專利名稱：乳腺癌的Her－2免疫組織化學診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于臨床的腫瘤診斷試劑盒，特別是一種利用PAMAM樹突狀多聚物的生物特性標記抗體，對乳腺癌的Her-2進行免疫組織化學診斷的試劑盒。也可用于其他各種癌組織診斷Her-2的表達情況的檢測。
背景技術：
近年來乳腺癌患病人數正在急劇上升，發病率居女性腫瘤第一位。我國每年約有5-9萬名婦女發生乳腺癌，3-4萬名婦女死于乳腺癌。在沿海大城市如上海，乳腺癌發病率居女性腫瘤第一位。每年約有12-15萬名乳腺癌患者需要觀察和治療。在所有的乳腺癌患者中，有25-30％的人有Her-2/neu(表皮生長因子受體)蛋白的過度表達，該類型腫瘤更具轉移性，危險性。美國腫瘤學會2000年就推薦“Her-2/neu”作為乳腺癌標記物，無論對在診斷當時，還是復發時的檢測都具有重要價值。自1987年斯萊曼(Slamon)等人發表了Her-2與人類乳腺癌的增生，預后相關研究以來，Her-2的研究取得很大進展。1998年美國羅氏公司推出治療乳腺癌新藥Herceptin(赫塞汀)得到FDA(美國食品和藥物管理局)批準上市。并且迅速在加拿大，歐洲，日本得到使用。新藥Herceptin的應用更推動了Her-2基因和蛋白的臨床檢查的發展。到了2000年美國臨床腫瘤學會出版的《腫瘤標記物指南》又指出“在原發性乳腺癌病例中無論是在診斷當時，還是術后復發時，Her-2的過度表達對預后判斷，治療方案的選擇等都具有重要的意義”。但是，目前已經有的乳腺癌診斷試劑操作程序繁瑣，非特異性高，特異性低，不能迅速、準確地診斷惡性的乳腺癌、觀察其預后轉化。
PAMAM(聚酰胺-胺)是一種納米級樹突狀多聚物，PAMAM Dendrimer樹狀大分子是近年來合成并迅速發展的一類新型聚合物。該聚合物與傳統的聚合物相比，可在納米水平上嚴格控制設計分子大小、結構和表面基團，因而具有精確的分子結構、致密的球狀外形、單分散性、極好的水溶性。薩頓(SATON.)等人2001年發表用PAMAM來攜帶寡核酐酸基因片段進行體內和體外實驗，證明其具有非常好的傳遞功能。帕特里安尼克(PATRIANILK)等人2002年應用PAMAM結合抗體片段靶向性治療前列腺癌。專利號為US2003/0044407A1的“標記抗體或抗體片段的免疫脂質或多聚物用于系統治療的傳輸或診斷試劑”中公開了2001年張，埃絲特(Chang，Esther H)等人，應用PAMAM標記稀有金屬和抗體注入體內，通過核磁共振測定進行影像學診斷。但是因其在體內分解、代謝所產生的毒性作用尚不清楚，有動物實驗研究表明，一定的PAMAM劑量可使小鼠產生溶血性變化。因此，體內實驗難于廣泛應用。
大量研究證實，Her-2陽性患者對現有的常規化療、放療及激素的抗乳腺癌治療均不敏感，術后易復發，轉移快，存活時間短，上述病例都與Her-2/neu(c-erbB-2)蛋白過度表達密切相關。一些發展國家已經建立了一些有效的Her-2/neu基因和蛋白檢測、評價標準，用于指導和預測治療的效果，但是其試劑昂貴，檢測麻煩。

發明內容
本發明的目的是提供一種乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其利用PAMAM樹突狀多聚物的生物特性標記抗體，對乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷，不僅明顯擴大染色可視性，提高免疫反應的特異性，敏感性，HER-2過度表達的檢測更為準確，而且使與Her-2/neu蛋白過度表達患者能得到有效，及時的治療，減少患者不必要的醫療費用支出，提高患者的生存質量和延長生存時間，體外診斷檢測操作簡便、對腫瘤早期診斷準確、穩定、有效。
本發明的目的是這樣實現的該試劑盒內容物中包括阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，與人體組織抗原結合的鼠抗人的初始抗體，能與初始抗體連接的羊抗鼠的單克隆連接抗體，用來標記單克隆連接抗體、具有擴大視覺效果、提高敏感性的酶標PAMAM試劑，通過相互協同作用提高顯微鏡觀察染色效果的由發色氧化反應劑、發色劑、顯色緩沖液按常規調配成的顯色試劑，操作時依次滴入的各試劑用量的重量比為非特異性蛋白阻斷劑∶初始抗體∶連接抗體∶酶標PAMAM試劑∶顯色試劑＝5～10∶1～10∶5～10∶5～10∶10。
所述用于非特異性阻斷人組織切片中交叉蛋白反應的非特異性蛋白阻斷劑，由動物血清組成。
所述初始抗體是針對人體乳腺癌組織中特異性Her-2抗原所制備的鼠抗人的特異性抗體。
所述用于特異性初始抗體與顯色試劑之間的連接橋梁的連接抗體是由羊抗鼠的抗體組成。
所述用來標記抗體的酶標PAMAM試劑中的PAMAM是一種納米級樹狀多聚物，其表面有高密度的氨基基團，在生理環境的pH時帶正電性，與帶負電的抗體蛋白結合，酶標PAMAM試劑是由辣根過氧化物酶標記的抗體與帶正電荷的PAMAM Dendrimer混合，在室溫條件下反應10～15分鐘制成，二者的混合濃度為0.1～10∶1摩爾比。
所述顯色劑中的發色氧化反應劑由03％過氧化氫水溶液組成，棕色發色劑選用DAB，紅色發色劑選用AEC，紫蘭色發色劑選用BCIP/NBT，顯色緩沖液為0.05Mol Tris-HCl；顯色試劑的調制，先將顯色緩沖液取2.5ml裝于另一試管中，滴入發色劑兩滴(每滴約50μl，以下同)，再滴入發色氧化反應劑一滴，輕輕上下翻轉數次，混合后備用。可根據染色片子的數量按該比率配制。其用量的重量比為顯色緩沖液∶發色劑∶發色氧化反應劑＝50∶2∶1。
所述人乳腺癌組織為手術切除的組織標本，其取材規格為1×1×0.5mm，并在24～72小時內固定于10％中性福爾馬林溶液中。
所述的人組織切片進行抗原性恢復處理，即將石蠟包埋的組織切片，經常規脫蠟后放入0.1M、pH6.2的枸櫞酸溶液中，經微波裝置加熱處理迅速達到100℃沸騰后，降低照射力度保持90-98°、15～30分鐘，然后取出容器放置室溫20分鐘再染色。
所述染色操作步驟如下將所述組織切片用蒸餾水洗凈后，適量3％過氧化氫水溶液處理10分鐘后加非特異性蛋白阻斷劑1-2滴，反應10分鐘，吸掉反應液后不沖洗，根據組織的大小加初始抗體量從10μl至100μl調整，30分鐘后，加連接抗體1-2滴30分鐘，加酶標PAMAM試劑1-2滴30分鐘，加已調制的顯色試劑100μl，3-5分鐘，以上各步驟之間均PBS洗3次每次3分，用干凈的濾紙檫凈組織周圍的PBS，每一步都不能使組織干燥務必要保持組織的濕潤，核染色，蘇木素染核1分鐘，脫水、透明、封片、顯微鏡觀察，上述反應均在室溫下進行。
所述染色結果判定如下0+細胞膜為陰性或細胞膜染色陽性的癌細胞少于10％，單純細胞漿染色性時判斷為陰性；1+幾乎很少有完整細胞膜陽性或有完整細胞膜染色陽性的癌細胞少于或等于全部癌細胞的10％；2+完整細胞膜弱-中度染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10％；3+完整細胞膜強染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10％；結果判定0+，1+為陰性； 2+，3+為陽性。
由于本發明利用含氨功能基高分子PAMAM樹突狀物的生物特性標記抗體，所以將其用于乳腺癌的Her-2免疫組織化學的體外診斷，開辟了新的體外診斷學方法。這是一種在細胞或組織中某部位存在的特殊蛋白同相應的抗體進行免疫學反應，然后進行顯微鏡觀察的診斷技術。PAMAM是被合成的一種納米級樹突狀多聚物，Dendrimer由中間的核和向周圍散發的分支組成。核決定整個分子及表面電荷的密度，其大小、形狀及功能基團的放置都可以精確控制，在直徑上呈現出可被較好控制的單分散性。同時，它還有較好的水溶性。經過反復的聚合反應，在其表面形成了高密度的氨基基團，在生理環境的pH時帶正電性，可與帶負電的抗體蛋白結合，明顯提高檢測的敏感性和特異性，這種體外診斷學方法優于現有技術中采用的其它普通方法。此外，HER-2表達的檢測是對良性乳腺腫瘤惡性變的重要觀察指標。本發明對Her2蛋白的測試是利用PAMAM來標記抗體，對乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷，不僅明顯擴大染色可視性，提高免疫反應的特異性，敏感性，Her-2過度表達的檢測更為準確，而且使與Her-2/neu蛋白過度表達患者能得到有效，及時的治療，減少患者不必要的醫療費用支出，提高患者的生存質量和延長生存時間，使發生乳腺癌婦女的生存率增加，Her-2過度表達的體外診斷檢測操作簡便、對腫瘤早期診斷準確、穩定、有效。該體外診斷學方法與其它方法相比有分子量較小，更容易滲透，敏感度高的優點。
本發明試劑盒與Her-2多克隆抗體試劑盒[Herceptin Test]進行比較實驗。
所用實驗材料原發性乳腺癌106例手術材料石蠟組織切片。使用該試劑盒進行免疫組織化學染色同時，用連續切片進行多克隆抗體試劑盒的檢測，分別進行雙盲判定，對其陽性和陰性病例統計學處理。其結果顯示；該試劑盒與[Herceptin Test]的陽性一致率42/50＝86.0％、該試劑盒與[Herceptin Test]的陰性一致率56/56＝100％，本試劑盒與[Herceptin Test]的診斷一致率(42+56)/(50+56)＝98/106＝92.4％。
結論使用本試劑盒進行免疫組織化學染色可以得到良好染色結果，其細胞膜陽性染色明確，清晰，幾乎無非特異性染色，可以容易獲得準確的判斷結果。與[Herceptin Test]的比較性研究顯示有顯著的相關性。雖然在陽性率，診斷率有不一致的病例存在，這與其他文獻報道的Herciptin Test陽性而基因檢查未見基因擴增的假陽性結果符合。因此，該試劑盒特異性更高，更準確。
以下結合附圖對本發明作進一步描述。


圖1是本發明的一種顯微鏡下Her-2染色結果判定圖譜。
具體實施例方式以下結合實施方式對本發明作進一步描述。該試劑盒內容物中包括非特異性蛋白阻斷劑，鼠抗人的初始抗體，羊抗鼠的單克隆連接抗體，酶標PAMAM試劑，由發色氧化反應劑、發色劑、顯色緩沖液調配成的顯色試劑等。操作時要依次滴入各試劑，其用量的重量比為非特異性蛋白阻斷劑∶初始抗體∶連接抗體∶酶標PAMAM試劑∶顯色試劑＝5～10∶1～10∶5～10∶5～10∶10。可根據實際使用情況，按上述比例在每盒內分裝20人份、50人份、100人份等劑量的各試劑。
按每盒50人份制備乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒非特異性蛋白阻斷劑是由動物血清組成，將羊、馬、兔等動物，抽取其正常血后，分離血清后取得備用。其作用是非特異性阻斷人組織切片中交叉蛋白反應。6ml/盒初始抗體是針對人體乳腺癌組織中特異性Her-2抗原所制備的鼠抗人的特異性單克隆抗體。10ul-100ul/例，2ml/盒。
連接抗體是由羊抗鼠的抗體組成，充當特異性初始抗體與顯色試劑之間的連接橋梁。6ml/盒。
酶標PAMAM試劑是用來標記抗體的，PAMAM是一種納米級樹狀多聚物，其表面有高密度的氨基基團，在生理環境的pH時帶正電性，與帶負電的抗體蛋白結合，酶標PAMAM試劑是由辣根過氧化物酶標記的抗體與帶正電荷的PAMAM Dendrimer混合，在室溫條件下反應10～15分鐘制成，二者的混合濃度為0.1～10∶1摩爾比。可穩定溶解于緩沖液中。6ml/盒。
發色氧化反應劑是由03％過氧化氫水溶液組成。2ml/盒。
發色劑可根據顯色的需要選用以下試劑中的一種，即棕色發色劑選用DAB(3，3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，紅色發色劑選用AEC(3-amino-9ethylcarbazole)，紫蘭色發色劑選用BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitroblue tetrazolium)。3ml/盒。
顯色緩沖液選用0.05Mol的Tris-HCl緩沖液等。6ml/盒實施例一本發明用于組織切片免疫組織化學染色診斷的具體操作步驟如下1、合成PAMAM Dendrimer。
PAMAM Dendrimer由0代至10代，其分子直徑在10至130之間，屬于納米尺度的分子。其合成是采用分支法，即分子由核心部分開始向外生長。根據樹木分枝的規律將預先制好的單體按放射狀的順序、分支的枝梢再接分支，依次重復組合起來。以乙二胺(EDA)為引發核，第1步反應(a)與丙烯酸甲酯(MA)通過Michael加成反應生成1個四元酯[稱為0.5代(G)]；第2步反應(b)四元酯與過量的乙二胺發生氨解反應生成1個四元酰胺化合物(稱為1代)。重復(a)、(b)Michael加成和氨解的反應步驟，即可得到不同代數的PAMAM樹狀大分子化合物。合成產物均用FT2IR、FAB2MS、1H NMR和13CNMR進行結構表征。以下是PAMAM合成反應路線。
不同pH值PAMAM對增溶的影響不同，不同質量濃度的PAMAM溶液對增溶試驗也產生5.0代PAMAM不同質量濃度。通過實驗證明在較大的pH值范圍內和不同的緩沖條件(水、PBS、0.5mmol/L NaCl等)下穩定存在，并不解離。
2、制備Her-2抗原。
人乳腺癌手術切除的Her-2強陽性新鮮腫瘤組織提取總RNA，用按Her-2的cDNA序列設計引物，進行PCR擴增得到人PCR片段，純化后用雙酶切開與同樣雙切酶的表達質粒Pet42b進行連接，得到重組原核表達質粒，然后將該質粒轉入大腸桿菌進行擴增，經測序驗證后，提取重組原核表達質粒，并以其轉化表達菌BL21。將BL21接種于LB培養液中37℃培養擴增。收集菌體于緩沖液中，經超聲波破菌后，離心、洗脫、收集。用WESTERN印跡檢測純化后的樣品。純度96.0％ 。
制備初始抗體取抗Her-2工作細胞庫雜交瘤細胞2*107/只，腹腔注射經石蠟油預先致敏的BALB/c小鼠，10-14天后抽取腹水。
純化硫酸銨沉淀、A蛋白-Sepharose親和層析交換分離方法從雜交瘤細胞株培養液中分離純化抗Her-2單克隆抗體。
抗體的效價經ELISA法測定培養上清液中抗體親和力，達到最大的結合50％所需腹水單抗的濃度為7.5×10-6，親和常數Ka＝1.3×105mol-1。利用羅氏公司的亞類測定試劑盒，檢測3株陽性雜交瘤細胞的培養上清液，用間接ELISA法檢測細胞培養上清液和腹水的單抗效價可達10-5，腹水經純化后ELISA法檢測抗體效價為10-6。
抗體特異性蛋白印記分析測到分子量為185dp的帶，和抗體經免疫組織化學染色顯示特異性強、反應敏感。而不與非Her-2蛋白質結合。重組可溶性抗原Her-2常規免疫BALB/c小鼠，取脾細胞與MOPC-21衍生的，分泌IgG分子(K輕鏈)的BALB/c骨髓瘤細胞融合制備抗體，篩選、純化抗體、A蛋白-Sepharose親和層析交換分離。
3、制備非特異性蛋白阻斷劑。
非特異性蛋白阻斷劑由動物血清組成，將羊、馬、兔等動物，抽取其正常血后，分離血清后取得備用。
4、制備連接抗體。
連接抗體是常規制備的由羊抗鼠的抗體組成。
5、制備酶標PAMAM試劑。
由辣根過氧化物酶標記的抗體或抗體片段與上述步驟1(合成PAMAMDendrimer)中所制作的帶正電荷的PAMAM Dendrimer以0.1～10∶1摩爾比率的濃度混合，室溫條件下反應10-15分鐘，制成酶標PAMAM試劑。這是一個使PAMAM與辣根過氧化物酶標記的抗體混合在一起的極好比率及順序，是簡單、有效，穩定、非化學的結合方法。該方法比化學或其他方法有效或更有效。
6、人乳腺癌組織的固定。
手術切除的組織離體的瞬間就開始發生各種變化，如組織自體溶解，腐敗等。固定的目的就是使這種變化立即停止，保存其形態學特點和抗原性。手術切除的組織被立刻切成1×1×0.5mm的組織標本，固定于常規10％中性福爾馬林溶液中。最佳固定方法和時間范圍是24-72小時。少于24小時固定不充分，超過72小時抗原性開始減弱。
7、病理組織蠟塊的適用。
經過中性緩沖福爾馬林液固定，用于常規處理的和石蠟包埋的組織，適用該試驗。不推薦酒精和其它福爾馬林代用品。
8、抗原性恢復處理。
石蠟包埋的組織切片，經脫蠟后放入0.1M、pH6.2枸櫞酸水溶液中，經微波裝置加熱處理迅速達到100℃沸騰后，降低照射力度保持90-98℃、15-30分鐘，然后取出容器放置室溫20分鐘左右再染色，使其抗原性恢復，增加染色強度。
9、顯色試劑的調制。
使用顯色試劑前，將顯色緩沖液取2.5ml裝于另一試管中，滴入發色劑兩滴(每滴約50μl，以下同)，再滴入發色氧化反應劑一滴，輕輕上下翻轉數次，混合后備用。可根據染色片子的數量按該比率配制。其用量的重量比為顯色緩沖液∶發色劑∶發色氧化反應劑＝50∶2∶1∶。
10、染色操作步驟。
上述組織切片用蒸餾水洗凈后，適量3％過氧化氫水溶液處理10分鐘后加非特異性蛋白阻斷劑1-2滴，反應10分鐘，吸掉反應液后不沖洗，根據組織的大小加初始抗體量從10μl至100μl調整，30分鐘后，加連接抗體1-2滴30分鐘，加酶標PAMAM試劑1-2滴30分鐘，加已調制的顯色試劑100μl，3-5分鐘，以上各步驟之間均PBS洗3次每次3分，用干凈的濾紙檫凈組織周圍的PBS，每一步都不能使組織干燥務必要保持組織的濕潤，核染色，蘇木素染核1分鐘，脫水、透明、封片、顯微鏡觀察，上述反應均在室溫下進行。
11、本試驗可適用于人工和自動染色。本試驗可在配套的自動染色儀上自動操作。
12、染色結果判定。
0+細胞膜為陰性或細胞膜染色陽性的癌細胞少于10％(單純細胞漿染色性時判斷為陰性)1+幾乎很少有完整細胞膜陽性或有完整細胞膜染色陽性的癌細胞少于或等于全部癌細胞的10％2+完整細胞膜弱-中度染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10％3+完整細胞膜強染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10％結果判定0+、1+為陰性，2+、3+為陽性(詳見圖1)。
實施例二本抗體還適用于腫瘤穿刺脫落細胞檢查。癌組織腫瘤穿刺細胞涂片染色或載玻片上細胞培養；穿刺細胞均勻涂在載玻片上待干燥后立即固定于10％中性福爾馬林溶液中10分鐘。載玻片上細胞培養因癌細胞附著于玻片上，可以直接放入固定液中10分鐘。蒸餾水洗凈后，直接進入實施例一中的第8步驟，改用0.3％的過氧化氫甲醇溶液(H2O2；1ml甲醇；99ml)阻斷內源酶，室溫30分鐘反應后PBS洗凈3次。以后的其他步驟同實施例一。
實施例三本試劑盒還可用于其他各種癌組織診斷Her-2的表達情況的檢測。方法同
權利要求
1.一種乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于盒內容物中包括阻斷人組織切片中交叉蛋白反應非特異性染色的非特異性蛋白阻斷劑，與人體組織抗原結合的鼠抗人的初始抗體，能與初始抗體連接的羊抗鼠的單克隆連接抗體，用來標記單克隆連接抗體、具有擴大視覺效果、提高敏感性的酶標PAMAM試劑，通過相互協同作用提高顯微鏡觀察染色效果的由發色氧化反應劑、發色劑、顯色緩沖液調配成的顯色試劑，操作時依次滴入的各試劑用量的重量比為非特異性蛋白阻斷劑∶初始抗體∶連接抗體∶酶標PAMAM試劑∶顯色試劑＝5～10∶1～10∶5～10∶5～10∶10。
2.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述用于非特異性阻斷人組織切片中交叉蛋白反應的非特異性蛋白阻斷劑，由動物血清組成。
3.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述初始抗體是針對人體乳腺癌組織中特異性Her-2抗原所制備的鼠抗人的特異性單克隆抗體。
4.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述用于特異性初始抗體與顯色試劑之間的連接橋梁的連接抗體是由羊抗鼠的抗體組成。
5.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述用來標記抗體的酶標PAMAM試劑中的PAMAM是一種納米級樹狀多聚物，其表面有高密度的氨基基團，在生理環境的pH時帶正電性，與帶負電的抗體蛋白結合，酶標PAMAM試劑是由辣根過氧化物酶標記的抗體與帶正電荷的PAMAM Dendrimer混合，在室溫條件下反應10～15分鐘制成，二者的混合濃度為0.1～10∶1摩爾比。
6.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述顯色試劑中的發色氧化反應劑由03％過氧化氫水溶液組成，棕色發色劑選用DAB，紅色發色劑選用AEC，紫蘭色發色劑選用BCIP/NBT，顯色緩沖液為0.05Mol的Tris-HCl；顯色試劑的調制，先將顯色緩沖液取2.5ml裝于另一試管中，滴入發色劑兩滴(每滴約50μl，以下同)，再滴入發色氧化反應劑一滴，輕輕上下翻轉數次，混合后備用，可根據染色片子的數量按該比率配制，其用量的重量比為顯色緩沖液∶發色劑∶發色氧化反應劑＝50∶2∶1。
7.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述人乳腺癌組織為手術切除的組織標本，其取材規格為1×1×0.5mm，并在24～72小時內固定于10％中性福爾馬林溶液中。
8.根據權利要求1或7所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述的人組織切片進行抗原性恢復處理，即將石蠟包埋的組織切片，經常規脫蠟后放入0.1M、pH6.2的枸櫞酸溶液中，經微波裝置加熱處理迅速達到100℃沸騰后，降低照射力度保持90-98°、15～30分鐘，然后取出容器放置室溫20分鐘再染色。
9.根據權利要求8所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述染色操作步驟如下將所述組織切片用蒸餾水洗凈后，適量3％過氧化氫水溶液處理10分鐘后加非特異性蛋白阻斷劑1-2滴，反應10分鐘，吸掉反應液后不沖洗，根據組織的大小加初始抗體量從10μl至100μl調整，30分鐘后，加連接抗體1-2滴30分鐘，加酶標PAMAM試劑1-2滴30分鐘，加已調制的顯色試劑100μl，3-5分鐘，以上各步驟之間均PBS洗3次每次3分，用干凈的濾紙檫凈組織周圍的PBS，每一步都不能使組織干燥務必要保持組織的濕潤，核染色；蘇木素染核1分鐘，脫水、透明、封片、顯微鏡觀察，上述反應均在室溫下進行。
10.根據權利要求1所述的乳腺癌的Her-2免疫組織化學診斷試劑盒，其特征在于所述染色顯微鏡下觀察結果判定如下若細胞膜為陰性或細胞膜染色陽性的癌細胞少于10％，單純細胞漿染色性時判斷為陰性，則為0+；若幾乎很少有完整細胞膜陽性或有完整細胞膜染色陽性的癌細胞少于或等于全部癌細胞的10％，則為1+；若完整細胞膜弱-中度染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10％，則為2+；若完整細胞膜強染色陽性的癌細胞大于或等于全部癌細胞的10％，則為3+染色結果判定0+，1+為陰性；2+，3+為陽性。
全文摘要
一種乳腺癌的Her－2免疫組織化學診斷試劑盒，其內容物中包括非特異性蛋白阻斷劑，鼠抗人的初始抗體，羊抗鼠的單克隆連接抗體，酶標PAMAM試劑，由發色氧化反應劑、發色劑、顯色緩沖液調配成的顯色試劑等。利用PAMAM樹突狀多聚物的生物特性標記抗體，對乳腺癌的Her－2免疫組織化學診斷，不僅明顯擴大染色可視性，提高免疫反應的特異性，敏感性，HER－2過度表達的檢測更為準確，而且使與Her－2/neu蛋白過度表達患者能得到有效、及時地治療，減少患者不必要的醫療費用支出，提高患者的生存質量和延長生存時間，體外診斷檢測操作簡便、對腫瘤早期診斷準確、穩定、有效。
文檔編號G01N21/77GK1580774SQ20041002054
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月14日 優先權日2004年5月14日
發明者李文欣 申請人:沈陽邁迪生物醫學技術有限公司