專利名稱：富硒保健品中硒形態的測定方法
技術領域：
本發明涉及一種富硒保健品硒形態的測定方法，特別是涉及一種富硒保健品進行前處理后進行硒形態的測定方法。
背景技術：
硒是人體必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的組成成分， 具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人體免疫力、保護心腦血管等作用(Rotruck J T，Pope A L, Ganther H E, et al Selenium :biochemicalrole as a component of glutathione peroxidase. Science, 1973,179, 588-590.) 我國有 2/3 的地區缺硒，其中有 1/3 的地區為嚴重缺硒地區。人和動物體缺硒會導致克山病，大骨節病，動物的白肌病等，除此以外一些癌癥，地方性甲狀腺障礙等疾病也與低硒環境密切相關(Ip C. Lessons frombasic research in selenium and cancer prevention.Journal Nutrition,1998,128, 1845-1854.)。人們日常飲食中的硒包括無機硒和有機硒，其中無機硒毒性較大，中毒量與需要量的界限非常接近，而且吸收和利用率差，生物有效性低，因而被嚴格限制其使用量。 有機硒更利于人體吸收利用，生物活性強，毒性低(盧嵐，魯兵，王春娥.保健食品中有機硒和無機硒的分析探討.中國衛生檢驗雜志.2010，2(K4) :767-769.),是更高效、安全的人體補硒形式。硒的生物學功能的發揮主要依賴于其存在形態，特別是有機硒(硒代氨基酸) 的形態。因此，準確的檢測分析硒代氨基酸的形態具有重大的意義，不僅能指導消費者科學補硒，還能進一步了解硒的生物化學特性和硒在自然界遷移變化的規律。
目前，我國測定有機硒含量的方法主要為差減法(秦昉.植物中有機硒含量的測定.無錫輕工業大學學報.1998，17 (4) :74-77.),差減法的原理是先利用不同的試劑將待測樣品中的有機硒和無機硒分離，因無機硒主要以硒酸根(Se042_)和亞硒酸根(Se032_) 陰離子形式存在，易溶于水。有機硒主要是與蛋白質、纖維素和碳水化合物中的C、N等結合，以大分子的有機物形態存在，所以可利用環己烷或甲苯等有機溶劑萃取出有機硒，再通過測定總硒和無機硒的含量，差減得到有機硒的含量。此方法操作步驟繁瑣，重復性差，只能得到有機硒的總量，對于具體的有機硒形態并不清楚，且所用的環己烷、甲苯等有機溶劑存在一定的毒性。硒形態研究屬于前沿研究，目前國內、外并無硒形態研究方法的標準。本發明利用溫和的提取方式，提取含硒化合物，利用酶水解含硒化合物后再利用液相色譜進行有效分離，最后利用高靈敏度的原子熒光(AM)進行不同形態硒的測定，最后得到有機硒的含量。此方法的優點是能測定富硒植物中不同形態的硒含量和有機硒含量，能進一步了解植物富集吸收硒的轉化規律，此方法簡單易操作，重復性好，精確度高，所用試劑無毒、 無污染。
國外對硒形態測定的前處理方法也有報道，Selenium species in leavesof chicory, dandelion, lamb' s lettuce and parsley(Darja Mazej, VekoslavaStibilj, et al. Food Chemistry, 2008,107 :75-83.)公開了一種單獨利用蛋白酶水解樣品然后進行硒形態測試的方法，該方法蛋白酶用量與樣品的比例為1 2 1 5，成本很高。
所以，開發一種針對以硒代氨基酸為主要分析目標、低成本高效率的樣品前處理及測試方法十分有必要。發明內容
本發明的目的是克服現有硒形態測定技術特別是提取技術中存在的不足，提供一種操作簡便，提取效率高，重復性好，成本低的富硒保健品中硒形態的測定方法。
為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案如下
一種富硒保健品中硒形態的測定方法，其特征在于所述方法包括以下步驟
(1)富硒保健品的預處理使用提取緩沖液Tris-HCl對富硒保健品樣品進行提取，提取處理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取得到待測樣品溶液；
(2)采用氫化物發生——原子熒光光譜法與高效液相色譜法聯用分別對標準硒形態溶液和待測樣品溶液進行測定；用峰高或峰面積進行定量，用數據處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標法校正，按照公式(1)可計算得到待測樣品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；
X = CXV/m (1)
其中X為樣品中待測物質的含量，單位為微克每千克(yg/kg) ；C為待測液中該物質的濃度，單位為微克每升(yg/L) ；V為測定液體總體積，單位為毫升(mL) ；F為稀釋倍數；m為稱樣質量(體積)，單位為克(g/mL)。
優選的，所述方法中提取緩沖液Tris-HCl的濃度為lOOmmol/L，pH7. 5，液體保健品樣品與提取液的比例(V V)為1 5 1 10或者固體保健品樣品與提取液的比例 (m V)為 1 25 1 100。
優選的，所述方法中提取方法采用超聲提取，提取時間為10 30min。
優選的，所述方法中蛋白酶K與液體保健品樣品的比例(m V)為1 100 1 2000或者蛋白酶K與固體保健品樣品的比例(m m)為1 20 1 100 ；水解溫度控制在40 55 °C。
優選的，所述方法中蛋白酶XIV與液體保健品樣品的比例(m V)為1 100 1 2000，蛋白酶XIV與固定保健品樣品的比例(m m)為1 20 1 100 ；水解溫度控制在30 45 °C。
優選的，所述方法中水解處理后樣品溶液在0 10°C下，離心處理后上清液過 0. 2 0. 5 μ m的濾膜，制得待測上清液。
優選的，所述方法中高效液相色譜法和氫化物發生——原子熒光光譜法聯用時液相色譜及原子熒光條件為
流動相(4(toimol/L(NH4)2HP04，pH6. 0)；流速 lmL/min ；進樣體積 100 μ L ；蠕動泵轉速65rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/min ； 屏蔽氣流速700mL/min。
優選的，所述方法中高效液相色譜法和氫化物發生——原子熒光光譜法聯用時氫化物發生條件是
還原劑成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化劑成分0. 35 %Na0H+0. 8% H2O2，流速6mL/min ；載流10% HCl，流速6mL/min。
優選的，所述方法開機后對液相色譜及原子熒光進行設置，待儀器穩定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內即認為為該待測定物質。
本發明涉及一種富硒保健品中硒形態的測定方法，是利用超聲提取后，再結合溫和的酶水解，使富硒保健品中的含硒化合物充分水解以利于硒形態的測定。所述的以硒代氨基酸為主要硒形態指標的前處理方法，其步驟描述如下
(1)先移取混勻或稱取研磨過篩的富硒保健品于塑料離心管中，加入提取緩沖液 Tris-HCl (100mmOl/L，pH7. 5)，混勻。液體富硒保健品與提取液的比例(V V)為1 5 1 10，固體保健品與提取液的比例(m V)為1 25 1 100 ；
(2)將混合液放入超聲清洗器超聲提取10 30min ；
(3)再加入蛋白酶K，50°C條件下恒溫振蕩(轉速150 200rpm，使塑料離心管中的液體能充分振蕩)提取4 12h。蛋白酶K與液體樣品的比例(m V)為1 100 1 2000，蛋白酶K與固體樣品的比例(m m)為1 20 1 100;
(4)再加入蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩(轉速150 200rpm，使塑料離心管中的液體能充分振蕩)提取4 12h。蛋白酶XIV與液體樣品的比例(m V)為1 100 1 2000，蛋白酶XIV與樣品的比例(m m)為1 20 1 100;
(5)將1 4步中獲得的溶液在4°C下，以轉速10000轉/分離心30min，取上清液過0. 22 μ m的濾膜，得到待測的溶液。
(6)設定液相色譜及原子熒光條件
流動相(40mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0)；流速 lmL/min ；進樣體積 100 μ L ；蠕動泵轉速65rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/ min ； 屏蔽氣流速700mL/min。
氫化物發生條件
還原劑成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化劑成分0. 35 % NaOH+O. 8% H202，流速6mL/min ；載流10% HCl，流速6mL/min。
(7)開機后按上述條件對液相色譜及原子熒光進行設置，待儀器穩定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內即認為為該待測定物質。
(8)用峰高或峰面積進行定量，用數據處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標校正，即可得到待測溶液中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys) Je (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的濃度。
(9)按照公式(1)可計算得到待測樣品中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的濃度。
X = CXV/m ..................(1)
式中
X-樣品中待測物質的含量，單位為微克每千克(μ g/kg)；
C-待測液中該物質的濃度，單位為微克每升(μ g/L)；
V—測定液體總體積，單位為毫升(mL)；
F-稀釋倍數；
m-稱樣質量(體積)，單位為克(g/mL)。
本發明利用溫和的提取方式，超聲提取含硒化合物后再多種酶結合使用使含硒化合物徹底水解，這樣不僅使用的酶用量少，成本低廉而且水解效果好。此方法的優點是簡單易操作，提取效率高，重復性好，成本低，所用試劑無毒、無污染。
相比現有技術，本發明具有以下有益效果
1、選擇溫和的提取試劑pH近中性的Tris-HCl，使含硒化合物在提取過程中形態保持穩定。
2、提取過程中采用超聲提取，使含硒化合物更多的溶入提取液中，提高了提取效率。
3、超聲提取在加酶之前，一是不破壞酶的結構，影響酶的活性，二是使含硒化合物更多的溶入提取液后，更利于酶的水解。
4、使用2種蛋白酶水解，含硒化合物水解更徹底，與1種蛋白酶水解相比提取效率提高40%以上，且提取率均可達80%以上，所需使用的蛋白酶的量更少，成本節約10倍以上。
5、本發明方法簡單易操作，重復性好，所用試劑無毒、無污染。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述
圖1為硒形態標準分離譜圖；譜圖中揭示了硒代胱氨酸(％-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、％ (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的依次出峰順序、保留時間及濃度梯度。
圖2為本發明實施例1某知名品牌的富硒保健品的測定結果圖；由圖2可知，采用本發明的提取條件及利用高靈敏度的形態分析儀器可測定該品牌的富硒保健品存在4種硒形態，根據峰面積計算可得到各形態的含量及占總硒的比例。
圖3為本發明實施例2某品牌硒酵母片的測定結果圖；由圖3可知，采用本發明的提取條件及利用高靈敏度的形態分析儀器可測定該品牌硒酵母片中僅存在兩種硒氨基酸形態，根據峰面積計算各形態的含量及占總硒的比例。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不能用來限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件作進一步調整，未說明的實施條件通常為常規實驗中的條件。
目前，市場上的富硒保健品種類繁多，因其在生產過程中添加的硒源(無機硒源或有機硒源)及量不同，最終的富硒保健品中硒的含量及存在形式也存在很大的差別，市場上富硒保健品中硒的含量和硒究竟以什么樣的形式存在，消費者該如何選擇安全、有效的富硒保健品存在很多疑惑，因此對此類產品中硒含量及形態的測定也提出了更高的要求，本發明選擇了占國內富硒保健品市場份額較高的產品進行了測定。
實施例1某知名品牌的富硒保健品(液體)中硒形態測定
對某知名品牌的富硒保健品(液體)的硒形態測定前處理方法步驟進行了優化， 優化過程及結果如下
移取ImL富硒保健品于15mL塑料離心管中，加入5mL提取緩沖液Tris-HCl，超聲提取15min，加入Img蛋白酶K，50°C，恒溫振蕩培養他，再加入Img蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩培養他后4°C下，每分鐘轉速10000轉，離心30min，上清液過0. 22 μ m的濾膜后，制備得到上機待測液。將液相色譜條件設置為流動相(40mmol/L(NH4)2HP04，pH 6.0)；流速ImL/ min ；進樣體積100 μ L ；蠕動泵轉速65rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/min ；屏蔽氣流速700mL/min。氫化物發生條件設置為還原劑成分0. 35% NaOH+1. 2% NaBH4，流速:6mL/min ；氧化劑成分0. 35% Na0H+0. 8% H202，流速 6mL/min ；載流10% HCl，流速6mL/min。
開機后按上述條件對液相色譜及原子熒光進行設置，待儀器穩定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內即認為為該待測定物質。
用峰高或峰面積進行定量，用數據處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標校正，即可得到待測溶液中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸GeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的濃度。并根據公式計算樣品硒形態數據。
表1優化條件篩選及效果
超聲時間(min)O 5 10 15 20 30 40 60~
權利要求
1.一種富硒保健品中硒形態的測定方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)富硒保健品的預處理使用提取緩沖液Tris-HCl對富硒保健品樣品進行提取，提取處理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取得到待測樣品溶液；(2)采用氫化物發生——原子熒光光譜法與高效液相色譜法聯用分別對標準硒形態溶液和待測樣品溶液進行測定；用峰高或峰面積進行定量，用數據處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標法校正，按照公式(1)可計算得到待測樣品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；X=CXV/m (1)其中X為樣品中待測物質的含量，單位為微克每千克(μ g/kg);C為待測液中該物質的濃度，單位為微克每升(μ g/L);V為測定液體總體積，單位為毫升(mL); F為稀釋倍數； m為稱樣質量(體積)，單位為克(g/mL)。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取緩沖液Tris-HCl的濃度為100 mmol/L,pH7. 5，液體保健品樣品與提取液的比例(V: V)為1 5 1 10或者固體保健品樣品與提取液的比例(m:V)為1:25 1:100。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取方法采用超聲提取，提取時間為1(T30 min。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶K與液體保健品樣品的比例(m:V)為1 :10(Tl :2000或者蛋白酶K與固體保健品樣品的比例(m:m)為1 :2(Tl :100 ； 水解溫度控制在40 55°C。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶XIV與液體保健品樣品的比例(m:V)為1 :10(Tl :2000，蛋白酶XIV與固定保健品樣品的比例(m:m)為1 :2(Tl 100 ；水解溫度控制在30 45°C。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中水解處理后樣品溶液在0 10°C下，離心處理后上清液過0. 2 0. 5 μ m的濾膜，制得待測上清液。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色譜法和氫化物發生——原子熒光光譜法聯用時液相色譜及原子熒光條件為流動相(40 mmo VL(NH4)2HPO4, pH 6. 0)；流速 1 mL/min ；進樣體積 100 μ L ；蠕動泵轉速65 rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/ min ； 屏蔽氣流速700mL/min。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色譜法和氫化物發生——原子熒光光譜法聯用時氫化物發生條件是還原劑成分0. 35%Na0H+l. 2%NaBH4,流速6 mL/min ；氧化劑成分 0. 35%Na0H+0. 8%H202，流速6 mL/min ；載流10% HCl，流速6 mL/min。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述方法開機后對液相色譜及原子熒光進行設置，待儀器穩定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2 )、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys )、k (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2.6 min, 3. 2 min, 4.0 min, 5.0 min，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se_Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內即認為為該待測定物質。
全文摘要
本發明公開了一種富硒保健品中硒形態的測定方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)富硒保健品的預處理使用提取緩沖液Tris-HCl對富硒保健品樣品進行提取，提取處理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取得到待測樣品溶液；(2)采用氫化物發生——原子熒光光譜法與高效液相色譜法聯用分別對標準硒形態溶液和待測樣品溶液進行測定。該方法簡單易操作，重復性好，所用試劑無毒、無污染。
文檔編號G01N30/06GK102520090SQ20111042829
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者朱元元 申請人:蘇州硒谷科技有限公司