一種檢測肝癌風險基因tspyl5甲基化水平的試劑盒及方法
【專利說明】-種檢測肝癌風險基因TSPYL5甲基化水平的試劑盒及方 法
[0001]
技術領域
[0002] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種檢測肝癌風險基因基化水 平的試劑盒及方法。
【背景技術】
[0003] DNA甲基化是表觀遺傳學研宄的主要內容之一，研宄的是基因堿基序列不發生改 變的情況下發生的可逆的遺傳性改變，是一種DNA分子復制后共價修飾方式。在真核生物 中，DNA甲基化指在DNA甲基轉移酶（DNMTs)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體將 甲基轉移至DNA分子中的特定堿基上的過程，它主要發生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶上。 在基因組中，CpG二核苷酸分布相對集中的區域稱為CpG島（CpG islands，CGIs)，大小在 100~lOOObp，主要位于基因的啟動子區和第一外顯子區；CpG島的異常甲基化可以直接導 致相關基因的表達沉默。DNA特定的甲基化模式對于維持基因組穩定性及基因正確的時空 表達具有重要意義，甲基化模式的異常改變將會直接參與人類疾病甚至癌癥的發生。
[0004] 甲基化敏感性限制性內切酶技術結合PCR的方法（Methylation-sensitive restriction enzyme digestion and PCR，MSRE_PCR)是基于甲基化敏感性限制性內切酶 對甲基化位點不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進行PCR擴增，根據電泳產 物差異分析甲基化狀態。具體原理參見圖1，選用對特異DNA片段甲基化序列敏感的限制性 內切酶進行酶切后，以待測甲基化位點外側序列為擴增起始點進行PCR。該DNA片段若存在 甲基化，將會有擴增產物出現；若無甲基化，則不會有任何片段擴增出現。當用甲基化不敏 感的內切酶消化產物作為PCR模板時，不論該部位是否甲基化都不應有片段擴出。
[0005] 重亞硫酸鹽克隆測序（bisulfite sequencingPCR，BSP)的方法，提取的DNA經 亞硫酸氫鹽修飾后，未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成脲嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持 不變。經過PCR脲嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。PCR產物瓊脂糖電泳后切膠純化，隨后連接 到PMD18-T載體，轉化大腸桿菌，過夜培養后挑單個陽性克隆提取質粒進行測序，得到每個 DNA分子特定區域甲基化位點的分布圖，從而得到該區域各個CpG位點的甲基化狀態。該方 法是一種可靠性及精確度很高的檢測甲基化狀態的方法，能夠明確目的片段中每一個CpG 位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優點。然 而該方法耗費時間、資金以及精力，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據，需要 大量的克隆及質粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。故而難以在臨床實現高通量的自動化檢 測，但卻可以作為甲基化檢測新方法的對比方法。
[0006] 本試劑盒擬建立基于甲基化敏感性限制性內切酶結合熒光定量PCR (MSRE-qPCR) 的方法，將MSRE-PCR方法的后續檢測改為熒光定量PCR，可以定量檢測微量DNA樣品特定基 因位點的甲基化水平。該方法使用方便，無需進行亞硫酸氫鹽處理，而且對石蠟切片有良好 的兼容性。

【發明內容】

[0007] 基于此，本發明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性良好的檢測肝癌風險基因 狎基化水平的試劑盒。
[0008] 本發明的目的通過下述技術方案實現： 一種用于檢測75P7L5基因甲基化的熒光定量PCR的方法，包括如下步驟：①提取待測 樣本基因組DNA ;②使用甲基化敏感性限制性內切酶對基因組DNA進行酶切；③使用引物對 A對酶切產物進行熒光定量PCR擴增；④對PCR產物的Ct值進行分析；⑤根據分析結果判 斷樣本中基因的甲基化水平。
[0009] 其中，步驟③中的引物對A優選為以下四對引物中的一對(括號內表示引物對擴 增片段的長度）： AF1 :5' -CCCCGCGAGCGCATATCAGAG -3'（176bp)， AR1 :5' -GCAACCGCCGACGTCACGAAC-3' ； AF2 :5' -ATATCAGAGAAACTCGCCGAG-3' （150bp)， AR2 :5' -CACGAACGTACAACTGTACCG-3' ； AF3 :5' -CAGAGAAACTCGCCGAGACCTA-3' （231bp)， AR3 :5' -TTCAAAGACACGCTGTGACCCT-3' ； AF4 :5' -AGCGCATATCAGAGAAACT-3' （140bp)， AR4 :5' -GTACCGTCGCGAGAGGACGTGA-3'。
[0010] 上述引物通過如下方法設計得到：從UCSC數據庫獲得7S°7L5基因CpG島序列， 通過分析該序列中的酶切位點，采用在線引物設計軟件（//simgene. com/Primer3) primer premier 3.0設計包含2-6個酶切位點的PCR引物。經過反復試驗篩選和驗證，得 到了擴增效率高、特異性好，能夠檢測樣本/^7Z遙因甲基化水平的引物。
[0011] 一種基于甲基化敏感性限制性內切酶結合熒光定量PCR檢測7S°7L5基因甲基化 水平的試劑盒A，包含上述引物對A。
[0012] 所述的試劑盒A還包含甲基化敏感性限制性內切酶。
[0013] 所述的試劑盒A還包含甲基化陰性對照和陽性對照。優選的，陰性對照包括正常 人外周血DNA、商業化未甲基化的人類基因組DNA對照；陽性對照包括商業化的完全甲基化 的人類基因組DNA、已證實的靶基因片段完全甲基化的肝癌細胞系DNA。
[0014] 所述的試劑盒A還包含熒光定量PCR的SYBR Green熒光染料等。
[0015] 上述試劑盒A的使用方法，包括如下步驟：①提取待測樣本基因組DNA;②使用甲 基化敏感性限制性內切酶對基因組DNA進行酶切；③使用引物對A對酶切產物進行熒光定 量PCR擴增；④對PCR產物進行Ct值分析。
[0016] 所述的酶切的體系優選為：DNA 300ng，Buffer (10X )5 y L，甲基化敏感性限制性 內切酶30U，ddH20補足至50 y L。
[0017] 所述的PCR擴增的反應體系優選為：SYBR Mix (2X)10yL，上游引物（F)0. 5yL， 下游引物（R) 0. 5 y L，ddH20 7 y L，酶切產物2 y L。
[0018]所述的 PCR 擴增的反應條件優選為：95°C 5min ;95°C 30s，61°C 30s，72°C 30s， 35-40 cycles〇
[0019] 本發明基于甲基化敏感性限制性內切酶結合熒光定量PCR的試劑盒A可以分為檢 測系統和監控系統兩個部分。檢測系統包括上述引物對A，可由其中的任意一種組合而成。 監控系統則包括：①陰性對照包括2種，第1種是已經證實的待測區域為非甲基化的的正常 人基因組DNA模板；第2種是商業化的非甲基化人類基因組DNA對照。正常情況下所有陰 性對照的甲基化水平應趨近0,否則表明加樣過程有污染或者酶切不完全。②陽性對照為商 業化的完全甲基化的人類基因組DNA、已證實的靶基因片段完全甲基化的肝癌細胞系DNA; 正常反應下陽性對照的甲基化水平應趨近1，否則說明實驗失敗。
[0020] 另一種用于檢測75P7L5基因甲基化的BSP的方法，包括如下步驟：①提取待測樣 本基因組DNA;②使用亞硫酸氫鈉對基因組DNA進行修飾；③使用引物對B對修飾后的DNA 進行PCR擴增；④PCR產物克隆測序分析每個CG位點的甲基化情況。
[0021] 其中，步驟③中的引物對B包括外側引物（W)和內側引物（N)，其中外側引物為以 下3對中的一對： BWF1 :5' -TAAGAGATAATTGGAGGA-3'（465bp)， BWR1 :5' -ACCTTTACCCCGATTTTTA-3' ； BWF2 :5' -ACGTTCGAGTATTTTTTTTA-3' （498bp)， BWR2 :5' -GACCTTTACCCCAATTTTTA-3' ； BWF3 :5' -AGATAATTGGAGGAGTTGAAGA-3' （526bp)， BWR3 :5' -TACTATAAAAAATCCGAATCGC-3' ； 內側引物為以下4對引物中的一對： BNF1 :5' -AATAGGTGATGGGGGATAGGT-3'（376bp)， BNR1 :5' -CCGCTCATAATAACGACGAAA-3' ； BNF2 :5' -AGAAAATAGGTGATGGGGGA-3' （383bp)， BNR2 :5' -CGACCGCTCATAATAACGAC-3' ； BNF3 :5' -TTAGAAAATAGGTGATGGGGGATAG-3' （373bp)， BNR3 :5' -ATAACGACGAAAACAACTTCAAAAA-3' ； BNF4 :5' -AATAGGTGATGGGGGATAG-3' （378bp)， BNR4 :5' -GACCGCTCATAATAACGAC-3'。
[0022] 上述引物通過如下方法設計得到：從UCSC數據庫獲得7S°7L5基因CpG島序 列，用于BSP方法的引物采用在線甲基化引物設計軟件（//www. urogene. org/ methprimer/)MethPrimer設計。經過反復試驗篩選和驗證，得到了擴增效率高、特異性好， 能夠檢測樣本基因甲基化水平的BSP引物。
[0023] 一種基于亞硫酸氫鈉修飾的PCR檢測7S°7L5基因甲基化水平的試劑盒B，包含上 述引物對B。
[0024] 所述的試劑盒B還包含甲基化陰性對照和陽性對照。優選的，陰性對照包括正常 人外周血DNA、商業化非甲基化的人類基因組DNA對照；陽性對照包括商業化的甲基化人類 基因組DNA、已證實的靶基因片段完全甲基化的肝癌細胞系DNA。
[0025] 所述的試劑盒B還包含PCR試劑（dNTPs、DNA聚合酶、DNA聚合酶buffer等）以及 亞硫酸氫鈉修飾過程所需的試劑(亞硫酸氫鈉、氫醌、氫氧化鈉、乙酸銨、糖原等)。
[0026] 上述試劑盒B的使用方法，包括如下步驟：①提取待測樣本基因組DNA ;②使用亞 硫酸氫鈉對基因組DNA進行修飾；③使用引物對B對修飾后的DNA進行PCR擴增(依次使用 外側引物和內側引物進行巢氏PCR擴增）；④PCR產物克隆測序分析每個CG位點的甲基化 情況。
[0027]所述的 PCR 擴增的反應體系優選為：Buffer (10X)5yL，dNTPs(10mM)l yL，MgCl2 (25mM)4yL，Taq (lU/yL)2yL，上游引物（F) lyL，下游引物（R) lyL，ddH20 32 yL，DNA 模板4yL。
[0028] 所述的巢氏PCR擴增外側、內側的反應條件均優選為：95°C，5min ;95°C，30s， 68°C -56°C，2cycles/2°C，45s，72°C，45s，退火溫度降至 56°C 時進行 25cycles ;72°C， 10min〇
[0029] 本發明發現了 75P7L5基因甲基化與肝癌發生的關聯性，并鑒定了 75P7L5的甲基 化位點，結合甲基化敏感性限制性內切酶以及特定的引物，建立熒光定量PCR的檢測方法。 而且隨后采用BSP的方法對這一結論進行了驗證。
[0030] 本發明所述的基因甲基化檢測試劑盒的靈敏度高達80. 37%，特異度高達 93. 25%〇
[0031] 本方法利用熒光定量PCR方法檢測DNA甲基化，大大提高了檢測效率，降低了檢測 成本。檢測結果簡單，直觀，而且高通量，一次可檢測許多樣本。
【附圖說明】
[0032] 圖1是MSRE-PCR原理圖；圖中，CH3表示甲基化，enz表示甲基化敏感性限制性內 切酶；左圖DNA無甲基化，DNA被切斷，無法得到PCR產物；右圖DNA有甲基化，DNA保持