專利名稱：：內毒素檢測法的制作方法
技術領域：
：本發明涉及內毒素檢測法。技術背景已知注射劑中如果混有發熱性物質(pyrogen),則將出現發熱、寒戰等癥狀。為了防止發熱性物質的混入，以往已知通過發熱性物質檢測法來檢測發熱性物質，并使用于注射劑的制造工序、質量管理等中，但是該檢測法要花費很長時間和很多人工，非常麻煩(參考非專利文獻1)。已知發熱性物質主要是作為革蘭氏陰性菌的細胞壁構成成分的內毒素。以檢測或定量來自革蘭氏陰性菌的內毒素等為目的，已知有以由內毒素造成馬蹄型蟹(美洲鱟(Limuluspolyphemus)、中國鱟(Tachypleustridentatus)等)的血細胞提取成分(溶胞產物)的凝固為基本原理的內毒素檢測法(參考非專利文獻2)，近年在發熱性物質的檢測中，多采用內毒素檢測法來代替發熱性物質檢測法。非專利文獻1第14改正日本藥局方解說書(第14次修訂日本藥典說明書)廣川書店2001B-49非專利文獻2第14改正日本藥局方解說書(第14次修訂日本藥典說明書)廣川書店2001B-63發明的揭示本發明對用非專利文獻2記載的方法不能正確檢測、定量來自革蘭氏陰性菌的內毒素的樣品，提供了可以檢測樣品中的內毒素的方法。本發明者經過認真的研究，結果發現在使用了溶胞產物試劑的內毒素檢測中，通過在白蛋白及/或球蛋白存在下，向樣品添加溶胞產物試劑實施檢測可以解決上述課題，從而完成了本發明。艮卩，本發明涉及新的內毒素檢測法以及內毒素濃度不到標準值的注射劑的制造方法，涉及以下的發明。(1)內毒素檢測法，其特征在于，于白蛋白及/或球蛋白的存在下，向喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉垸衍生物的溶液或分散液中添加溶胞產物試劑。(2)如上述(1)所述的檢測法，其中，白蛋白及/或球蛋白為人血清白蛋白。(3)如上述(1)或(2)所述的檢測法，其中，喜樹堿衍生物為鹽酸伊立替康。(4)內毒素濃度不到標準值的含有藥效成分的注射劑的制造方法，其中，包括于白蛋白及/或球蛋白的存在下，向所述藥效成分的溶液或分散液中添加溶胞產物試劑來評價有無內毒素的篩選工序。(5)內毒素濃度不到標準值的含有喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉烷衍生物的注射劑的制造方法，其中，包括于白蛋白及/或球蛋白的存在下，向喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉垸衍生物的溶液或分散液中添加溶胞產物試劑來評價有無內毒素的篩選工序。(6)如上述(4)或(5)所述的制造方法，其中，白蛋白及/或球蛋白為人血清白蛋白。(7)如上述(5)或(6)所述的制造方法，其中，喜樹堿衍生物為鹽酸伊立替康。由后述實施例可知，通過本發明的檢測法，對用通常的檢測法不能正確檢測、定量的來自革蘭氏陰性菌的內毒素的樣品也可以檢測、定量樣品中的內毒素。因此，可以不經復雜的發熱性物質檢測法而進行注射劑的制造工序、質量管理，另外，可以提供內毒素濃度不到標準值的注射劑的制造方法。此外，由于可以不利用使用家兔的發熱性物質檢測法來檢測發熱性物質等，因此從動物保護的觀點來看也是優選的。實施發明的最佳實施方式本發明中，白蛋白及/或球蛋白的存在下，使樣品(藥效成分的溶液或分散液)與溶胞產物試劑反應，檢測、定量樣品中的內毒素與溶胞產物試劑的反應。本發明中涉及的白蛋白及/或球蛋白可例舉如將血漿或血清精制或部分精制而得的產物或含有白蛋白及/或球蛋白作為成分的物質。該白蛋白和球蛋白優選人血清蛋白。作為以白蛋白及/或球蛋白為含有成分的物質，可例舉如科恩分級(COHN'sfractions)或電泳而得的白蛋白級分或球蛋白級分、市售的新鮮冷凍人血漿(例如，日本紅十字會社)、加熱人血漿蛋白(例如，日本制藥株式會社等)、人血清白蛋白(例如，日本紅十字會社、三菱々.A77—T株式會社、"'夕^夕—株式會社等)、人免疫球蛋白(例如，日本紅十字株式會社、三菱々工A77—T株式會社、"'夕7夕一株式會社等)等。本發明從內毒素的檢測靈敏度的觀點來看，優選人血清白蛋白。本發明以用通常的檢測法不能檢測、定量內毒素的樣品為對象。在此，通常的檢測法是指非專利文獻2中記載的方法以及與其大致同樣的方法。非專利文獻2記載的方法與美國藥典、歐州藥典、JIS以及生物學的制劑基準中記載的方法大致相同。作為成為對象的樣品，可例舉如喜樹堿衍生物、替米哌隆、紫杉垸衍生物等。喜樹堿衍生物由于具有喜樹堿骨架，因此通常被認為是抗癌劑，已知例如鹽酸伊立替康、鹽酸拓撲替康(nogitecanhydrochloride)、盧比替康、勒托替康、9-氨基喜樹堿，除此之外還有國際公開第98/07727號國際公布文本、國際公開第98/015573號國際公布文本、國際公開第99/17804號國際公布文本、國際公開第99/011646號國際公布文本、日本專利特開平10-72467號公報中記載的衍生物。紫杉烷衍生物由于具有漿果赤霉素(baccatin)骨架，因此通常被認為是抗癌劑，已知可例舉如紫杉醇、多西他賽水合物、(_)-(1S,2S,3R，4S，5R,8R,9S，10R'13S)-4-乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-9，10-[(1S)-2-(二甲基氨基)亞乙基二氧基]-5，20-氧橋-1-氫化紫杉醇-ll-烯-l3-基(2R，3S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(3-氟-2-吡啶基)-2-羥基丙酸酯((-)-(IS,2S，3R,4S,5R，8R，9S，10R,13S)-4-acetoxy-2-benzoyloxy-9，10-[(IS)-2-(dimethylamino)ethylidenedioxy]-5，20-epoxy-l-hydroxytax-11-en-13-y1(2R,3S)-3-(tert-butoxy-carbcmyl認ino)_3-(3-fluoro-2-pyridyl)-2-hydroxypropionate)，除此之外還有日本專利特開平7-149779號公報、日本專利特表平8-508497號公報、日本專利特開平9-12578號公報、國際公開第96/01259號國際公布文本等中記載的衍生物。這些均可以應用本發明的內毒素檢測法、內毒素濃度不到標準值的注射劑的制造方法。本發明中，當樣品(藥效成分)不是溶液或分散液的形態時，需要使用適當的溶劑(例如，內毒素檢測用液、注射用水、生理鹽水、林格氏液、各種緩沖液)形成溶液或分散液的形態。另外，對于樣品(藥效成分)的溶液或分散液的濃度、白蛋白及/或球蛋白的向樣品溶液或分散液中的添加量經適當研究確定即可，例如樣品為鹽酸伊立替康時，除了按照公知的制造方法來制造之外，還可以使用濃度為20mg/mL的制品(卜水于'〉乂注(第一制藥株式會社、力>7。卜注(Y7A卜本社(株)))，對該制品按照非專利文獻2記載的方法確定適當的稀釋倍量、濃度即可。本發明中，優選將20mg/mL的鹽酸伊立替康溶液稀釋100倍以上直到可以檢測到內毒素標準值的濃度、優選稀釋3000倍以內后再使用，但并不一定要限定在該稀釋倍率內。另外，當樣品(藥效成分)為紫杉垸衍生物時，除了可以按照公知的制造方法來制造之外，作為紫杉垸衍生物，還包括紫杉醇的濃度為5mg/mL的制品(夕丼乂一>注(7"U^卜A.t4《一？;'(株))、多西他賽水合物的濃度為40mg/mL的制品(夕*乂亍一A注(廿/7"7《>亍<》(株))，對該制品按照非專利文獻2中記載的方法確定適當的稀釋倍率、濃度即可。當紫杉烷衍生物為(-)-(1S，2S，3R，4S，5R，8R，9S，10R,13S)-4-乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-9，10-[(1S)-2-(二甲基氨基)亞乙基二氧基]-5，20-氧橋-1-氫化紫杉醇-ll-烯-13-基(2R,3S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(3-氟-2-吡錠基)-2-羥基丙酸酯時，優選將該物質的2mg/mL溶液稀釋16倍以上直到可以檢測到內毒素標準值的濃度、優選稀釋200倍以內后再使用，但并不一定要限定在該稀釋倍率內。另外，當樣品(藥效成分)為替米哌隆時，除了可以按照公知的制造方法制造之外，還可以使用濃度為2mg/mL的制品(卜口《a:^注(第一制藥(株))，對該制品按照非專利文獻2記載的方法確定適當的稀釋倍率、濃度即可。本發明中，優選將2mg/mL的替米哌隆溶液稀釋大于8倍的倍率、優選為16倍以上直到可以檢測到內毒素標準值的濃度、優選稀釋9600倍以內后再使用，但不一定限定要限定在該稀釋倍率內。另外，本發明涉及的內毒素檢測中，根據需要也可以將樣品的溶液或分散液的pH調在6.08.0。本發明中，如上所述考慮樣品溶液或分散液的濃度等適當研究確定白蛋白及/或球蛋白的添加量即可，優選相對于樣品1重量份添加0.550重量份。當樣品為喜樹堿衍生物時，優選相對于喜樹堿衍生物1重量份添加150重量份。當樣品為替米哌隆時，優選相對于替米哌隆l重量份添加0.57重量份。當樣品為紫杉烷衍生物時，優選相對于紫杉烷衍生物1重量份添加0.080.3重量份。另外，向樣品溶液或分散液中添加的白蛋白及/或球蛋白的濃度優選低于其本身成為溶胞產物與內毒素的反應抑制劑的濃度。作為本發明涉及的溶胞產物試劑，只要含有馬蹄型蟹(美洲鱟(Limiiluspolyphemus)、中國鱟(Tachypleustridentatus)等)的血細胞提取成分(溶胞產物)即可，例如來自第一化學藥品(株)、和光純藥工業(株)、生化學工業(株)等的市售品，使用這些即可。溶胞產物試劑的使用量優選使用溶胞產物試劑或測定裝置的使用說明書中記載的量，但不限于此。在本發明的內毒素的測定中，只要是可以檢測、定量內毒素與溶胞產物試劑的反應的方法即可，例如可以按照非專利文獻2記載的方法實施。內毒素檢測法中，已知有以通過內毒素的作用造成溶胞產物試劑形成凝膠為指標的凝膠化法、以該凝膠過程中的濁度變化為指標的比濁法、以及以由內毒素和溶胞產物試劑的反應造成合成基質的水解而引起的發色為指標的比色法，但對本發明沒有特別的限定，可以使用任一種。另外，內毒素的測定使用市售的內毒素測定裝置即可，例舉如來自日本千U"—(株)、和光純藥工業(株)、生化學工業(株)等的市售品。這些反應優選在3040°C、特別優選在37土rC的條件下進行。本發明的內毒素檢測法用于將樣品(藥效成分)注射劑化中的該注射劑化工序或質量管理。g卩，通過本發明的內毒素檢測法，可以評價有無內毒素，通過設置由該評價來確定有無內毒素的篩選工序，可以制造內毒素濃度不到標準值的烙液或分散液。因此，通過本發明可以制造內毒素濃度不到標準值的注射劑。本發明可以應用于水性注射劑、油性注射劑、冷凍干燥注射劑等任一種形態的注射劑。另外，一般注射劑中的內毒素標準值與注射劑的形態無關，而是根據給藥途徑如下設定。內毒素標準值二K/MK值表示誘導發熱的每lkg體重的內毒素量(EU(內毒素單位)/kg)，根據注射劑的給藥途徑，靜脈內給藥時，K=5;靜脈內(放射性藥物)給藥時，K=2.5;脊髄腔內給藥時，K=0.2。M值表示每lkg體重在1小時以內給予的注射劑的最大量。另外，詳細內容在"第14改正日本藥局方解說書"(第14次修訂日本藥典說明書)廣川書店2001F-20"4.內毒素標準值^設定"(4.內毒素標準值的設定)一項中記載。對于用非專利文獻2記載的方法不能檢測內毒素等的藥品，本發明可以用于通過添加白蛋白及/或球蛋白可以解決問題的藥品的制造工序、質量管理。因此，本發明的檢測法以及制造方法的對象不僅限于例示的喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉烷衍生物。實施例1以下，顯示實施例來說明本發明，但本發明不限于此。實施例1[試劑](1)樣品將鹽酸伊立替康注射劑(濃度20mg/mL;卜水f〉>注(第一制藥(株)))用注射用水適當稀釋后使用。(2)內毒素(以下稱為ET)將標準品(controlstandard)ET(來自E.coli055:B5(株))用、主射用水適當稀釋后使用。(3)人血清白蛋白(以下，稱為HSA)溶液將人血清白蛋白2%溶液用注射用水適當稀釋后使用。(4)溶胞產物試劑將鱟熱原試劑(八^口-入>卜)5000(第一化學藥品(株))用溶角軍用緩沖液(第一化學藥品(株))溶解后使用。[操作]將樣品用注射用水稀釋，添加ET成為預先設定的濃度，再添加適量的HSA溶液，添加溶胞產物試劑進行攪拌后，使用內毒素測定裝置(ToxinometerET-301(和光純藥工業(株)公司))測定溶液中的ET濃度，求添加的ET的回收[結果]將結果示于表1和表2。如表1所示，即使將鹽酸伊立替康溶液(濃度20mg/mL)適當稀釋也不能采用通常的內毒素檢測法檢測ET，但是通過添力口相對于鹽酸伊立替康1重量份為150重量份的HAS，ET的回收率變得良好，可以進行內毒素檢測。200680018319.0說明書第7/10頁表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>根據表l所示的結果，HAS的濃度添加至O.1%，如表2所示，通過將鹽酸伊立替康溶液(濃度20mg/mL)稀釋1003000倍，ET的回收率變得非常良好，可以進行內毒素檢測。另外，根據非專利文獻2，當ET的回收率在50200X的范圍時，可以進行有效的檢測。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例2將3批(lots)鹽酸伊立替康注射劑(第一制藥(株)制、商品名卜水于>注)適當稀釋，添加相對于鹽酸伊立替康1重量份為5重量份的HAS，進行與實施例l同樣的測定，求添加的ET的回收率，將結果示于表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表3可知，ET的回收率非常良好，可以進行鹽酸伊立替康注射劑的制造工序和質量管理，另外還可以提供ET濃度不到標準值的鹽酸伊立替康注射劑的制造方法。實施例3[試劑](1)樣品向替米哌隆中加入注射用水，再加入適當的O.lmol/niL鹽酸溶液進行溶解，制備2mg/mL的替米哌隆溶液，使用適當稀釋后的溶液。(2)ET將標準ET(來自E.coliUKT-B株)用注射用水適當稀釋后使用。(3)HSA溶液將人血清白蛋白2%溶液用注射用水適當稀釋后使用。(4)溶胞產物試劑用ET檢測用Tris-HCl緩沖液(和光純藥(株))將LimulusHS-JTestWako(和光純藥(株))溶解后使用。[操作]用注射用水稀釋樣品，添加ET使之成為預先設定的濃度，添加HAS溶液使HAS的濃度為0.01X，再添加溶胞產物試劑攪拌后，使用內毒素測定裝置(ToxinometerET-201(和光純藥工業(株)))測定溶液中的ET濃度，求添加的ET的回收率。同樣操作，但進行作為內毒素檢測中的反應影響因子的除去方法的pH調整或添加枸櫞酸鈉來代替HSA溶液的添加。[結果]將結果示于表4和表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*:替米哌隆析出造成的假陽性由表4所示，添加相對于替米哌隆1重量份為0.57重量份的HAS時，通過將2mg/mL的替米哌隆溶液稀釋16倍以上時，ET的回收率變得非常良好，可以進行內毒素檢測。但是，通過作為反應影響因子的除去方法而得知的pH調整、枸櫞酸鈉的添加不能實施內毒素檢測。實施例4[試劑](1)樣品向(-)-(1S，2S,3R，4S，5R，8R，9S,10R,13S)-4-乙酰氧基-2-苯甲酰氧基-9,10-[(1S)-2-(二甲基氨基)亞乙基二氧基]-5，20-氧橋-1-氫化紫杉醇-11-烯-13-基(2R，3S)-3-(叔丁氧基羰基氨基)-3-(3-氟-2-吡啶基)-2-羥基丙酸酯(以下，稱為化合物A)中添加適量的注射用水和0.lmol/mL鹽酸溶液進行溶解，制備2mg/mL的化合物A溶液，用適當注射用水稀釋后使用。(2)ET使用USPReferenceStandardEC-6(生化學工業(株))。(3)HSA溶液將人血清白蛋白2%溶液用注射用水適當稀釋后使用。(4)溶胞產物試劑使用Kinetic-QCL試劑盒(第一化學藥品(株))中含有的試劑。[操作]用注射用水將樣品稀釋，添加ET成為預先設定的濃度，添加適量的HSA溶液，添加溶胞產物試劑進行攪拌后，使用內毒素測定裝置(ELx808U—f一(第一化學藥品(株))測定溶液中的ET濃度，求添加的ET的回收率。[結果]將結果示于表6。即使將化合物A溶液(濃度2mg/mL)適當稀釋也不能采用通常的內毒素檢測法檢測ET，但是通過添加相對于化合物Al重量份為0.080.3重量份的HAS，ET的回收率變得良好，可以進行內毒素檢測。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>產業上利用的可能性由上述實施例可知，通過本發明的內毒素檢測法對用通常的檢測法不能正確檢測、定量的來自革蘭氏陰性菌的內毒素的樣品，也可以檢測、定量樣品中的內毒素因此，不經過復雜的發熱性物質的檢測，就能夠進行注射劑的制造工序和質量管理，另外提供了內毒素濃度不到標準值的注射劑的制造方法。權利要求1.內毒素檢測法，其特征在于，于白蛋白及/或球蛋白的存在下，向喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉烷衍生物的溶液或分散液中添加溶胞產物試劑。2.如權利要求1所述的檢測法，其特征在于，白蛋白及/或球蛋白為人血清白蛋白。3.如權利要求1或2所述的檢測法，其特征在于，喜樹堿衍生物為鹽酸伊立替康。4.內毒素濃度不到標準值的含有藥效成分的注射劑的制造方法，其特征在于，包括于白蛋白及/或球蛋白的存在下，向所述藥效成分的溶液或分散液中添加溶胞產物試劑來評價有無內毒素的篩選工序。5.內毒素濃度不到標準值的含有喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉垸衍生物的注射劑的制造方法，其特征在于，包括于白蛋白及/或球蛋白的存在下，向喜樹堿衍生物、替米哌隆或紫杉烷衍生物的溶液或分散液中添加溶胞產物試劑來評價有無內毒素的篩選工序。6.如權利要求4或5所述的制造方法，其特征在于，白蛋白及/或球蛋白為人血清白蛋白。7.如權利要求5所述的制造方法，其特征在于，喜樹堿衍生物為鹽酸伊立替康全文摘要本發明的課題在于提供對于按照“第14改正日本藥局方解說書”(第14次修訂日本藥典說明書)廣川書店2001B-63中記載的方法不能正確檢測、定量的來自革蘭氏陰性菌的內毒素的樣品，可以檢測樣品中的內毒素等的方法。本發明人發現，在使用了溶胞產物試劑的內毒素檢測中，通過在白蛋白及/或球蛋白存在下，向樣品中添加溶胞產物試劑進行檢測，可以解決上述課題。文檔編號G01N33/579GK101218509SQ200680018319公開日2008年7月9日申請日期2006年5月30日優先權日2005年5月30日發明者鹽崎哲也申請人:第一三共株式會社