專利名稱：一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒。系一種用抗乳腺球蛋白單克隆抗體標記的乳膠顆粒通過乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法。
背景技術：
乳腺癌是婦女常見的惡性腫瘤，占所有女性惡性腫瘤的22％。全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳腺癌。在西歐、北美等發達國家，乳腺癌發病率占女性惡性腫瘤首位。乳腺癌在發達國家的發病率是貧窮國家的兩倍。據1992-1996年統計，在美國乳腺癌的發病率是110.6/10萬人。雖然亞洲是乳腺癌低發區，但是，我國乳腺癌的發病率也正在逐年上升。用世界標準人口調整計算的發病率1982年到1984年時，上海僅為10萬分之19，而1988年到1992年已升至10萬分之25.6。目前抽樣調查到的天津、北京、哈爾濱、武漢等地的發病率都占到當地女性惡性腫瘤的第一或第二位；而死亡率都為女性惡性腫瘤的第四或第五位。我國乳腺癌特點，除發病率逐年增長外，在發病年齡上，與西方國家有明顯差別。從30歲以后就開始增加，發病年齡高峰在40-49歲，比西方婦女早10-15年，以中年人居多，這個時期婦女處于最佳工作年齡狀態，因此乳腺癌發病率的增加無疑會對社會及家庭產生巨大影響。由于經濟文化發展的限制，我國乳腺癌病人就診時的病期相對偏晚，術前偏晚的III、IV期病人的比例約為30％，而同期美國約為15％。病期越晚，治療越加困難。
降低乳腺癌死亡率的根本途徑在于臨床早期診斷。傳統的乳腺癌早期診斷包括乳房檢查、X線檢查、CT檢查、活體組織檢查及血清乳腺癌腫瘤標志物檢查。前三種方法或者陽性率低，檢查方法繁瑣，費用昂貴；或者對病人有侵入性。早期、簡單、便宜，及非侵入的乳腺癌血清腫瘤標志物檢查不失為最佳方法，特別是在中國這樣的發展中國家，人們還負擔不起昂貴的乳癌檢測費用。
在癌變過程中，由腫瘤細胞產生、分泌的細胞組織成份以蛋白質、DNA或mRNA的形式存在于病人的血液中，這類物質稱腫瘤標志物。現在已知的與乳腺癌有關的腫瘤標志物有(1)癌胚抗原(CEA)為非特異性抗原，在許多來源于上皮腫瘤及某些非腫瘤疾病血清中都有升高，無鑒別診斷價值，可作為乳腺癌患者術前檢查的一項指標，約有20％～30％乳癌病人血中CEA含量升高，晚期及轉移性入癌患者中則有50％～70％出現CEA高值；(2)鐵蛋白血清鐵蛋白反映體內鐵的儲存狀態，在很多惡性腫瘤如白血病、胰腺癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌患者血清中都有鐵蛋白的升高；(3)CA15-3對乳腺癌診斷符合率為33.3％～57％。它們都不是乳腺癌特異性的腫瘤標記物，因而不能用于乳腺癌的血清鑒別診斷。
美國學者于1998首先發現乳腺球蛋白基因(SEQ ID NO4)，乳腺球蛋白基因定位于染色體11q12.2上。乳腺球蛋白由93氨基酸組成(SEQ ID NO5)，分子量大約10.5kDa，與人類克拉拉細胞(Clara cell)分泌的子宮珠蛋白/親脂蛋白〔uteroglobin/lipophilin〕有關(Watson M.A.等，《腫瘤基因》(Oncogene)16817-824，1998)。正常乳腺腺上皮分泌微量的乳腺球蛋白，正常女性血清乳腺球蛋白的濃度與妊辰，哺育及良性乳腺增生性疾病有關。正常西方人血清乳腺球蛋白的濃度為0.1-0.4μg/L。血清中乳腺球蛋白的濃度升高與腫瘤臨床分期及腫瘤大小有關。乳腺癌組織分泌大量的乳腺球蛋白，乳腺癌病人血清乳腺球蛋白的濃度一般高于1.7μg/L。研究表明乳腺球蛋白是迄今為止檢測人類乳腺癌的最好的標志(Zehentner BK and Carter D，《臨床化學》(Clin Chem)，37249-57，2004；Gillanders WE，Mikhitarian K，HebertR等，《外科年鑒》(Ann Surg)，239828-37，2004.)。
Watson及Fleming利用RT-PCR方法研究乳腺球蛋白在乳腺癌組織內的表達發現與正常人乳腺組織比較，23％乳腺癌內有10倍以上的乳腺球蛋白表達(Watson M.A.and Fleming T.P.《癌癥研究》(Cancer Res)，56860-865，1996)。在最近的一項研究中，Leygue等用原位雜交方法(FISH)發現乳腺球蛋白只在乳腺上皮細胞內表達而不在間質細胞及炎癥細胞內表達(Leygue E.等，《病理學雜志》(J.Pathol.)，18928-33，1999)。Nunez-Villar等利用RT-PCR方法檢測乳腺球蛋白mRNA在乳腺癌內的表達，發現乳腺球蛋白的高表達與雌激素及孕激素在乳腺癌的表達有關。他們還發現乳腺球蛋白在乳腺癌內的表達與腫瘤的分化及愈后有關即分化好的乳腺癌表達高水平的乳腺球蛋白(Nunez-Villar MJ，Martinez arribas F，Pollan M，Lucas AR，Sanchez J，Tejerina A，等，《乳腺癌研究》(Breast Cancer Res)，565-70，2003)。研究人員在對100例原發乳腺癌做免疫組織化學檢測后發現，81例呈陽性反應(81％)。當乳腺球蛋白免疫組織化學與另一乳腺癌標志GCDFP-15結合，檢測的陽性率可以高達84％。因此乳腺球蛋白免疫組織化學可以作為檢測原發乳腺癌的標志(Watson M.A.等，《癌癥研究》(Cancer Res.)，593028-3031，1999；Fanger GR等，《腫瘤生物學》(Tumour Biol.)，23212-21，2002；WherlingRW等，《現代病理學》(Modern Pathology)15(1)56A，2002)。
研究發現乳腺球蛋白是迄今為止最好的PCR檢測淋巴結內乳腺癌轉移的標志。用乳腺球蛋白RT-PCR方法檢測淋巴結及乳腺原發癌發現，所有13例組織學淋巴結陽性的乳腺癌病人的守衛(sentinel)淋巴結內有乳腺球蛋白mRNA，而7例組織學陰性守衛淋巴結內沒有乳腺球蛋白mRNA的表達。利用RT-PCR方法還發現119例組織學陰性的守衛淋巴結中有9例呈陽性；247例組織學陰性正常淋巴結有13例呈陽性。乳腺球蛋白免疫組織化學研究發現11例有乳腺癌轉移的淋巴結病例中的10例表達乳腺球蛋白；而陰性淋巴結內沒有乳腺球蛋白的表達(Min CJ等，《癌癥研究》(Cancer Res.)，584581-4584，1998；Zehentner BK等，《臨床化學》(Clin Chem.)，481225-31，2002；BranaganG等，《英國外科雜志》〔Br J Surg)，8986-9，2002；Leygue E等，《病理學雜志》〔J.Pathol.〕，18928-33，1999；Gillanders WE等，《外科年鑒》(AnnSurg)239828-37，2004)。
晚期乳腺癌的特徵就是癌細胞經血液轉移到身體的其它部位。利用RT-PCR方法檢測27例健康女性血液乳腺球蛋白的表達發現所有27例全是陰性；而114例乳腺癌病人有29例檢測到乳腺球蛋白mRNA的存在(25％)。所有27例陽性病人都有血漿CEA水平下降。而沒有乳癌轉移的病人血漿CEA水平也下降。總之，乳腺球蛋白對周圍血乳癌細胞的特異性要高于CEA或細胞角質蛋白19(兩種常用的周圍血乳癌細胞標志)(Zach O等，《臨床腫瘤學雜志》(J.Clin.Oncol.)，172015-2019，1999；Carter D等，《臨床癌癥研究》(Cancer Res.)9749-54，2003；Gal S等，《紐約科學院年鑒》(Ann N Y Acad Sci.)945192-4，2001；Grunewald K等，《 》(Lab.Invest.)801071-1077，2000；Zehantner BK等，《臨床化學》(Clin Chem)，37249-57，2004)。Zehantner等發現77％乳癌病人血清有乳腺球蛋白mRNA的表達。
乳腺球蛋白通常在正常乳腺組織表達很低，而在乳腺癌組織內高表達。Zehentner(2004)研究142乳癌病人的血清乳腺球蛋白發現100例(70％)陽性(Zehantner BK等，《臨床化學》(Clin Chem)，37249-57，2004)。血清的乳腺球蛋白濃度隨腫瘤的大小、臨床分期而變化。乳腺球蛋白在結腸癌、肺癌、卵巢癌及前列腺癌組織內均不表達。因此可以利用乳腺球蛋白發展一種高靈敏度的ELISA方法來早期檢測乳腺癌。但是這方面的研究還是空白(Fanger GR等，《腫瘤生物學》(Tumour Biol.)，23212-21，2002；Han JH等，《 》(Archpathol Lab Med.)1271330-7，2003)。
綜上所述，乳腺球蛋白的表達具有乳腺組織特異性，其基因表達的失調對于乳腺癌的早期鑒別具有重要意義，可以作為乳腺癌的標志物。通過對外周淋巴結和外周血中乳腺球蛋白轉錄產物的分析，對于檢測隱匿的乳腺癌轉移同樣具有指示性意義。
中國專利申請(申請號CN 98809313)公開了一種用免疫印跡法檢測乳腺球蛋白的方法，該方法可以用于乳腺球蛋白的定性檢測，每次試驗能夠處理的樣本數量受制于電泳印跡設備的限制，而且試驗所需時間較長。目前尚缺乏快速高靈敏度的定性檢測乳腺球蛋白的方法和可以全定量和/或半定量檢測乳腺球蛋白的方法。

發明內容
發明人已經進行了廣泛的研究，以提供一種高度靈敏的可以定量和/或半定量的檢測乳腺球蛋白的方法，該目的可以通過乳膠凝集抑制法和雙夾心酶聯免疫吸附法實現。進而發明人對此兩種方法及其檢測試劑盒進行了廣泛的研究。
因而，本發明所要解決的技術問題之一是提供一種檢測乳腺球蛋白的方法以克服現有技術中存在的處理樣本數量少、定性檢測時間長及不能定量測定乳腺球蛋白的技術缺陷。
本發明所要解決的技術問題之二是提供一種檢測乳腺球蛋白的試劑盒，使上述檢測乳腺球蛋白的方法更加方便實施。
本發明的構思是這樣的根據免疫學凝集抑制試驗的原理，乳腺球蛋白抗原能夠與結合了抗乳腺球蛋白抗體的乳膠顆粒結合，因而含有乳腺球蛋白抗原的樣本就會發生凝集反應，可以用于定性或半定量測定乳腺球蛋白。雙夾心酶聯免疫吸附法廣泛用于抗原檢測，可以用于乳腺球蛋白的定量測定。另外對該乳腺球蛋白檢測方法的試劑盒進行研究。
本發明提供了乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法，包括如下步驟a)將抗乳腺球蛋白抗體標記的乳膠顆粒與待測樣本混合，和b)根據是否出現凝集反應判定檢測結果。
抗乳腺球蛋白抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。制備抗乳腺球蛋白抗體的方法在本領域是已知的。例如用提純的天然乳腺球蛋白來免疫兔或鼠產生專一性的抗乳腺球蛋白單克隆漿細胞株，單克隆漿細胞株再與骨髓瘤細胞融合，得到骨髓雜交瘤細胞。骨髓雜交瘤細胞在經過反復的篩選克隆便可以產生針對乳腺球蛋白有特異性的單克隆細胞株。培養該單克隆細胞株，用本領域技術人員熟知的技術檢測培養上清中有無抗乳腺球蛋白單克隆抗體產生。所謂天然的意思是乳腺球蛋白可以從天然來源(如正常或病變生物體)中分離得到并未經人工改造。
優選地，本發明使用的抗乳腺球蛋白單克隆抗體為RO28或RO48。該抗體使用權由申請人在美國的公司(ZETA CORPORATION)從美國CORIXA公司獲得。
待測樣本的含義指其可以是組織活檢樣品或血液、血漿、血清等，根據需要也可以對其進行處理。優選地，本發明的待測樣本是血清。
優選地，乳膠凝集法檢測乳腺球蛋白的方法，包括如下步驟a)用抗乳腺球蛋白抗體RO28或RO48標記乳膠顆粒；b)將標記的乳膠顆粒保存在HEPES緩沖液內(pH8.2)；c)以乳腺球蛋白抗原為陽性對照，正常健康女性血清為陰性對照；d)等體積的待測樣本、陰性對照和陽性對照分別與同一體積的標記乳膠顆粒混合、反應；和e)根據是否出現凝集反應判定檢測結果。
優選地HEPES緩沖液含有0.2g/L疊達鈉。
本發明提供了用于乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的試劑盒。該試劑盒包含包裝于容器中的抗乳腺球蛋白抗體、乳腺球蛋白抗原、正常健康女性血清陰性對照和乳膠顆粒。
優選地上述試劑盒所述之抗乳腺球蛋白抗體是RO28或RO48。所述的乳腺球蛋白抗原是天然乳腺球蛋白。所述的乳膠顆粒直徑為2-10μm，優選地其直徑為2μm。優選地該試劑盒還包括具有小池的試驗板，如有試驗池的玻片。更優選地該試劑盒還包括包裝于容器中的HEPES緩沖液和包裝于容器中的PBS緩沖液。
另一方面，本發明提供了一種雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法。該方法包括如下步驟a)使抗乳腺球蛋白抗體(包被抗體)與固相載體結合形成固相抗乳腺球蛋白抗體；b)去除未結合抗乳腺球蛋白抗體及其它雜質；c)封閉固相抗體；d)向每份固相抗體加入乳腺球蛋白抗原標準品和待測樣本，反應；e)去除未結合部分；f)加入標記的抗天然乳腺球蛋白抗體(酶標抗體)，反應；g)洗去未結合的部分；h)加入標記的辣根過氧化酶，反應；i)洗去未結合的部分；j)加入顯色底物，反應，用50mmol硫酸終止；和k)讀數。
其中，步驟a)中的包被抗體是特異性抗乳腺球蛋白抗體，優選地是抗乳腺球蛋白單克隆抗體，更優選地是抗體RO48。
所述的固相載體可以是本領域技術人員所熟知的96孔板或其他合適的器材，如方便使用的酶標排條。
步驟f)中所述的酶標抗體可以是標記的特異性抗乳腺球蛋白抗體，優選地是標記的抗乳腺球蛋白抗體RO28。標記的含義在本領域是已知的，如用生物素標記該抗體。
步驟h)中的標記的辣根過氧化酶與f)相應，如用鏈霉素抗生物素蛋白標記辣根過氧化酶(streptoavidin-horseradish peroxidas)。
顯色底物在本領域是已知的，如可以是N-四甲聯苯胺(Tetramethylbenzidine)、ABTS即2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(2，2′-Azino-bis-(3-ethylbenztbiozoline 6-sulfonic acid)。
封閉固相抗體的封閉液在本領域是已知的，例如可以是脫脂牛奶或者動物白蛋白。
所說的乳腺球蛋白抗原是天然乳腺球蛋白。每一步驟所用的緩沖液、反應溫度及其反應時間可以根據本領域公知的知識確定。
優選地，本發明的雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法在向每份固相抗體加入等體積乳腺球蛋白抗原標準品和待測樣本時，同時加入等體積正常健康女性血清。
值得一提的是，當乳腺球蛋白抗原標準品以梯度序列加入固相抗體時，即可以定量測定待測樣本中的乳腺球蛋白，方法是用450nm光譜儀(如本領域常用的酶標儀)讀數，作出標準曲線從而計算出待測樣本中乳腺球蛋白的含量。而當僅有一個或兩個或三個乳腺球蛋白抗原標準濃度或者盡管以梯度序列加入乳腺球蛋白抗原標準但用目視檢測時，可以半定量檢測乳腺球蛋白。
本發明提供了雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法所用的試劑盒，該試劑盒包含包括于容器中的包被抗體、酶標抗體、乳腺球蛋白標準品和正常健康女性血清。優選地所說的包被抗體是抗乳腺球蛋白抗體RO48，所說的酶標抗體是標記的抗乳腺球蛋白抗體RO28，更優選地該酶標抗體是生物素標記的抗乳腺球蛋白抗體RO28。
優選地，用雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白所用的試劑盒還包括標記的辣根過氧化酶，更優選地該標記的辣根過氧化酶是鏈霉素抗生物素蛋白標記辣根過氧化酶。
實施本發明提供的檢測乳腺球蛋白的方法時，可以先用乳膠凝集抑制法檢測樣本，對呈陽性反應者再用雙夾心酶聯免疫吸附法定量測定樣本中的乳腺球蛋白含量。
MDA-MB-415細胞分泌高濃度的天然乳腺癌球蛋白，培養MDA-MB-415細胞，離心或過濾除去細胞，收集上清經過分離提取天然乳腺癌球蛋白。測定提取的大然乳腺癌球蛋白的濃度。
本發明提供的另一種檢測樣本中乳腺球蛋白表達的方法是通過反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測樣品中的乳腺球蛋白mRNA實現的。該方法包括如下步驟a)用常規方法提取樣本中mRNA，反轉錄成cDNA，b)提供兩端段PCR引物，該引物所包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中，c)用PCR擴增編碼乳腺球蛋白的cDNA，和d)檢測擴增產物。由mRNA反轉錄cDNA的方法在本領域是公知的。優選地所提供的PCR引物包含核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。按照本領域已知的技術進行PCR擴增反應進行，檢測擴增產物的方法可以是瓊脂糖電泳，也可以是用標記探針雜交，優選地該標記探針包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
優選地，檢測擴增產物可以這樣進行將標記探針用包被液點樣于平均孔徑2-10μm的高分子聚合物膜上，然后干燥之；再將該檢測膜與上述RT-PCR產物接觸，檢測RT-PCR產物是否與探針反應。包被探針和雜交試驗的條件在本領域是公知的。
在另一方面，本發明提供了RT-PCR檢測樣品中的乳腺球蛋白表達的試劑盒。該試劑盒包括包裝于容器中的兩段PCR引物，它們包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中，該兩段引物包含核苷酸序列SEQ IDNO1和SEQ ID NO2。優選地，該試劑盒還包括檢測擴增產物的雜交探針，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO3。優選地，該試劑盒還包括檢測膜，該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜。更優選地該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜，標記探針固定在該檢測膜上。
最優選地，該試劑盒還包括乳腺球蛋白cDNA陽性對照品，其核苷酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO4。
乳腺球蛋白的表達具有組織特異性，是乳腺癌的特異性標記物，而且其基因表達的失調在乳腺癌的早期即已發生，因而檢測乳腺球蛋白對于早期發現乳腺癌形成性細胞的存在、檢測乳腺癌轉移及評價愈后具有重要意義。檢測乳腺球蛋白與乳房X照相術結合能夠提高對乳腺癌預測的準確性。
本發明提供的檢測乳腺球蛋白的方法，乳膠凝集抑制法和雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白均具有顯著優點可以同時處理大量樣本，乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白較之免疫印跡法，試驗所需時間大大縮短；雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白能夠定量檢測樣本中乳腺球蛋白的含量。例如，在實施例3中，當采用96孔板進行雙夾心酶聯免疫吸附法檢測時，乳腺球蛋白標準梯度設定7個濃度，每一濃度做兩個復孔，每個樣品業同樣做兩個復孔，如此每板可同時處理40余個樣本，由于每個樣本做兩個復孔，其試驗結果更加準確可靠。方法簡單，易操作，易為大多國內醫院臨床實驗室所掌握。利用本發明的試劑盒，所有的檢測試驗將更加簡單便捷。
基于如上所述該發明有及強的臨床實用性，易普及，可以大大地提高我國乳腺癌的早期診斷率。同時該發明的方法的成本低，方法的使用成本要比現行的檢查乳腺癌方法(X線，CT斷層掃描等方法)的成本低兩倍以上，因此很適合我國的國情。
具體實施例方式
以下通過具體的實施例進一步說明本發明，但它們都是說明性的，不以任何形式限制本發明的范圍。
實施例1將2.7-4.5ml病人血液收集于內含EDTA的采集管內，混勻，移去血漿，將血漿離心15分鐘(2500×g)，取上清冰凍。用抗乳腺球蛋白抗體RO28標記乳膠顆粒(直徑2μm)。將標記的乳膠顆粒保存在(2-8℃)含有0.2g/L疊達鈉的HEPES緩沖液內(pH8.2)。取出所有試劑放置室溫下10分鐘。正常健康女性血清陰性對照及乳腺球蛋白陽性對照試管各加入200μl PBS，靜置10分鐘，然后混勻。反復混勻試管內的凝膠顆粒。使用有試驗池的玻片，先向不同的池中滴入20μl病人血漿及20μl陰性對照和20μl陽性對照，左右搖晃1～2分鐘使之混勻，然后各加入乳膠顆粒一滴，再搖2～3分鐘使兩者充分混合，5分鐘后觀察結果，出現均勻一致的凝集小顆粒者為陽性反應，無凝集者為陰性反應。
使用之前應做對照試驗，出現如下結果試驗方可成立，否則應重試，如重試仍不出現如下結果則停止使用乳腺球蛋白標準液加乳腺球蛋白抗體標記的凝膠顆粒陽性凝集；正常健康女性血清加乳腺球蛋白抗體標記的凝膠顆粒呈陰性凝集。
實施例2用抗乳腺球蛋白抗體RO48標記乳膠顆粒(直徑2μm)，其他步驟同實施例1。
實施例3雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白，步驟如下1)將特異性抗乳腺球蛋白RO48抗體稀釋至4μg/ml。將稀釋的50μl RO48抗體與固相載體96孔板反應(200ng/孔)，4℃過夜。吸去多余上清，洗去未結合的抗體及雜質；2)加入250μl脫脂牛奶(50g/L，PBS緩沖液稀釋)室溫下反應2小時；3)吸去多余上清，洗去未結合的抗體及雜質；4)標準組每孔加入30μl天然乳腺球蛋白5)(稀釋7個濃度5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml)及10μl正常女性血清；測試樣本組每孔加入30μl稀釋液及10μl待測乳腺癌病人血清；標準組和測試樣本組均做兩個復孔；6)室溫下反應3小時；
7)洗去未結合的部分；8)將生物素化(biotinylated)的RO28(1mg/L)抗天然乳腺球蛋白抗體用稀釋液稀釋。將50μl的稀釋后生物素化RO28抗體加入孔內，室溫下反應60分鐘；9)洗去未結合的部分；10)稀釋鏈霉素抗生物素蛋白標記的辣根過氧化酶至0.1μg/ml。每孔加入50μl的稀釋的超生物素標記的辣根過氧化酶，室溫下反應30分鐘；11)洗去未結合的部分；12)每孔加入50μl底物N-四甲聯苯胺，在振動器上室溫下反應2分鐘，反應用0.05mol/L硫酸終止。
12〕450nm光譜儀讀數，繪制標準曲線，計算待測試樣本中乳腺球蛋白含量。
實施例4乳腺癌病人血清mRNA用常規方法提取，然后轉錄成cDNA。將待檢標本cDNA熱變性為單股DNA作為模板，加一對人工合成的模板DNA兩端各20個堿基互補的引物5’-TGCCATAGATGAATGA AGGAATG(SEQ ID NO1)；和3’-TGTCATATATTAATTGCATAAACCACCTCA(SEQ ID NO2)，在耐熱DNA聚合酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3’端引物向5’端延伸成DNA鏈，經20～40循環。用同樣的方法擴增乳腺球蛋白陽性乳腺癌DNA及陰性對照DNA。上述產物經瓊脂糖電泳，然后用標記探針雜交檢測擴增產物，雜交探針核苷酸序列為；TCTTAACCAAACGGATGAAACTCTGAGCAATG(SEQ ID NO3)。
實施例5RT-PCR擴增乳腺球蛋白cDNA的方法同實施例4。將標記探針用包被液點樣于平均孔徑2μm的高分子聚合物膜(硝酸纖維素膜)上，然后干燥之；將該檢測膜與上述RT-PCR產物接觸，檢測RT-PCR產物是否與探針反應。
序列表<110>上海晶泰生物技術有限公司<120>一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1tgccatagat gaatgaagga atg 23
<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tgtcatatat taattgcata aaccacctca30<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>3tcttaaccaa acggatgaaa ctctgagcaa tg 32<210>4<211>503<212>DNA
<213>人種(human sp.)<220>
<221>CDS<222>(61)..(339)<400>4gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60atg aag ttg ctg atg gtc ctc atg ctg gcg gcc ctc tcc cag cac tgc 108Met Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys1 5 10 15tac gca ggc tct ggc tgc ccc tta ttg gag aat gtg att tcc aag aca 156Tyr Ala Gly Ser Gly Cys Pro Leu Leu Glu Asn Val Ile Ser Lys Thr20 25 30atc aat cca caa gtg tct aag act gaa tac aaa gaa ctt ctt caa gag 204Ile Ash Pro Gln Val Ser Lys Thr Glu Tyr Lys Glu Leu Leu Gln Glu35 40 45ttc ata gac gac aat gcc act aca aat gcc ata gat gaa ttg aag gaa 252Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu50 55 60tgt ttt ctt aac caa acg gat gaa act ctg agc aat gtt gag gtg ttt 300
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Phe Ile Asp Asp Asn Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Glu Leu Lys Glu50 55 60Cys Phe Leu Ash Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe65 70 75 80Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu Phe85 90
權利要求
1.一種乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，該方法包括下述步驟a)將抗乳腺球蛋白抗體標記的乳膠顆粒與待測樣本混合，和b)根據是否出現凝集反應判定檢測結果，其中，所述抗乳腺球蛋白抗體標記的乳膠顆粒是用抗乳腺球蛋白抗體RO28或RO48標記乳膠顆粒，該乳膠顆粒的直徑為2-10μm，并將標記的乳膠顆粒保存在HEPES緩沖液內，pH 8.2。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，以乳腺球蛋白抗原為陽性對照，正常健康女性血清為陰性對照。
3.一種乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的試劑盒，該試劑盒包含包裝于容器中的抗乳腺球蛋白抗體、乳腺球蛋白抗原、正常健康女性血清陰性對照和乳膠顆粒，其特征在于，所述的抗乳腺球蛋白抗體為RO28或RO48，乳膠顆粒的直徑為2-10μm，其中，所述的試劑盒包括包裝于容器中的HEPES緩沖液、包裝于容器中的PBS緩沖液和具有小池的試驗板。
4.一種雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟a)使包被抗體抗乳腺球蛋白抗體與固相載體結合形成固相抗乳腺球蛋白抗體；b)去除未結合抗乳腺球蛋白抗體及其它雜質；c)封閉固相抗體；d)向每份固相抗體加入等體積乳腺球蛋白抗原標準品和待測樣本，反應；e)去除未結合部分；f)加入標記的酶標抗體抗天然乳腺球蛋白抗體，反應；g)洗去未結合的部分；h)加入標記的辣根過氧化酶，反應；i)洗去未結合的部分；j)加入顯色底物，反應，用50mmol硫酸終止；和k)讀數。
5.如權利要求4所述雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，包被抗體是特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體RO48。
6.如權利要求5所述雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，酶標抗體是生物素標記的特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體抗體RO28，標記的辣根過氧化酶是鏈霉素抗生物素蛋白標記的辣根過氧化酶。
7.如權利要求4至6任一所述雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的方法，其特征在于，乳腺球蛋白抗原標準品以濃度梯度序列加入固相抗體。
8.一種雙夾心酶聯免疫吸附法檢測乳腺球蛋白的試劑盒，該試劑盒包含包括于容器中的包被抗體、酶標抗體、乳腺球蛋白標準品和正常健康女性血清，其特征在于，包被抗體是特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體RO48、酶標抗體是生物素標記的特異性抗乳腺球蛋白單克隆抗體抗體RO28。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括包含于容器中的鏈霉素抗生物素蛋白標記的辣根過氧化酶。
10.如權利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括乳腺球蛋白標準品、健康女性血清、96孔板和顯色底物。
11.一種RT-PCR檢測乳腺球蛋白表達的方法，包括如下步驟a)用常規方法提取樣本中mRNA，反轉錄成cDNA；b)提供兩段PCR引物，該引物所包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中；c)用PCR擴增編碼乳腺球蛋白的cDNA；和d)檢測擴增產物，其特征在于，該兩段PCR引物所包含的寡聚核苷酸是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
12.如權利要求13所述的方法，產物經瓊脂糖電泳，然后用標記探針雜交，其特征在于，該探針核苷酸序列為SEQ ID NO3。
13.如權利要求14所述的方法，其特征在于，將標記探針用包被液點樣于平均孔徑2-10μm的高分子聚合物膜上，然后干燥之；再將該檢測膜與上述RT-PCR產物接觸，檢測RT-PCR產物是否與探針反應。
14.一種RT-PCR檢測乳腺球蛋白表達的試劑盒，該試劑盒包括包裝于容器中的兩段PCR引物，它們包含的寡聚核苷酸位于編碼乳腺球蛋白的cDNA的兩測或位于其中，其特征在于，該兩段引物包含核苷酸序列SEQ ID NO1和SEQ IDNO2，該試劑盒包括包裝于容器中的檢測擴增產物的雜交探針，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO3。
15.如權利要求14所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括檢測膜，該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜。
16.如權利要求15所述的試劑盒，其特征在于，該檢測膜為平均孔徑2-8μm的高分子聚合物膜，在該檢測膜上已預先固定了探針。
全文摘要
本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種檢測乳腺球蛋白的方法及其試劑盒。本發明一種乳膠凝集抑制法檢測乳腺球蛋白的方法，該方法包括下述步驟a)將抗乳腺球蛋白抗體標記的乳膠顆粒與待測樣本混合，和b)根據是否出現凝集反應判定檢測結果，其中，所述抗乳腺球蛋白抗體標記的乳膠顆粒是用抗乳腺球蛋白抗體R028或R048標記乳膠顆粒，該乳膠顆粒的直徑為2－10μm，并將標記的乳膠顆粒保存在HEPES緩沖液內，pH 8.2。同時還公開了用抗乳腺球蛋白單克隆抗體和生物素標記抗乳腺球蛋白單克隆抗體通過雙夾心酶聯免疫吸附法定量檢測乳腺球蛋白的方法。另外還公開了一種RT－PCR檢測乳腺球蛋白表達的方法，也提供了用于檢測乳腺球蛋白的試劑盒。本發明的方法和試劑盒可用于乳腺癌形成性細胞存在的早期檢測。
文檔編號G01N33/531GK1766634SQ20051010661
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月20日 優先權日2005年6月13日
發明者初培國 申請人:上海晶泰生物技術有限公司