專利名稱：乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種快速定量檢測乳腺癌的Y-synuclein診斷試劑盒， 是一種通過熒光定量RT-PCR對待測樣品中的Y -synuclein進行定量檢測，以期為乳腺癌 早期篩查、預后和制定相應的治療方案提供依據。
背景技術：
乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，全世界每年約有一百多萬婦女患有乳腺癌， 發病率有逐年上升的趨勢。以往的早期乳腺癌病人多因能觸及腫塊，當腫塊較小時，常被 認為處于臨床早期，實際上這并非真正意義上的早期診斷。早期診斷應是針對在臨床上觸
及不到腫塊的乳腺癌病人而言，即亞臨床狀態。傳統的乳腺癌檢測方法主要包括X線診 斷、超聲顯象檢查、細胞學及組織學診斷等，這些方法在乳腺癌的常規檢測中起了重要 作用，但普遍不適用于真正意義的乳腺癌準確的早期診斷(胡鐵輝，海健，黃俊輝.乳腺
癌診斷新近展[J].中國醫師雜志，2003， 12: 1722-1724)。目前乳腺癌的生物診斷技術 己成為最活躍的研究領域之一。通過傳統病理形態來早期診斷乳腺癌的概念已逐步發生了 改變。隨著分子生物學、細胞生物學和免疫學研究的進展，乳腺癌的研究由細胞病理學進 入分子病理學領域，生物診斷技術成為一種很有前途的治療手段，特別是近年來人類基因 組研究取得的豐碩成果進一步推動了生物診斷技術的發展，分子病理診斷已逐歩成為乳腺 癌診斷的一個重要內容。
Y-synuclein是一種乳腺癌診斷的新標志基因，又稱乳腺癌特異性基因1 (BCSG1, breast cancer-specific gene 1)，其表達蛋白廣泛分布在神經系統的神經元突觸前末稍。 除神經系統外，正常乳腺組織或良性病變中BCSG1幾乎不表達，而多數浸潤性乳腺癌、卵 巢癌等腫瘤組織中表達異常增高。BCSG1的異常表達與腫瘤細胞的生長、浸潤及轉移相關 (Ji H ， Liu YE， Jia T， et al. Identification of a breast cancer- specific gene , BCSG1 ， by direct differential cDNA sequencing[J]. Cancer Res， 1997， 57: 759-764)。 BCSG1在乳腺癌中有很高的特異性表達，而在正常乳腺組織或良性病變中幾乎不表達，因 此檢測患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本中有無Y-synuclein的表達，可以 對乳腺癌的診斷(尤其是對腫瘤的良性和惡性的鑒別)和預后治療的提供有力證據，還可 以為腫瘤轉移和復發情況的監測提供幫助。
目前己被眾多的實驗研究和臨床觀察所證實當乳腺癌發展到大于lcm，在臨床上可 觸及腫塊時，往往已是全身性疾病，可存在遠處微小轉移灶，只是用目前的檢査方法診斷 多數乳腺癌是一種全身性疾病時，尚不能發現而已。因此，如何盡早快速、準確測定乳腺
癌的腫瘤轉移是乳腺癌治療中面臨的主要難題之一。據報道，乳腺癌必須確診方可治療， 現有的檢查方法雖然很多，但至今只有活檢所得的病理結果能作為唯一肯定診斷的依據。 國外己有報道，通過針吸活檢組織或細胞學穿刺進行乳腺可疑病變中微量DNA或RNA的提 取，并從分子水平檢測基因異常，可早期發現乳腺癌。目前常用的基因檢測方法有免疫 組織化學(IHC)、熒光原位雜交(FISH)和酶聯免疫吸附測定(ELISA)(沈坤偉，沈鎮宙.乳 腺癌研究進展，美國第23屆圣安東尼奧國際乳腺癌大會論文綜述[J].中國腫瘤，2001， 10:352-353)。 FISH能直接和準確地判斷靶基因是否存在擴增，但較為昂貴和繁瑣；免疫 組織化學因其簡便、快速、經濟，已成為最常規的檢測方法，但仍有很多缺點首先免疫 組化的判斷標準不一，使靶基因蛋白表達的檢測結果不一致，其次石蠟包埋和甲醛固定可 能會對免疫組織化學檢測結果產生一定的影響，造成假陰性。第三，采用不同公司的抗體， 檢測結果也不完全相同。此外，目前已有的乳腺癌試劑盒普遍存在操作繁瑣，特異性和敏 感性差的問題，迫切需要一種靈敏度高、速度快、特異性強的體外檢測試劑盒。近年來 RT-PCR技術被用于腫瘤檢測，敏感性比IHC提高10 100倍，在基因表達水平分析和定量 檢測等方面得到廣泛應用。實時熒光定量RT-PCR是在實時RT-PCR基礎上發展起來的一項 新技術(High-Throughput Reai-Time Reverse Transcription-PCR Quantitation of H印atitis C Virus RNA [J]. J. Clin. Microbiol, 1999， 37:327-332)其探針特異地 同目的模板結合，與其他RT-PCR技術相比，實時RT-PCR對mRNA的檢測和定量能提供更 多的信息，耗時更少，其準確性、靈敏性都大大提高。

發明內容
本發明的目的在于提供一種快速定量檢測乳腺癌的Y-synuclein診斷試劑盒，該試 劑盒不僅可使用目前市場上存在的所有類型熒光定量儀器，更重要的是能快速對乳腺癌診 斷的新標志基因Y-synuclein進行定量檢測，從而提供乳腺癌的早期診斷和預后治療的 重要輔助指標。
本發明的另外的目的在于提供這種試劑盒的使用方法。
概括的說，這種乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，包括總RNA提取液、逆轉錄反 應液、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、熒光PCR定量反應液、標準品和對照 品，其特征在于，逆轉錄反應液包括DEPC處理的滅菌雙蒸水、六聚體隨機引物p(dN)6、 5XRT緩沖液和dNTPs。 一種優選的方案是，總RNA提取液為TRizoL總RNA提取液。前述 逆轉錄反應液中六聚體隨機引物P(dN)6為100 mmol/L六聚體隨機引物p(dN)6， dNTPs 為12. 5 mmol/L dNTPs。前述熒光PCR定量反應液包括10X PCR緩沖液、引物、2mmol/L dNTPs 和SYBR Green I，所述10X PCR緩沖液包括500 mmol/L KC1、 100mmol/L Tris-HC1、7, 5mmol/L MgC12，所述引物包括具有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列反向引物。 一種優選的方案是，所述Tris-HC1的PIt9.0。
這種乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，所述標準品為SEQ ID N0:3所示的核苷酸序 列。所述對照品的陰性對照為無Y-synuclein mRNA的RNA樣品，陽性對照為含有 Y-synuclein m脂A的RNA樣品。
這種乳腺癌symjclein快速診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，包括下述步驟
(1) 設計引物——設計人Y-synuclein的具有SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的正向 引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的反向引物，以人的GAPDH為內參對照，其正向 引物和反向引物分別具有SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，
(2) 樣品總RNA的提取——用TRizoL總脂A提取液從待測樣品中提取總RNA，將所 提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-7(TC保存待用，
(3) 逆轉錄反應——l"g的總RNA用于cDNA第一鏈的合成，引物為100腿oI/L六 聚體隨機引物P(dN)6，
(4) SYBR Green I熒光定量PCR——10XPCR緩沖液2. 5 y 1， 2 mmol/L dNTPs 2. 5 y 1， 20XSYBR Green I lii 1， 12. 5 y mol/L的引物各0. 5 y 1， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 u 1 ， 逆轉錄產物5 u 1 ，反應總體積25 n 1 ，
反應條件94。C預變性l分鐘，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共40個循環， 每個循環后自動讀板l次，72°C 30秒處采集熒光信號，
每次檢驗均設陰性對照和陽性對照，標準品用滅菌雙蒸水稀釋為1x102-1x109拷貝 /ml,根據繪制的標準曲線得到y-synuclein及GAPDH基因表達的相對濃度，以 y-synuclein與GAPDH相對濃度的比值來反映y-synuclein表達量。
本發明與現有技術相比具有以下優點和效果
1、 具有極高的特異性(該檢測基因在乳腺癌中有很高的特異性表達)；
2、 可以對腫瘤的良性和惡性進行初步鑒別(該檢測基因在惡性乳腺腫瘤中有很高的 表達量，而在乳腺良性病變中幾乎不表達)；
3、 該檢測方法定量準確，具有很高的靈敏性；
4、 該檢測方法歩驟簡單，耗時短(4小時左右完成測試)；
5、 需要檢測的樣本量極少(毫克級)；
6、 可以檢測的樣本種類多(外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本均可)
7、 可同時進行高通量的樣品檢測。
具體實施例方式
一、制備本發明的乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒 1、所用到的主要試劑和儀器
TRizoL總RNA提取液(Omega公司)；200UM SuperScriptTM逆轉錄酶(Invitrogen 公司)；dNTPs 、 10U/rt TaqDNA聚合酶、40 U/W RNA酶抑制劑(Sigm公司)；20XSYBR
Green I染料(上海復興公司)；實時熒光定量PCR系統(印pendorf公司)。
2、 引物設計及合成 人Y -synuclein
PI:5' -CAAGAAGGGCTTCTCCATCGCCAAGG-3' (SEQ ID NO:1) P2: 5'-CCTCTTTCTCTTTGGATGCCACACCC-3' (SEQ ID NO:2) 內參對照為GAPDH
PI: 5'- CCATCACTGCCACCCAGAAGAC -3' (SEQ ID NO:4) P2: 5'- GGCAGGTTTTTCTAGACGGCAG -3' (SEQ ID NO:5)
3、 標準品cDNA的制備
用TRizoL總腿提取液乳腺癌患者新鮮乳腺組織中的總廳，lmg的總腿用于逆 轉錄(RT)反應，引物為六聚體隨機引物(Hexamer random primer) p(dN)6; PCR擴增目的 片段，反應條件為94。C預變性1分鐘，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共30個循 環，PCR產物以pGEM-T載體連接并轉化感受態大腸桿菌DH5a，經篩選和測序鑒定，陽性 質粒體外轉錄合成cRNA，分光光度計測A260定量后作為標準，將濃度單位換算成拷貝/ml， -2(TC保存。
二、乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒的使用方法
檢測樣本可以是患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本，每次檢驗均設陰性對 照和陽性對照，標準品用滅菌雙蒸水稀釋為1x102-1x109拷貝/ml。
1、 樣品中RNA的提取
依照使用說明書，用TRizoL總RNA提取液從待測樣品中提取總RNA。 A280/A260比值 均在1. 8-2. 0之間，所提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的28S， 18S兩條 區帶，且28S約為18S的2倍，證明其完整性.-7(TC保存待用；
2、 逆轉錄(RT)反應
1 P g的總RNA用于cDNA第一鏈的合成，引物為六聚體隨機引物(Hexamer random primer) p(dN)6;
3、 SYBR Green I熒光定量RT-PCR
優化的實時定量RT-PCR體系為10XPCR緩沖液2.5 u 1， 2畫1/L dNTP 2.5 "1， 20XSYBR Green I 1 u 1， 12.5 u mol/L的引物各0. 5 w 1， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 y 1， 逆轉錄產物5ul，反應總體積25 ul。反應條件94。C預變性1分鐘，94°C 30秒，68 °C 30秒，72°C 30秒，共40個循環(每個循環后自動讀板1次)，72°C 30秒處采集熒光信 號。PCR反應之后做68°C — _94°C的融解曲線分析，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳 分析特異性。
4、 Y -synuclein表達的相對定量分析
每次擴增時拿出1份標準品cDNA用水做10倍系列稀釋，分別對Y-synuclein和 ]3-actin進行實時定量擴增，制作各自的標準曲線。標準曲線相關系數r〉0.99的定量結
果認為可靠。根據繪制的標準曲線得到Y-synuclein及GAPDH基因表達的相對濃度，以 Y-synuclein與GAPDH相對濃度的比值來反映Y-synuclein表達量，每個樣品做3個平 行管。
Y-synuclein在乳腺癌中有很高的特異性表達，而在正常乳腺組織或良性病變中幾 乎不表達，因此檢測患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本中有無Y-synuclein 的表達，可以對乳腺癌的診斷(尤其是對腫瘤的良性和惡性的鑒別)和預后治療的提供重 要的輔助指標。
SEQUENCE LISTING
<110> 山東大學
<120>乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒 <130>乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒
<160> 5
<170> Patentln version 3.3
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 人工合成
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caagaagggc ttctccateg cca鄉
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>人工合成
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<213> Homo sapiens
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ctca3gcccg c昭ctcgcag ggag3tccag ctccgtcctg cctgc昭cag cccaaccctg 60
cacacccacc atggatgtct tcaagaaggg cttctecatc gccaaggagg gcgtggtggg 120
tgcggtggaa aagaccaagc agggggtgac ggaagcagct gagaagacca鄉agggggt 180
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權利要求
1、乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，包括總RNA提取液、逆轉錄反應液、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、熒光PCR定量反應液、標準品和對照品，其特征在于，逆轉錄反應液包括DEPC處理的滅菌雙蒸水、六聚體隨機引物p(dN)6、5×RT緩沖液和dNTPs。
2、 權利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述總RNA提 取液為TRizoL總RNA提取液。
3、 權利要求1-2任一所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述逆 轉錄反應液中六聚體隨機引物P(dN)6為100 mmol/L六聚體隨機引物p (dN) 6， dNTPs為 12.5 mmol/L dNTPs。
4、 權利要求1所述乳腺癌sy皿clein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述熒光PCR 定量反應液包括10XPCR緩沖液、引物、2腦ol/L dNTPs和SYBR Green I，所述10 X PCR 緩沖液包括500 mmol/L KC1、 100mmol/L Tris-HC1、 7. 5咖ol/L MgCl2，所述引物包括具 有SEQ ID N0:1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID N0:2所示核苷酸序列的反向引 物，以人的GAPDH為內參對照，其正向引物和反向引物分別具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5 所示的核苷酸序列。
5、 權利要求4所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述Tris-HCl 的PH=9. 0。
6、 權利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，其特征在于，所述標準品為 SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
7、 權利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，所述對照品的陰性對照為無 Y -synuclein mRNA的脂A樣品，陽性對照為含有Y -synuclein mRNA的RNA樣品。
8、 權利要求1所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，包 括下述歩驟(1) 樣品總RNA的提取——用TRizoL總RNA提取液從待測樣品中提取總RNA，將所 提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，-7(rC保存待用，(2) 逆轉錄反應——lwg的總RNA用于cDNA第一鏈的合成，引物為100咖ol/L六 聚體隨機引物p(dN)6，(3) SYBR Green I熒光定量PCR——10XPCR緩沖液2. 1， 2咖ol/L dNTPs 2. 5 y 1， 20XSYBR Green I 1 U 1， 12. 5 " mol/L的引物各0. 5 y 1 ， 10 U/u 1的Taq酶0. 2 u 1 ， 逆轉錄產物5 u 1 ，反應總體積25 li 1 ，反應條件94。C預變性l分鐘，94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 30秒，共40個循環， 每個循環后自動讀板l次，72°C 30秒處采集熒光信號，每次檢驗均設陰性對照和陽性對照，標準品用滅菌雙蒸水稀釋為lxl(f-lxl(T拷貝/ml， 根據繪制的標準曲線得到Y -synuclein及GAPDH基因表達的相對濃度，以Y -synuclei.n 與GAPDH相對濃度的比值來反映Y -synuclein表達量。
9、權利要求1-2， 4-7任一所述乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒在診斷乳腺癌中的 應用。
全文摘要
本發明公開了乳腺癌synuclein快速診斷試劑盒，包括總RNA提取液、逆轉錄反應液、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Taq DNA聚合酶、熒光PCR定量反應液、標準品和對照品，其特征在于，逆轉錄反應液包括DEPC處理的滅菌雙蒸水、六聚體隨機引物p(dN)6、5×RT緩沖液和dNTPs。該試劑盒克服了傳統方法中存在的不足，可有效方便地對標本中synuclein進行精確定量。該試劑盒可用于臨床和科研中檢測患者的外周血、腫瘤組織、乳腺分泌液等標本中synuclein的表達，以期為今后乳腺癌早期篩查、預后和制定相應的治療方案提供依據。
文檔編號G01N21/00GK101187626SQ20071011525
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月12日 優先權日2007年12月12日
發明者瑤 劉, 屈慶春 申請人:山東大學