用于檢測病原體物質，特別是支持敗血癥診斷的速測法和實施敗血癥檢測的試劑盒和裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于檢測病原體物質，特別是用于支持敗血癥的診斷的速測法，其包括在使來自樣品的目標分子能夠與至少一種檢測分子結合的條件下使所述樣品與所述至少一種檢測分子接觸的步驟，以及驗證目標分子是否已經與所述至少一種檢測分子結合的進一步步驟。本發明還涉及用于實施敗血癥測試的試劑盒和裝置。
【背景技術】
[0002]敗血癥和嚴重敗血癥的診斷標準對應于ACCP/SCC共識會議標準。這包括:(I)通過顯微鏡檢測或通過臨床標準檢測感染；(2)確定嚴重炎癥熱響應(SIRS)，其中必需滿足下列標準中的至少2個:
[0003]-發燒(238°C)或低溫 U36°C)
[0004]-心臟心悸(心動過速):心臟頻率290/分鐘。
[0005]-過度呼吸頻率(呼吸急促)或過度換氣，
[0006]-白細胞水平增高(白細胞增多)或
[0007]-白細胞下降(白細胞減少)；
[0008]以及(3)檢測具有下列標準中的至少一種的急性有機功能障礙:
[0009]-腦的急性病理改變(腦病):限制警惕(restrictedvigilance)，定向障礙，煩躁，精神錯亂，
[0010]-血小板減少:血小板的數目在24小時內減少超過30%或血小板的數目<100，000/mm3,
[0011]-血氧水平降低(動脈血氧不足)
[0012]-腎衰竭(腎功能不全)
[0013]-血的酸過多(代謝性酸中毒)。
[0014]在敗血癥的過程中，頻繁發生重要功能的威脅生命的中斷和一個或多個器官的衰竭以及患者的最終死亡。重癥監護醫學可以通過臨時補償或支持器官功能來渡過關鍵的階段。然而，這只有在及時檢測到出現敗血癥的情況下才可能。如果已經出現敗血癥的明顯癥狀諸如體溫、心臟速率或呼吸頻率增加，可能已經耽誤了成功治療。
[0015]—旦出現明顯的癥狀并且懷疑患有敗血癥，將進行檢查以例如在血培養中檢測病原體。然而，在血培養中檢測病原體需要至少24，甚至48小時。由于在疑似敗血癥的情況下這個等待時間太長，對特別重癥監護患者預防性而不是針對性地施用廣譜抗生素，以希望其對該病原體有效。
[0016]此外，存在用于為早期檢測敗血癥確定降鈣素原的生物標記檢查。但是，降鈣素原的確定只可用于確認存在普通感染的增加的風險。這樣的檢測，反過來，不能代替特定病原體檢測方法并且不總是能夠證實敗血癥診斷，因為根據不同的病原體，即便在降鈣素原的濃度正常、不顯著的情況下也可能出現敗血癥。
[0017]因此，本發明基于的目的是提供能夠早期識別敗血癥的病原體，檢測敗血癥病原體，確定它們的致病狀態和/或進一步表征致病細菌的速測法和裝置。

【發明內容】

[0018]本發明通過用于檢測病原體物質的速測法解決了此問題，其包括以下步驟:
[0019]-在使目標分子能夠與至少一種檢測分子結合的條件下使樣品與所述至少一種檢測分子接觸，所述至少一種檢測分子特異性結合群體感應目標分子和/或群體感應相關目標分子;和
[0020]-驗證目標分子是否已經結合到所述至少一種檢測分子。
[0021]根據本發明的裝置通過包括至少一個檢測區域解決所述問題，所述至少一個檢測區域具有特異性地結合群體感應目標分子和/或群體感應相關目標分子的檢測分子。根據本發明的試劑盒通過包括特異性結合群體感應目標分子和/或群體感應相關目標分子的至少一種檢測分子，和緩沖液，清洗試劑和/或發出可測量的信號的檢測試劑解決所述問題。令人驚訝地是，發明人已經發現，群體感應分子和/或群體感應相關目標分子的濃度增加是敗血癥風險的一個重要指標，并且敗血癥的病原體及其致病狀態可通過檢測群體感應目標分子和/或群體感應相關目標分子來確定。本發明能夠比以前更快和更特異性地證實敗血癥診斷以及進一步表征它們的病原體。可檢測的群體感應與例如發熱和低血壓一起比發燒、血壓和任何炎癥參數更有特異性。這使得重癥監護病房和甚至門診監護病房的執業醫師能夠為治療敗血癥采取有針對性的措施，從而避免了預防性地施用針對所有可能的敗血癥病原體的廣譜抗生素。根據本發明的速測法和根據本發明的方法尤其能夠通過確定病原體的革蘭氏狀態和致病性實現感染的檢測。
[0022]根據本發明的裝置特別適合作為靠近患者的實驗室診斷工具(定點照護檢測)，即支持可以直接接近患者實施的診斷檢查，例如，在醫院的重癥監護病房，在門診監護病房或在緊急情況下在患者的公寓中或在救護車中，而不是在中心實驗室中。
[0023]—種速測法包括可以直接接近患者實施的檢查并且其結果可以在最多兩個小時內獲得，優選小于一小時，優選在最多15分鐘內。
[0024]就本發明的意義而言的特異性結合是親和力非常高的結合，其具有至少14摩爾―1，優選至少為15摩爾—I特別是大于16摩爾―1的締合常數(也稱為結合常數)。
[0025]群體感應目標分子是與細菌，酵母和真菌通信的分子。群體感應相關目標分子是由于群體感應分子濃度增加而以加強的方式產生的物質和/或相比于具有和/或不具有低濃度的群體感應分子的環境而改變功能和/或結構的物質。
[0026]可以以許多不同的方式驗證目標分子是否已經與所述至少一種檢測分子結合，例如通過比色、電或化學方法，這將在下面更詳細地提出。如果驗證表明群體感應目標分子和/或群體感應相關目標分子已與至少一種檢測分子結合，即，其已被包含在樣品中，存在敗血癥的情況。
[0027]可以通過如下所述的各自彼此獨立并且各自本身有利以及可以以任何方式彼此結合的一系列的進一步發展進一步改進本發明。
[0028]根據第一實施方案，根據本發明的試劑盒可包括根據本發明的裝置和/或可以在根據本發明的速測法過程中使樣品與根據本發明的裝置接觸。
[0029]根據另一個有利的實施方案，所述至少一種檢測分子可以是抗體、抗體的特異性結合片段、抗原、肽、蛋白質、核酸、適體、配體、受體、半抗原、酶、酶抑制劑、酶底物或酶的輔助因子的。在根據本發明的裝置/試劑盒和/或根據本發明的速測法中使用這種檢測分子能夠結合和檢測具有所需的特異性親和力的目標分子。當使用這種檢測分子時，也可能通過所建立的測定法例如免疫測定或酶測定和/或酶分析來驗證目標分子是否與所述至少一種檢測分子結合。
[0030]血樣、尿樣、痰樣、淋巴液樣品或其它體液樣品可以用作通過根據本發明的速測法測試敗血癥的存在的樣品。可以將所述樣品直接放置在根據本發明的裝置上，即不進行樣品制備，和/或可以在實施根據本發明的速測法時直接與至少一種檢測分子接觸。樣品制備方法例如不需要的樣品組分的過濾或沉淀或樣品材料的崩解根據本發明也是可能的并且可以在適當的環境中積極地影響根據本發明的裝置和試劑盒和/或根據本發明的速測法的結果。
[0031]在另一個實施方案中，根據本發明的方法可以包括開始接觸和驗證結合之間的中間步驟，其中移除非結合的樣品材料。為此目的，通過連接分子和/或聚合物基體可以直接或間接地將檢測分子固定在載體上。例如，測試條、測試棒、微滴定板、生物芯片、微陣列基板、以及導管、套管或信號轉換器可用作載體材料。在施用樣品之后，可以用洗滌溶液處理具有固定的檢測分子的裝置，并且在驗證目標分子是否已經與至少一種檢測分子結合之前洗掉未鍵合的樣品物質。測試條和測試棒具有在施用樣品之后自動進行檢查的優點，因為樣品流體由于載體帶和/或棒例如硝酸纖維素膜中的毛細管力被輸送到相關試劑和檢測區域。作為載體的微滴定板、生物芯片和微陣列基板的優點在于根據本發明的裝置緊湊但同時能夠配備有多個檢測區域。例如，微滴定板的各孔可形成單獨的檢測區域。
[0032]根據本發明的裝置可以不管其載體和/或檢測分子在載體上的固定化而包括至少兩個檢測區域，由此檢測分子在每個檢測區域中特異性地結合不同的群體感應目標分子和/或群體感應相關目標分子。這樣，可以改進根據本發明的速測法、試劑盒和/或裝置的信息值，因為可以檢測多于一種的目標分子，所述目標分子的存在是對于敗血癥和/或對于特定的病原體所特有的指標。
[0033]如果導管或套管用作根據本發明的裝置的載體，該測試可以特別迅速地實施，幾乎是實時的，因為在這種情況下正確使用套管和/或導管期間必然使血樣與檢測分子在載體上接觸。
[0034]通過檢測分子固定在信號轉換器上，例如生物傳感器的信號轉換器，可以促進檢測分子和目標分子之間的結合的驗證。信號轉換器將檢測分子和目標分子之間的結合轉變為可以隨后例如通過有線或無線信號線發送并由相關測量單元讀出的結合信號。作為載體，可以使用例如電化學信號轉換器、光信號轉換器、聲信號轉換器、電信號轉換器、熱信號轉換器、壓電信號轉換器或生物化學信號轉換器。穩固并且能