用于全基因組甲基化重亞硫酸氫鹽測序的文庫構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因檢測領域，具體涉及一種適用于中量級別（5~200ng)的起始樣 本量的用于全基因組甲基化重亞硫酸氫鹽測序的文庫構建方法。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化是基因組DNA的一種最常見的表觀遺傳修飾，大量研究表明DNA甲基化 修飾對于維持正常細胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生等起著至 關重要的作用。伴隨著高通量測序的誕生，對DNA甲基化的研究越來越深入，作為DNA甲基 化檢測的金標準，全基因組重亞硫酸氫鹽測序（WGBS或BS-Seq，WholeGenomeBisulfate Sequencing)[1]，能夠對全基因組DNA甲基化進行分析，并且具備了單堿基水平的檢測靈敏 度。然而，BS-Seq技術建庫起始量要求yg以上，高起始量是限制BS-seq在臨床樣本應用 的主要因素。
[0003] 目前，BS-Seq技術主要用于已完成測序的物種，需要1~3yg基因組DNA起始構 建文庫。BS-Seq文庫構建方法如下，詳細流程參考Li等[1]:
[0004] (1)gDNA片段化：1~3μg基因組DNA起始量，采用超聲波打斷儀片段化gDNA，打 斷產物直接用于末端修復；
[0005] (2)末端修復：以dNTPs為單核苷酸來源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和 Klenow片段將打斷產物修復成平末端，1. 8倍Ampure磁珠純化；
[0006] (3)加"A" ：以dATP為單核苷酸來源，采用Klenow(3' -5'exo_)為平末端3'端加 A，1. 8倍Ampure磁珠純化；
[0007] (4)加甲基化接頭：采用T4DNA連接酶將帶T的甲基化接頭連接在含A的DNA片 段兩端，1. 8倍Ampure磁珠純化；
[0008] (5)重亞硫酸氫鹽處理：采用EZDNAMethylation-GoldKit對膠回收產物進行 重亞硫酸氫鹽處理反應；
[0009] (6)片段篩選：采用瓊脂糖凝膠電泳回收300~350bp范圍內的片段，QIA-quick GelExtractionKit進行膠純化回收；
[0010] (7)PCR擴增：采用ΚΑΡΑHiFiHotstartUracil+ReadyMix對膠回收產物進行PCR 擴增，擴增產物〇. 9倍Ampure磁珠純化，文庫構建完成。
[0011] 2012 年，Miura等 提出了Post-BisulfiteAdaptorTagging(PBAT)全基因 組甲基化建庫方法，利用Bisulfite處理過程中的損傷作用片段化DNA，接著以單鏈的 Bisulfite產物為模板，以含有生物素標記的Oligol為引物合成一鏈（1輪反應），核酸外 切酶I消化合成不完全的單鏈DNA，再用鏈親和素磁珠M280調取一鏈產物，以一鏈產物為模 板和01ig〇2引物合成二鏈，最后以Illumina公共PE引物和Index引物擴增出文庫。2014 年，Swallwood等[3]對PBAT法進行調整后，將基于兩條鏈合成的BS建庫方法應用到單細胞 全基因組甲基化檢測，并將其命名為scBS測序技術，該方法適于利用小量級別（lng以下） 的單細胞全基因組進行甲基化測序。
[0012] PBAT和scBS兩種方法的原理相同，主要通過兩個含Illumina接頭序列的寡聚 核苷酸引物，在兩輪合成反應中添加接頭序列，scBS文庫構建方法如下，詳細流程參考 Swallwood等[3]:
[0013] (l)Bisulfite處理：對gDNA進行Bisulfite處理，利用此過程中的DNA損傷片段 化gDNA;
[0014] (2)-鏈合成：以單鏈Bisulfite產物為模板，采用含生物素標記的oligol引物 合成第一條鏈，一鏈合成需要5輪反應，此時第一條鏈的5'端已含有接頭序列；
[0015] (3)單鏈DNA消化：采用核酸外切酶I消化一鏈合成后呈現單鏈的DNA序列；
[0016] (4)M280調取：采用鏈親和素磁珠M280調取生物素標記的一鏈產物；
[0017] (5)二鏈合成：以第一條鏈為模板，采用01ig〇2引物合成第二條鏈，此時第二條鏈 的3'端和5'端均含有Illumina接頭序列；
[0018] (6)以第二條鏈為模板，使用IIlumin通用PCR引物和Index引物擴增得到最終文 庫。
[0019] 但是，對于中量級別（5~200ng)的起始樣本量，上述兩種方法均不能有效適用。
[0020] 參考文獻
[0021] 非專利文獻
[0022] [1]Li,N. ,etal. ,WholegenomeDNAmethylationanalysisbasedonhigh throughputsequencingtechnology.Methods. 2010. 52(3):p. 203-12.
[0023] [2]Miura.F,Enomoto.Y,Dairiki.R,etal.Amplification-freewhole-genome bisulfatesequencingbypost-bisulfiteadaptortagging.NucleicAcids Research. 2012, 40(17),el36.
[0024] [3]Smallwood.S.A,Lee.H.J,Angermueller.C,etal.Single-cellgenome-wide bisulfitesequencingforassessingepigeneticheterogeneity.Nature Methods. 2014, 11(8):817-20.

【發明內容】

[0025] 本發明人經研究發現，對于中量級別（5~200ng)的起始樣本量，如果采用上述 BS-Seq方法構建測序文庫，則構建出的文庫濃度偏低或者下機數據的冗余度太高；而如果 采用上述PBAT或scBS方法構建測序文庫，則存在最終文庫有效數據利用率低的情況。需要 說明的是，一般而言，希望最終文庫片段主要分布在200~500bp之間，且峰值出現在300bp 左右。
[0026] 鑒于上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種適用于中量級別的 用于全基因組甲基化重亞硫酸氫鹽測序的文庫構建方法。
[0027] 本發明經過深入研究，在現有的文庫構建方法的基礎上，對文庫構建步驟進行了 巧妙的改進及優化，開發出了適用于中量級別（5~200ng)的起始樣本量的用于全基因組 甲基化重亞硫酸氫鹽測序的文庫構建新方法，從而完成了本發明。
[0028] 即，本發明包括：
[0029] 1.一種用于全基因組甲基化重亞硫酸氫鹽測序的文庫構建方法，該方法包括： [0030]步驟A:將5~200ng的基因組DNA用超聲波打斷儀片段化，得到片段化的基因組 DNA；
[0031] 步驟B:對上述片段化的基因組DNA進行重亞硫酸氫鹽處理，得到單鏈的重亞硫酸 氫鹽處理產物；
[0032] 步驟C:以上述單鏈的重亞硫酸氫鹽處理產物為模板，使用含生物素標記的 oligol引物合成第一條鏈；
[0033] 步驟D:使用核酸外切酶消化第一條鏈合成后體系中的單鏈DNA;
[0034] 步驟E:使用鏈親和素磁珠調取生物素標記的第一條鏈；
[0035] 步驟F:以上述生物素標記的第一條鏈為模板，使用〇lig〇2引物合成第二條鏈；以 及
[0036] 步驟G:以所述第二條鏈作為模板進行PCR擴增，從而構建二代測序用DNA文庫。
[0037] 2.根據項1所述的文庫構建方法，其中，
[0038] 在所述步驟A中對得到的片段化的基因組DNA進行磁珠純化；和/或
[0039] 在所述步驟D中對消化處理后的體系進行磁珠純化，得到純化的生物素標記的第 一條鏈；和/或
[0040] 在所述步驟G中，對所述PCR擴增的產物進行磁珠純化。
[0041] 3.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟C中使用了10~lOOpmol的 oligol引物。
[0042] 4.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟C中使用了40pmol的oligol引 物。
[0043] 5.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟C中采用如下反應體系合成所述 第一條鏈：
[0044] 以50μL體系計
[0045] 所述單鏈的重亞硫酸氫盆處理產物 31.0μL dNTPs ?ΙΟηιΜ) 4·0μ[ Oligoi (10μΜ) 4.0μΙ. l0xBlue Buffer 5.0μΕ 缺失外切酶活性的Klenow片段 4.0μL, 20L ddH20余量
[0046] 6.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟G中采用如下反應體系合成所述 第二條鏈：
[0047] 以50μL體系計，所述生物素標記的第一條鏈溶于
[0048] dNTPs (lOrnM) 4.0'uL 01igo2 (ΙΟμΜ) 4"0μΙ. lOxBlueBuffer 5.0pL 缺失外切酶活性的Klenow片段 4.0μΙ_.，20U ddH?0 余量
[0049] 7.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟A中用超聲波打斷儀片段化的條 件為：超聲打斷30秒，停30秒，重復22次。
[0050] 8.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟A中將40~150ng的基因組DNA 用超聲波打斷儀片段化。
[0051] 9.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟A中將50~100ng的基因組DNA 用超聲波打斷儀片段化。
[0052] 10.根據項1所述的文庫構建方法，其中，所述步驟A的所述基因組DNA為人類基 因組DNA。
[0053] 發明效果
[0054] 根據本發明，提供一種適用于中量級別（5~200ng)的起始樣本量的用于全基因 組甲基化重亞硫酸氫鹽測序的文庫構建新方法。
【附圖說明】
[0055] 圖1為文庫BSCS140100-1-79的質檢結果。
[0056] 發明的【具體實施方式】
[0057] 首先，在一個方面中，本發明提供一種用于全基因組甲基化重亞硫酸氫鹽測序的 文庫構建方法（本發明的方法），該方法包括：
[0058] 步驟A :將5~200ng的基因組DNA用超聲波打斷儀片段化，得到片段化的基因組 DNA；
[0059] 步驟B:對上述片段化的基因組DNA進行重亞硫酸氫鹽處理，得到單鏈的重亞硫酸 氫鹽處理產物；
[0060] 步驟C:以上述單鏈的重亞硫酸氫鹽處理產物為模板，使用含生物素標記的 oligol引物合成第一條鏈；
[0061] 步驟D:使用核酸外切酶消化第一條鏈合成后體系中的單鏈DNA;
[0062] 步驟E:使用鏈親和素磁珠調取生物素標記的第一條鏈；
[0063] 步驟F:以上述生物素標記的第一條鏈為模板，使用〇lig〇2引物合成第二條鏈；以 及
[0064] 步驟G:以所述第二條鏈作為模板進行PCR擴增，從而構建二代測序用DNA文庫。
[0065] 這里，所述基因組DNA是基因組中存在甲基化修飾的物種的基因組DNA，例如哺乳 動物基因組DNA或人基因組DNA。作為起始的基因組DNA的量優選為40~150ng，更優選 為50~100ng。對于獲得該基因組DNA的方式沒有限制，例如可以從樣本中提取，所述樣本 例如為血液。但需要說明的是，本發明的方法并不包含任何的介入性步驟，例如采血步驟。
[0066] 在將所述基因組DNA片段化時，超聲波打斷儀的操作條件可以為：超聲打斷30秒， 停30秒，重復22次。
[0067] 所述