.mL-1的對照品溶液； (2)、供試品溶液的制備:取參芎葡萄糖注射液制劑，用水、甲醇或乙醇中的至少一種溶劑提取，定容，得供試品溶液； (3)、供試品溶液的測定:吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，得到參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜；指紋圖譜檢測的色譜條件為:十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈(A)-磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；檢測波長為200 300nm ;柱溫為35°C 55°C ;進樣量為5 15 μ L ;流速為0.5 1.0mL.mirT1 ； (4)、對照指紋圖譜的建立:通過對10批次以上參芎葡萄糖注射液原料或其中間體，或其制劑的測定，確定其共有指紋特征峰，并經中藥指紋圖譜相似度評價軟件擬合建立其對照指紋圖譜。
16.權利要求15所述的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，其特征在于，所述步驟(2)供試品溶液的制備為取過40目篩丹參藥材粉末0.5g，精密稱定，精密加入水25ml，稱定重量，加熱回流提取2h，放冷再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參藥材供試品溶液；取丹參半成品0.15g，精密稱定，加水溶解稀釋，定容至50mL，搖勻，上清液用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續濾液，即得丹參半成品供試品溶液；精密量取參芎葡萄糖注射液制劑10mL，加水稀釋，定容至25mL，搖勻，即得參芎葡萄糖注射液供試品溶液。
17.權利要求15所述的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，其特征在于，所述步驟(3)供試品溶液的測定中，所述測定具體為DiamonsilC18色譜柱(4.6mmX250mm,5μ m);流動相乙腈(A) -0.05%磷酸(B)，流速ImL.min—1，梯度洗脫，O 7min，A2% 4% ；7 12min, A4% 18% ；12 15min, A18% 20% ;15 22min, A20% 23% ；22 32min,A23% 32% ；32 42min，A32% 35% ；42 50min，A35% 90% ；50 60min，A90% ;柱溫40°C，檢測波長230nm，進樣量10 μ L ;記錄60min色譜圖，即得到所需的丹參半成品指紋圖-1'TfeP曰。
18.權利要求15所述的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，其特征在于，所述步驟(3)供試品溶液的測定， 在丹參藥材指紋圖譜中，以15號峰丹酚酸B的峰面積最大，以丹酚酸B的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間:第I共有峰的相對保留時間為0.097±0.0Olmin ’第2共有峰的相對保留時間為0.111±0.0Olmin ’第3共有峰的相對保留時間為0. 123±0. 00lmin ’第4共有峰的相對保留時間為0. 198±0. 002min ；第5共有峰的相對保留時間為0. 234±0. 002min ;第6共有峰的相對保留時間為0. 271 ±0. 003min ’第7共有峰的相對保留時間為0. 472±0. 005min ;第8共有峰的相對保留時間為0. 491±0. 005min ;第9共有峰的相對保留時間為0. 662±0. 007min ;第10共有峰的相對保留時間為0. 687±0. 007min ;第11共有峰的相對保留時間為0. 788±0. 008min ；第12共有峰的相對保留時間為0.813±0. 00Smin ;第13共有峰的相對保留時間為.0. 877±0. 009min ;第14共有峰的相對保留時間為0. 914±0 009min ;第15共有峰的相對保留時間為1min ;第16共有峰的相對保留時間為1. 047±0. 01 ;第17共有峰的相對保留時間為 1. 076±0 0lmin ； 在丹參半成品指紋圖譜中，以4號峰丹參素的峰面積最大，以丹參素的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間為第1共有峰的相對保留時間為0. 371±0. 003min ；第2共有峰的相對保留時間為0. 423±0. 004min ;第3共有峰的相對保留時間為.0. 455±0. 004min ;第4共有峰的相對保留時間為0. 754±0. 007min ;第5共有峰的相對保留時間為1min ;第6共有峰的相對保留時間為1. 340±0. 013min ;第7共有峰的相對保留時間為1. 509±0. 015min ’第8共有峰的相對保留時間為1. 759±0. 017min ’第9共有峰的相對保留時間為2. 462±0. 025min ;第10共有峰的相對保留時間為2. 583±0. 026min ；第11共有峰的相對保留時間為3. 033±0. 030min;第12共有峰的相對保留時間為.3. 268±0. 033min ;第13共有峰的相對保留時間為3. 404±0. 034min ;第14共有峰的相對保留時間為3. 732±0 037min ’第15共有峰的相對保留時間為3. 791±0. 038min ;第16共有峰的相對保留時間為4. 010±0. 040min ;在參芎葡萄糖注射液指紋圖譜中，以5號峰鹽酸川芎嗪的峰面積最大，以鹽酸川芎嗪的保留時間為參照，計算各共有峰的相對保留時間為第1共有峰的相對保留時間為0. 302±0.003min;第2共有峰的相對保留時間為.0. 347±0. 003min ;第3共有峰的相對保留時間為0. 618±0. 006min ;第4共有峰的相對保留時間為0. 822±0. 00Smin ;第5共有峰的相對保留時間為1min ;第6共有峰的相對保留時間為1. 233±0. 012min ;第7共有峰的相對保留時間為2. 375±0. 023min ’第8共有峰的相對保留時間為2. 658±0. 026min ;第9共有峰的相對保留時間為3. 034±0. 030min ;第9共有峰的相對保留時間為3. 254±0. 032min。
19.權利要求15所述的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，其特征在于，所述步驟(4)對照指紋圖譜的建立，在丹參藥材指紋圖譜中確定了 17個特征峰，其中峰5、7、.13、14、15、17分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在丹參半成品指紋圖譜中確定了 16個特征峰，其中峰5、7、11、13、15、16分別依次為丹參素、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A ;在參芎葡萄糖注射液指紋圖譜中確定了 10個特征峰，其中峰4、5、6、7、8、9、10分別依次為丹參素、鹽酸川芎嗪、原兒茶醛、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A。
20.權利要求15所述的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜建立方法，其特征在于，所述步驟(4)對照指紋圖譜的建立中，采用國家藥典委員會編制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004版)”對所得數據和圖譜進行處理即得到對照指紋圖譜。
21.參芎葡萄糖注射液制劑的質量控制方法，是將權利要求15至20任一項權利要求所述的參芎葡萄糖注射液制劑的指紋圖譜與參芎葡萄糖注射液制劑對照指紋圖譜比較；經中藥指紋圖譜相似度評價軟件計算相似度應不得小于0.90 ;將參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜進行比對，制劑指紋圖譜中各特征峰均須在原料和中間體指紋圖譜中得到追蹤，不得有 色譜峰缺失。
全文摘要
本發明公開一種參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑的指紋圖譜建立方法及質量控制方法。本發明在相同色譜條件下對原料、中間體及其制劑進行指紋圖譜檢測。該方法用十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；乙腈-磷酸水溶液為流動相，進行梯度洗脫；供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜有良好的相關性，相似度大于0.90，且參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑指紋圖譜有良好的相關性，制劑指紋圖譜中各特征峰均可在原料和中間體中得到追蹤。本發明建立的參芎葡萄糖注射液原料、中間體及其制劑指紋圖譜能用于參芎葡萄糖注射液產品制備工藝條件控制和質量控制，確保產品制備工藝和質量的穩定性。本發明提供的指紋圖譜檢測方法操作簡便，準確可靠，適用于參芎葡萄糖注射液的質量控制。
文檔編號G01N30/88GK103149310SQ20131002148
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者葉湘武, 鄭林, 王永林, 蘭燕宇 申請人:貴州景峰注射劑有限公司