專利名稱：Znf545基因甲基化定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及DNA甲基化檢測，主要涉及ー種定量檢測DNA甲基化的方法。
背景技術：
癌癥的早期診斷對癌癥患者的有效治療至關重要。目前對癌癥的診斷主要依據臨床癥狀、直接觸診、圖像信號檢測和組織病理學檢查等，但絕大多數癌癥臨床癥狀出現較晚，且活體取樣困難，在首次診斷時已呈晚期，嚴重影響了患者的治療和病人的愈后。因此尋找惡性腫瘤的生物標志物，應用于早期診斷和篩查，對腫瘤患者的治療和預后具有重要的意義。DNA甲基化程度和模式的改變是腫瘤發生的ー個重要因素。這些變化包括CpG島局部的高甲基化和基因組DNA低甲基化狀態。在正常細胞中，位于抑癌基因啟動子區域的CpG島處于低水平或未甲基化狀態，此時抑癌基因處于正常的開放狀態，抑癌基因不斷表達抑制腫瘤的發生。而在腫瘤細胞中，該區域的CpG島被高度甲基化，染色質構象發生改變，抑癌基因的表達被關閉，從而導致細胞進入細胞周期，凋亡喪失，DNA修復缺陷，血管生成以及細胞粘附功能缺失等，最終導致腫瘤發生。同樣，對于在正常細胞中處于高度甲基化的一些基因和重復序列，如果其甲基化程度降低，這些基因將表達和重復序列將激活，從而導致基因印記丟失，細胞過度增長，不合適的細胞特異性表達，基因組脆性増加，以及內寄生序列(endoparasitic sequence)激活,最終也導致腫瘤發生。由于CpG島的局部高度甲基化要早于細胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用于腫瘤的預測，而全基因組水平的低水平甲基化狀態，則隨著腫瘤惡性程度的增加而進ー步降低，使其可用于腫瘤的診斷以及分級。近年來，不斷有研究顯示人類腫瘤的發生、發展與DNA甲基化的異常有關，而且早在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特異基因的甲基化異常現象。所以甲基化可以作為腫瘤等早期診斷的生物標記物和預后評估指標，對腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型 、預后判斷及治療監測都具有重要的意義。ZNF545基因為含KRAB的鋅指基因，其編碼的蛋白能夠與DNA結合，ZNF545基因為轉錄調控因子，研究證明ZNF545為一種抑癌基因(The KRAB-containing zinc fingerprotein ZNF545 is a functional tumor suppressor exerting proapoptotic andantiproliferation abilities with frequent epigenetic inactivation in multiplecarcinomas， ChengYingduan， LiangPei and GengHua，101st Annual Meeting of theAmericanAssociationforCancerResearch, 2010)，在胃癌細胞中抑制核糖體 RNA 轉錄(Zinc-finger protein 545 is a novel tumour suppressor that acts Dy mhioitmgribosomal RNA transcription in gastric cancer，Wang S，Cheng Y and Du W, Gut，2012)，ZNF545基因作為抑癌基因，其甲基化程度與腫瘤的發生密切相關。ZNF545基因序列中CpG含量豐富，如何對其進行甲基化定量檢測成為ー個亟待解決的問題。針對特定基因的甲基化分析現有技術中主要有以下幾種方法，第一種現有技術是甲基化敏感性限制性內切酶 _P C R/Southern(methyIation-sensitive restrictionEndonucIease-PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern),這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后，進行Southern或PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有HpaI1-Msp I (CCGG)和 Sma-Xmal (CCCGGG)等。第二種現有技術是重亞硫酸鹽測序法，該方法首先用重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后，對PCR產物進行測序并且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法是精確度很高，能明確目的片段中每ー個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序，過程較為繁瑣、昂貴。第三種現有技術是，甲基化特異性的PCR(methylation-specificPCR,MS_PCR),該方法中DNA先用重亞硫酸鹽處理，隨后行引物特異性的PCR。其設計兩對引物，分別與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即ー對結合處理后的甲基化DNA鏈，另ー對結合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測MS-PCR擴增產物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；反之亦然。該方法適合判斷特點位點的甲基化情況。第四種現有技術為甲基化熒光法，結合重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，設計ー個能與待測位點區互補的探針， 探針的5’端連接報告熒光，3’端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸吋，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及程度。該方法適合分析特定位點甲基化情況。第五種現有技術是焦磷酸測序，該方法由4種酶催化同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每ー輪測序反 應中，只加入ー種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就能將其加入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值,其高度與核苷酸數目成正比。當用于甲基化檢測時，經重亞硫酸鹽處理的序列可以看作是C-T型的SNP改變。第六種現有技術為結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法，這種方法對標本DNA行重亞硫酸鹽處理及PCR擴增，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶變為胸腺嘧啶。隨后用限制性內切酶對轉化后PCR產物切割的特性以識別原標本DNA的甲基化狀況。以上各項現有技術在特定基因區域DNA甲基化的準確、高效的定量方面仍缺乏好的解決方法。由于ZNF545基因GpC含量較高，而CpG位點發生甲基化具有隨機性，尤其在腫瘤發生早期甲基化程度很低的情況下，針對具體甲基化位點設計特異性引物或探針的方法具有很大局限性，不能準確地反應整個ZNF基因中CpG位點聚集區的甲基化情況。此外，腫瘤發展階段主要是與甲基化高發區的甲基化程度有關，而與具體哪個CpG位點無關。因此需要解決現有定量甲基化分析方法受隨機甲基化影響的問題，提出ー種新的簡便、可靠、快速的獲取與腫瘤發展直接有關的定量甲基化程度分析方法
發明內容
本發明的目的是提供ー種定量檢測DNA甲基化的方法，可簡便、可靠、快速的獲取與腫瘤發展直接有關的甲基化程度分析。本發明提供的ー種ZNF基因甲基化定量檢測的方法，包括以下步驟步驟一、建立ZNF545基因熒光強度的標準化曲線對ZNF545基因分別建立甲基化程度為100%的陽性質控品與甲基化程度為0%的陰性質控品，將陽性與陰性質控品按照質量比為0 : 1、1 3、1 1、3 1、1 0混合，得到一組標準品，標準品的甲基化程度分別為0%、25%、50%、75%、100% ；用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二熒光標記物標記dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的引物對標準品進行PCR擴增，檢測所述標準品PCR擴增的產物中的第一熒光標記物和第二熒光標記物的熒光強度；其中，第一突光標記物的突光強度為M,第二突光標記物的突光強度為N,以N/M為縱坐標，標準品的甲基化程度為橫坐標，得到ZNF545基因甲基化的標準曲線方程；步驟ニ 待測樣品ZNF545基因甲基化定量檢測抽提待測樣本的血液基因組DNA，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理；用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二熒光標記物標記dCTP，以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的引物對亞硫酸氫鹽處理后的待測樣本基因組DNA進行PCR擴增，檢測PCR擴增后的產物中的第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度，第一熒光標記物的信號強度為Ml，第二熒光標記物的信號強度為NI ；步驟三、 將N1/M1代入步驟ー的標準曲線方程，計算得出對應橫坐標的值，即為待測樣本中ZNF545基因甲基化程度。本發明還提供了另ー種ZNF545基因甲基化定量檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一、建立ZNF545基因熒光強度的標準化曲線對ZNF545基因分別建立甲基化程度為100%的陽性質控品與甲基化程度為0%的陰性質控品，將陽性與陰性質控品按照質量比為0 : 1、1 3、1 1、3 1、1 0混合，得到一組標準品，標準品的甲基化程度分別為0%、25%、50%、75%、100% ；用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物，用第三標記物標記下游引物或用第一熒光標記物標記ZNF545基因的下游引物，用第三標記物標記上游引物；用第三標記物標記用第二熒光標記物標記dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的上游引物引物和標記有第三標記物的下游引物或用標記有第一熒光標記物的下游引物引物和標記有第三標記物的上游引物對標準品進行PCR擴增，所述的第三標記物為親和標記物JfPCR擴增產物加入到固定有親和素的酶標板中，使PCR擴增產物通過第三標記物與親和素的作用固定到酶標板上，用酶標儀測量第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度；
其中,第一突光標記物的突光強度為M,第二突光標記物的突光強度為N, 以N/M為縱坐標，標準品中的甲基化程度為橫坐標，得到ZNF545基因甲基化的標準曲線方程；步驟ニ 待測樣品ZNF545基因甲基化定量檢測抽提待測樣本的血液基因組DNA，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理；用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物，用第三標記物標記下游引物或用第一熒光標記物標記ZNF545基因的下游引物，用第三標記物標記上游引物；用第三標記物標記用第二熒光標記物標記dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的上游引物引物和標記有第三標記物的下游引物或用標記有第一熒光標記物的下游引物引物和標記有第三標記物的上游引物對對亞硫酸氫鹽處理后的待測樣本基因組DNA進行PCR擴增，所述的第三標記物為親和標記物；將PCR擴增產物加入到固定有親和素的酶標板中，使PCR擴增產物通過第三標記物與親和素的作用固定到酶標板上，用酶標儀測量第一突光標記物和第二突光標記物的信號強度，第一突光標記物的信號強度為Ml,第ニ突光標記物的信號強度為NI ；步驟三、將N1/M1代入步驟(I)的標準曲線方程，計算得出對應橫坐標的值，即為待測樣本中ZNF545基因甲基化程度。優選地，所述的建立ZNF基因陽性質控品的過程為培養乳腺癌細胞系MB231細胞，提取MB231細胞基因組DNA，對提取的基因組DNA進行亞硫酸 氫鹽轉化處理，以ZNF545基因作為目的片段對亞硫酸氫鹽處理后的DNA進行PCR擴增，PCR產物回收純化后與載體連接，轉化到E. coli DH5a感受態細胞中，對重組陽性克隆進行測序，挑選CG位點沒有改變的序列作為陽性質控品。優選地，所述的建立ZNF基因陰性質控品的過程為培養正常永生代細胞系HEK293細胞，提取HEK293細胞基因組DNA，對提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理，以ZNF545基因作為目的片段對亞硫酸氫鹽處理后的DNA進行PCR擴增，PCR產物回收純化后與載體連接，轉化到E. coli DH5a感受態細胞中，對重組陽性克隆進行測序，挑選CG位點全部變為TG的序列作為陽性質控品。優選地，所述的ZNF基因的PCR擴增引物序列為上游引物5-TTATAGGGTTTTTTAGTTGGTAT-3’(SEQ ID No 4)；下游引物5’-CCTCTCTCTTTACCCCCTAA-3’ (SEQ ID No :5)。優選地，所述的第一熒光標記物為FITC。優選地，所述的第二熒光標記物為Cy5。優選地，所述的PCR擴增的反應條件為起始95°C 5min ;然后95°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，進行40個循環；最后72°C IOmin0優選地，所述的第三標記物為生物素。本發明的有益效果在于，第一，本發明的甲基化定量檢測的方法不受甲基化位點的影響，快速，準確的對基因甲基化進行定量；第二，本發明的靈敏度較高，只需要微量的DNA樣品就可進行檢測；第三，本發明無需設計特異性探針或特異性引物，方法簡便易行，所采用的技術簡單易于實現，成本低。


圖1是實施例1中ZNF545基因熒光強度的標準化曲線。
具體實施例方式ZNF545基因的序列如SEQ ID No :1所示，ZNF545基因CpG位點較多，針對每個CpG設計探針的難度較大。本發明的ZNF基因甲基化定量檢測方法，步驟如下步驟一、建立ZNF545基因熒光強度的標準化曲線對ZNF545基因分別建立甲基化程度為100%的陽性質控品與甲基化程度為0%的陰性質控品，將陽性與陰性質控品按照質量比為0 : 1、1 3、1 1、3 1、1 0混合，得到一組標準品，標準品的甲基化程度分別為0%、25%、50%、75%、100% ；用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物，用第三標記物標記下游引物或用第一熒光標記物標記ZNF545基因的下游引物，用第三標記物標記上游引物；用第三標記物標記用第二熒光標記物標記dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的上游引物引物和標記有第三標記物的下游引物或用標記有第一熒光標記物的下游引物引物和標記有第三標記物的上游引物對標準品進行PCR擴增，所述的第三標記物為親和標記物JfPCR擴增產物加入到固定有親和素的酶標板中，使PCR擴增產物通過第三標記物與親和素的作用固定到酶標板上，用酶標儀測量第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度；其中,第一突光標記物的突光強度為M,第二突光標記物的突光強度為N,以N/M為縱坐標，標準品中的甲基化程度為橫坐標，得到ZNF545基因甲基化的標準曲線方程；步驟ニ 待測樣品ZNF545基因甲基化定量檢測(1)抽提待測樣本的血液基因組DNA ；(2)對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理；用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物，用第三標記物標記下游引物或用第一熒光標記物標記ZNF545基因的下游引物，用第三標記物標記上游引物；用第三標記物標記用第二熒光標記物標記dCTP ；以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的上游引物引物和標記有第三標記物的下游引物或用標記有第一熒光標記物的下游引物引物和標記有第三標記物的上游引物對對亞硫酸氫鹽處理后的待測樣本基因組DNA進行PCR擴增，所述的第三標記物為親和標記物；將PCR擴增產物加入到固定有親和素的酶標板中，使PCR擴增產物通過第三標記物與親和素的作用固定到酶標板上，用酶標儀測量第一突光標記物和第二突光標記物的信號強度，第一突光標記物的信號強度為Ml,第ニ突光標記物的信號強度為NI ；步驟三、將N1/M1代入步驟(I)的標準曲線方程，計算得出對應橫坐標的值，即為待測樣本中ZNF545基因甲基化程度。待測樣本基因組DNA經亞硫酸氫鹽處理后甲基化的CpG位點上的C保留，其它位點的C都被轉化為U，在DNA復制的過程中變為T，也就是說，亞硫酸氫鹽處理后ZNF基因中核苷酸C的數量與CpG甲基化的數量相同，第二熒光標記物標記的dCTP會在PCR過程中進入甲基化的CpG位點，還會與DNA序列中的G配對，由于整個DNA序列中的G含量是確定的，因此導致第二熒光標記物強度差異的主要為甲基化CpG位點的數量差異，因此，用第二突光標記物的信號強度(N)直接表征甲基化CpG的含量,第一突光標記物的信號強度(M)表征DNA的含量，N/M表征甲基化程度。進ー步，在未帶熒光標記的另ー引物上標記可用于親和吸附的標記如biotin，PCR擴增產物中的親和素與含有親和素受體的酶標板結合，固定到酶標板上，不僅可以進行PCR擴增后純化，還可用熒光酶標儀直接測定第一熒光標記物和第二熒光標記物的熒光強度。下面結合附圖和實施例對本發明做進ー步闡述。實施例1(一)、ZNF545基因陽性和陰性質控品的制備1、甲基化程度為100%的ZNF545基因陽性質控品的制備1、培養乳腺癌細胞系MB231細胞，按照下述實驗方法(I)所述的方法提取MB231細胞(簡稱為MB231)基因組DNA ；i1、按照下述實驗方法(2)所述的方法對MB231基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理；ii1、對步驟ii中所得DNA進行PCR擴增，引物為針對ZNF545基因設計的特異性引物，具體信息如下上游引物5-TTATAGGGTTTTTTAGTTGGTAT-3’(SEQ ID No 4)； 下游引物5，-CCTCTCTCTTTACCCCCTAA-3’(SEQ ID No :5)按照表I的ZNF545基因擴增PCR反應體系和表2的反應條件進行PCR擴增，得到ZNF545基因，用Invitrogen公司的pCR_T0P04連接試劑盒將PCR產物連接后轉化E. coliDH5 a感受態細胞，接種到含有抗生素的LB固體培養基上，于37°C培養箱中培養12h ；表1ZNF545基因擴增PCR反應體系
權利要求
1.一種ZNF545基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一、建立ZNF545基因甲基化的標準化曲線 對ZNF545基因分別建立甲基化程度為IOO %的陽性質控品與甲基化程度為O %的陰性質控品，將陽性與陰性質控品按照質量比為O : 1、1 3、1 1、3 1、1 O混合，得到一組標準品，標準品的甲基化程度分別為0%、25%、50%、75%、100% ； 用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二熒光標記物標記dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的引物對標準品進行PCR擴增，檢測所述標準品PCR擴增的產物中的第一熒光標記物和第二突光標記物的突光強度； 其中，第一突光標記物的突光強度為M,第二突光標記物的突光強度為N ； 以N/M為縱坐標，標準品的甲基化程度為橫坐標，得到ZNF545基因甲基化的標準曲線方程； 步驟二 待測樣品ZNF545基因甲基化定量檢測 抽提待測樣本的血液基因組DNA，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理； 用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二熒光標記物標記dCTP，以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的引物對亞硫酸氫鹽處理后的待測樣本基因組DNA進行PCR擴增，檢測PCR擴增后的產物中的第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度，第一熒光標記物的信號強度為M1，第二熒光標記物的信號強度為NI ； 步驟三、將N1/M1代入步驟一的標準曲線方程，計算得出對應橫坐標的值，即為待測樣本中ZNF545基因甲基化程度。
2.—種ZNF545基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一、建立ZNF545基因甲基化的標準化曲線 對ZNF545基因分別建立甲基化程度為100%的陽性質控品與甲基化程度為0%的陰性質控品，將陽性與陰性質控品按照質量比為O : 1、1 3、1 1、3 1、1 O混合，得到一組標準品，標準品的甲基化程度分別為0%、25%、50%、75%、100% ； 用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物，用第三標記物標記下游引物或用第一熒光標記物標記ZNF545基因的下游引物，用第三標記物標記上游引物；用第三標記物標記用第二熒光標記物標記dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的上游引物引物和標記有第三標記物的下游引物或用標記有第一熒光標記物的下游引物引物和標記有第三標記物的上游引物對標準品進行PCR擴增，所述的第三標記物為親和標記物；將PCR擴增產物加入到固定有親和素受體的酶標板中，使PCR擴增產物通過第三標記物與親和素受體的作用固定到酶標板上，用酶標儀測量第一熒光標記物和第二熒光標記物的信號強度； 其中，第一突光標記物的突光強度為M,第二突光標記物的突光強度為N, 以N/M為縱坐標，標準品中的甲基化程度為橫坐標，得到ZNF545基因甲基化的標準曲線方程；步驟二 待測樣品ZNF545基因甲基化定量檢測 抽提待測樣本的血液基因組DNA，對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理； 用第一熒光標記物標記ZNF545基因的上游引物，用第三標記物標記下游引物或用第一熒光標記物標記ZNF545基因的下游引物，用第三標記物標記上游引物；用第三標記物標記用第二熒光標記物標記dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和標記有第二熒光標記物的dCTP作為底物，以標記有第一熒光標記物的上游引物引物和標記有第三標記物的下游引物或用標記有第一熒光標記物的下游引物引物和標記有第三標記物的上游引物對對亞硫酸氫鹽處理后的待測樣本基因組DNA進行PCR擴增，所述的第三標記物為親和標記物；將PCR擴增產物加入到固定有親和素受體的酶標板中，使PCR擴增產物通過第三標記物與親和素受體的作用固定到酶標板上，用酶標儀測量第一突光標記物和第二突光標記物的信號強度，第一突光標記物的信號強度為M1，第二熒光標記物的信號強度為NI ； 步驟三、將N1/M1代入步驟(I)的標準曲線方程，計算得出對應橫坐標的值，即為待測樣本中ZNF545基因甲基化程度。
3.根據權利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的建立ZNF基因陽性質控品的過程為 培養乳腺癌細胞系MB231細胞，提取MB231細胞基因組DNA，對提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理，以ZNF545基因作為目的片段對亞硫酸氫鹽處理后的DNA進行PCR擴增，PCR產物回收純化后與載體連接，轉化到E. coli DH5a感受態細胞中，對重組陽性克隆進行測序，挑選CG位點沒有改變的序列作為陽性質控品。
4.根據權利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的建立ZNF基因陰性質控品的過程為 培養正常永生代細胞系HEK293細胞，提取HEK293細胞基因組DNA，對提取的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽轉化處理，以ZNF545基因作為目的片段對亞硫酸氫鹽處理后的DNA進行PCR擴增，PCR產物回收純化后與載體連接，轉化到E. coli DH5a感受態細胞中，對重組陽性克隆進行測序，挑選CG位點全部變為TG的序列作為陽性質控品。
5.根據權利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的ZNF基因的PCR擴增引物序列為 上游引物5-TTATAGGGTTTTTTAGTTGGTAT-3’ ； 下游引物5’ -CCTCTCTCTTTACCCCCTAA-3’。
6.根據權利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的第一熒光標記物為FITC。
7.根據權利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的第二突光標記物為Cy5。
8.根據權利要求1或2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的PCR擴增的反應條件為起始95°C 5min ;然后95°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s，進行40個循環；最后 72 °C IOmin。
9.根據權利要求2所述的ZNF基因甲基化定量檢測方法，其特征在于，所述的第三標記物為生物素。
全文摘要
本發明公開了一種ZNF545基因甲基化的定量檢測方法，將第一熒光標記物引入到上游引物或下游引物中，將第二熒光標記物引入到dCTP底物中，在PCR擴增過程中同時將兩種熒光標記物標記到待測樣品中ZNF545基因序列中，在建立熒光強度標準化曲線后，可根據兩種熒光標記物的信號強度比值來定量檢測待測樣品中ZNF545基因的甲基化程度。本發明的甲基化定量檢測的方法不受甲基化位點的影響，快速，準確的對基因甲基化進行定量；靈敏度較高，只需要微量的DNA樣品就可進行檢測；無需設計特異性探針或特異性引物，方法簡便易行，所采用的技術簡單易于實現，成本低。
文檔編號G01N21/64GK103031372SQ201210284720
公開日2013年4月10日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者蔡林濤, 王朝暉, 龔萍, 蘇獻偉, 石碧華 申請人:深圳先進技術研究院