專利名稱：用于內毒素測定的試劑以及使用該試劑進行測定的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于內毒素測定的試劑、一種用于內毒素測定的藥盒、一種進行內毒素測定的方法、一種用于預處理樣品的載體、一種抑制G因子激活的方法以及一種G因子激活抑制劑，其中使用了鱟血液變形細胞溶解物試劑。
利用鱟血液變形細胞溶解物(本文此處以后簡稱為“溶解物”)進行內毒素測定(本文此處以后稱為“Et”)的方法被人們熟稱為鱟試驗。由溶解物的反應構成的該測定稱為鱟反應。鱟試驗靈敏度很高，已廣泛用于對藥物和水的致熱原檢測、診斷用途等等。鱟試驗是建立在在痕量內毒素存在的情況下溶解物凝集的基礎之上的。最新的生化研究已經闡明鱟試驗是由數種凝集因子逐步激活所構成的事實(J.Protein Chem，5，255-268(1986))。
下面參考

圖1，以鱟(Tachypleus Tridentatus)的溶解物說明鱟反應。當內毒素加至溶解物中后，溶解物中的C因子(一種對內毒素敏感的因子，分子量123，000)被激活。激活的C因子局限地在特異位點水解B因子(分子量64，000)，產生激活的B因子。已激活的B因子激活前凝固酶(分子量54，000)使其轉化為凝固酶。凝固酶在環袢中由二硫鍵交聯的特異位點上局限地水解凝固蛋白原(coagulogen)(促凝蛋白質;分子量19，723)，即在…Arg18與Thr19…之間和…Arg46與Gly47…之間水解，釋放相當于H-Thr19……Arg46-OH的C肽(28個氨基酸殘基)并將剩余部分轉化成凝固活素凝膠。因而，鱟反應是由一系列反應組成的(由內毒素引起的級聯反應本文此處以后稱為C因子系統反應)。
上述的溶解物級聯反應不僅由內毒素引起，也由(1→3)-β-D-葡聚糖(本文此處以后稱為β-葡聚糖)引起，即，圖1中的G因子(β-葡聚糖敏感因子)被β-葡聚糖激活，激活后的G因子將前凝固酶轉化為凝固酶，凝固酶以前述的內毒素同樣的方法作用于凝固蛋白原，產生凝固素凝膠(由β-葡聚糖引起的級聯反應本文此處以后稱為G因子系統反應)。
通過級聯反應產生的凝固酶也能水解另外加入到反應系統中的合成肽底物的酰胺鍵，這種底物如叔丁氧羰基-亮氨酰-甘氨酰-精氨酸-對硝苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)，水解后釋放對硝苯胺。因而，借助測定所釋放的對硝苯胺的吸收值可以定量測定內毒素或β-葡聚糖。
由于一般使用的溶解物含有有關C因子和G因子系統反應中的成分，因此將它用于測定樣本中內毒素有時會得到不精確的結果，因為樣本中可能含有的β-葡聚糖激發了G因子系統反應。
所以，鱟試驗已被證明對內毒素測定是非特異性的，已用許多嘗試試圖發展一種內毒素特異性測定的方法。例如，已報導的一種方法為借助使用只含C因子系統反應相關成分的溶解物餾分可以有效地進行內毒素特異性測定(Obayashi T.et al.，Clin.Chim. Acta，149，55-65(1985))。
然而，該方法需要極其復雜的操作以制備無G因子系統，包括用含固定其上的葡聚糖硫酸鹽的親和載體進行親和層析，使溶解物分餾從而消除β-葡聚糖敏感因子即G因子，以及重建用于內毒素特異性測定的C因子、B因子和前凝固酶。
另一方面，已知所有這些涉及鱟反應(C因子和G因子系統反應)的激活因子均為絲氨酸蛋白酶，并且鱟試驗在其它的絲氨酸蛋白酶存在時會產生假陽性而無論Et和β-D-葡聚糖是否存在，這些絲氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和凝血酶，它們可以通過其限制性水解將凝固蛋白原轉化為凝固活素凝膠或水解上述合成底物(Harada T.et al.，J. Med. Enzymol.，3，43-60(1978))。因此，目前應用鱟試驗不可能測定含絲氨酸蛋白酶樣品中的內毒素。
本發明的第一目的在于應用一種溶解物試劑，通過避免溶解物所含的β-葡聚糖敏感因子(G因子)的影響而只基于C因子系統反應特異性地測定樣本中的內毒素。
本發明的第二目的在于應用一種溶解物試劑，通過特異性抑制樣品中絲氨酸蛋白酶活性但不抑制溶解物中C因子系統反應所涉及的激活因子的活性排除假陽性反應，從而準確測定含絲氨酸蛋白酶樣品中的內毒素。
帶著上述的第一目的，本發明人篩選了能選擇性抑制溶解物中G因子系統反應也稱為由β-葡聚糖激活G因子和/或激活的G因子活性而不抑制C因子系統反應的物質。其結果是，發現了在不同的絲氨酸蛋白酶抑制劑中適量的抑肽酶能很強地抑制G因子系統反應而基本上不抑制C因子系統反應。
帶著上述的第二目的，本發明人也篩選了能選擇性抑制樣品中絲氨酸蛋白酶而不抑制溶解物中C因子系統反應的物質。結果發現通過在作為多種絲氨酸蛋白酶抑制劑之一的適量抑肽酶存在的情況下進行鱟反應或者在反應前將樣品與適量抑肽酶接觸可以選擇性抑制樣品中絲氨酸蛋白酶而不抑制C因子系統反應。
除抑肽酶外，我們還篩選了許多絲氨酸蛋白酶抑制物如α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ、α2-纖維蛋白溶酶抑制物、類卵粘蛋白抑制物、水蛭素、gabexate Mesylate等等，并且發現僅用抑肽酶即能優先抑制鱟反應中的G因子系統反應，而其它的絲氨酸蛋白酶抑制物不僅使樣本中絲氨酸蛋白酶失活，而且同時抑制了C因子系統和G因子系統反應，從而抑制整個鱟反應。在進一步發展這些發現的基礎上完成了本發明。
本發明提供了一種用于內毒素測定的試劑，它包括一種鱟血液變形細胞溶解物試劑和抑肽酶。
本發明也提供了一種用于內毒素測定的藥盒，它含有一種鱟血液變形細胞溶解物試劑和一種含抑肽酶的試劑。
本發明進一步提供了一種應用鱟血液變形細胞溶解物試劑進行內毒素測定的方法，其中將抑肽酶加入到鱟血液變形細胞溶解物試劑中和/或樣本中。
特別地在上面的測定方法中，加入到鱟血液變形細胞溶解物試劑和/或樣品中的抑肽酶是以能夠抑制鱟血液變形細胞溶解物試劑中存在的G因子激活的有效量應用的。并且，以抑制樣品中絲氨酸蛋白酶的有效量，向鱟血液變形細胞溶解物試劑和/或含絲氨酸蛋白酶的樣品中加入抑肽酶。
本發明進一步提供了一種用鱟血液變形細胞溶解物試劑測定含絲氨酸蛋白酶樣品中內毒素的方法，其中在測定前將樣品與固定了抑肽酶的不溶性載體接觸。
本發明進一步提供了一種在用鱟血液變形細胞溶解物試劑進行內毒素測定前對含絲氨酸蛋白酶樣品進行預處理的不溶性載體，在其上固定有抑肽酶。
此外，本發明提供了一種用于抑制G因子激活的方法，它包括向含有G因子的鱟血液變形細胞溶解物試劑中加入抑肽酶;一種G因子激活抑制物，它含有作為活性成分的、能夠抑制存在于鱟血液變形細胞溶解物試劑中的G因子活化的抑肽酶;和一種為C因子與內毒素反應維持理想pH范圍的緩沖劑。
圖1顯示了鱟反應的機制。圖2為顯示實施例1-2結果的圖，其中標定曲線是通過繪制作為抑肽酶加入量作用的吸收值對內毒素濃度的圖獲得的(-O未加，-△-2.0mg，-□-4.0mg和-●●-6.0mg)。
抑肽酶，也稱為堿性胰蛋白酶抑制物，是一種含有58個氨基酸殘基和等電點為10.5的堿性多肽，它是從牛肺、胰腺或腮腺中提取的，它能抑制多種細胞內蛋白酶如激肽釋放酶、血纖維蛋白溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等。作為藥物，抑肽酶由Bayer AG生產，其商品名為Trasylol。
本發明中使用的鱟血液變形細胞溶解物試劑(本文此處以后簡稱為“溶解物試劑”)的例子包括以常規方法從馬蹄蟹(horseshoe Crab)如Limulus polyphemus、Tachypleus tridentatus、Tachypleus gigas、Carcinoscorpius rotundicauda等血淋巴中制備的變形細胞提取物(Cf. J. Biochem.，80，1011-1021(1976))。向這些提取物中可以加入一種對C因子激活有效的二價金屬鹽，例如氫鹵化物(如氯化物)、硫酸鹽或堿土金屬這一類(如鎂、鈣、鍶或類似的物質);一種凝固酶的底物，如上述的合成底物，Boc-Leu-Gly-Alg-pNA，以及一種pH調節劑，如Tris-Hcl或類似緩沖液。也可用商售的溶解物試劑。溶解物試劑可以是任何形式，如液體、粉末、固體等。
根據本發明，優先使用含有G因子的溶解物試劑，但那些G因子已被去除或已用抑肽酶以外的抑制物使G因子失活的溶解物試劑也可以使用。
前述的本發明的第一目的可通過內毒素測定達到，該測定包括(A)應用通過將抑肽酶加至溶解物試劑以使G因子系統反應相關成分(本文此處以后稱為“含抑肽酶溶解物試劑”)失活制備的一種試劑，(B)將抑肽酶加入樣品并使用常用溶解物試劑測定樣品從而抑制溶解物試劑中的G因子系統反應相關成分的激活，或者將(A)和(B)相結合的方法，其中將抑肽酶加至溶解物試劑和樣本兩者中。
在該情況下，盡管用于完全抑制G因子系統反應所必須的抑肽酶的量決定于溶解物試劑的類型，但該領域技術人員很容易地通過下面的預實驗確定其適合的量。
以冰浴冷卻，將抑肽酶(不含內毒素)以不用量加至預訂量的溶解物試劑中，然后再加入在常規測量條件下能完全激活溶解物試劑量的不含內毒素的β-葡聚糖，再在常用條件下進行反應。在這些條件下，可以確定能完全抑制由β-葡聚糖對溶解物試劑激活的抑肽酶的量。
基于因此確定的抑肽酶的量，能夠確定相應于樣品中內毒素的濃度使C因子系統反應繼續進行的抑肽酶適宜的量。使用的抑肽酶的量約為每1ml溶解物試劑中5mg至500mg。
上述本發明的第二目的可通過內毒素測定達到，該測定包括(C)使抑肽酶與樣品中絲氨酸蛋白酶反應和隨后所產生的反應混合物與含抑肽酶的溶解物試劑反應，(D)向樣品中加入能使溶解物試劑中G因子活性抑制的量的抑肽酶，并使樣品與溶解物試劑反應，(E)預先向溶解物試劑中加入能使溶解物試劑中G因子以及樣品中絲氨酸蛋白酶活性抑制的量的抑肽酶或(F)先使含絲氨酸蛋白酶的樣品與有抑肽酶固定的不溶性載體接觸，然后去除或失活絲氨酸蛋白酶，繼而檢測用溶解物試劑如此處理后的樣品。
然而應該注意到方法(E)在抑肽酶以不抑制C因子活性的用量范圍使用時有效。
而且，在應用(C)至(E)的方法時，由于使用的抑肽酶僅為抑制絲氨酸蛋白酶所需的用量，因此用Et特異性溶解物試劑使Et測定更準確和簡單，C因子系統反應因而更易控制。在該情況下，可以從前述的抑肽酶劑量范圍中去掉G因子所需的用量。除非所給定的量足以進行內毒素測定，否則量也可不減少。
在應用(C)至(E)的方法時，樣品可以是絲氨酸蛋白酶制備物(換句話說，即確知絲氨酸蛋白酶制備物中Et存在)或者樣品可能被絲氨酸蛋白酶污染。在該情況下，按下述方法可確定抑肽酶的用量。
在合成的底物方法中，將不同濃度的抑肽酶和樣品加至使用合成底物方法的鱟試劑中，該試劑中其溶解物成分被蒸餾水替代，所得混合物在37℃下孵育以使通常的鱟反應有效進行，然后確定顯示與空白試驗同樣值的抑肽酶的量，該劑量可用于測定樣品。
在凝膠化方法或混濁性方法中，將不同濃度的抑肽酶和樣品加至去除或失活了C因子和G因子并含有凝固蛋白原的溶解物試劑中，所得混合物于37℃下孵育以使通常的鱟反應有效進行，然后確定顯示與空白試驗同樣值的抑肽酶的量。通過向樣品中加入所確定量的抑肽酶而進行Et測定。
在該情況下，前述的抑肽酶的量為所需值，在不影響內毒素測定的范圍內其用量可以稍有增加。
盡管抑肽酶的量決定于樣品中所含絲氨酸蛋白酶的類型和量，但抑肽酶可以以足以完全抑制樣品中所含絲氨酸蛋白酶的量進行應用，而且它基本上不干擾C因子系統反應。特殊的是，在實際應用中通常加入抑肽酶總的用量約為1～2000mole/每mole蛋白酶，或約為300ug到10mg。
因此，當測試樣品含有絲氨酸蛋白酶以及溶解物試劑含G因子時，抑肽酶的用量為抑制G因子和絲氨酸蛋白酶兩者所需量的總和。
在應用方法(F)時，固定于不溶性載體上抑肽酶的量可由每個樣品中所含絲氨酸蛋白酶及類似因子的量加以確定，但一般在2～100mole/mole絲氨酸蛋白酶的范圍內。如果不溶性載體不含Et而且可化學固定抑肽酶而不降低預期的活性，不溶性載體就無特別限定。這類載體的示例包括酰胺化合物、纖維素化合物、瓊脂糖化合物、聚丙烯酰胺化合物、葡聚糖化合物、乙烯基聚合化合物(含異丁烯酸縮水甘油酯的有孔共聚物)等等。可以用常用的方法固定抑肽酶，如將甲酰基導入纖維素凝膠，然后在NaCNBH3存在的情況下使抑肽酶與處理過的凝膠結合的方法，以及重氨化法、CNBr法、酸性重氨化物法等等。
不溶性載體可以任何形式使用。它可以塑成珠狀、尖頭狀、管狀、薄膜狀等等。不溶性載體的例子包括用于親和層析的任何商售的載體如由CNBr法激活的瓊脂糖凝膠(如可從Pharmacia得到的瓊脂糖凝膠等)以及含有如甲酰基或羧基活性基團的纖維素載體(如甲酰基-Cellulofine、羧基-Cellulofine等，兩者可從SeikagaRu Corporation得到)。
方法(F)中，將含絲氨酸蛋白酶的樣品與抑肽酶固定的不溶性載體接觸，所得到的未吸收溶液用于測定。在該處理中，有必要采取特殊預防措施防止Et污染。根據(C)到(E)的方法，可以簡單而快速測定Et而Et污染樣品的危險最小。
內毒素測定法如除方法(F)外的(A)至(E)的方法可在抑肽酶存在的情況下進行，例如，按照下面(ⅰ)至(ⅸ)的方法。
(ⅰ)一種將抑肽酶加入變形細胞中，然后提取用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法。
(ⅱ)一種將抑肽酶加入提取的溶解物中用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法。
(ⅲ)一種將凍干的溶解物試劑制備物溶解在含抑肽酶溶液中用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法。
(ⅳ)一種將抑肽酶加入溶解在適宜溶液中的凍干溶解物試劑制備物中、用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法。
(ⅴ)一種將凍干制備物溶于適宜溶液中、用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法，其中的凍干制備物是通過將抑肽酶加至變形細胞中，然后提取、凍干或者是將必需量的抑肽酶加至溶解物試劑中、然后凍干的方法制備的。
(ⅵ)一種將含溶解物試劑和一種合成底物的凍干制備物溶解于含抑肽酶溶液中或者將抑肽酶加入在適宜溶液中溶解凍干制備物而制備的溶液中、用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法。
(ⅶ)一種將由向溶解物試劑與合成底物的混合液中加入必需量抑肽酶、然后凍干制備的試劑溶解于適宜溶液中、用作測定Et的含抑肽酶溶解物試劑的方法。
(ⅷ)一種將必需量抑肽酶加入受測試樣品中的方法。
(ⅸ)一種將受測樣品加至溶解物試劑中、然后立即加入抑肽酶的方法。
在此情形下，方法(ⅷ)可單獨應用或者與方法(ⅰ)至(ⅶ)一同應用。
在上述方法(ⅳ)、(ⅴ)、(ⅵ)和(ⅶ)中用來溶解凍干制備物的試劑為一適宜緩沖液，該緩沖液能夠穩定地維持溶解物試劑中涉及C因子系統反應的成分并能維持C因子與內毒素反應的理想pH范圍(pH7.0至8.5)。該溶液的例子包括水和能維持上述pH范圍的緩沖液，緩沖液含有緩沖劑如Tris(羥甲基)氨基甲烷、Tris(羥甲基)-氨基甲烷馬來酸鹽、1.4-哌嗪二乙烷基磺酸鹽、碼啉代丙烷磺酸鹽、N-2羥乙基哌嗪-N′乙烷磺酸鹽、三乙醇胺、咪唑和Tris(羥甲基)咪唑。上述方法(ⅲ)和(ⅵ)中使用的含抑肽酶溶液是通過將必需量的抑肽酶加至前述的溶液中而制備的。
由上面所述，如果在溶解物試劑中C因子系統反應可正常進行或在一合理的功能范圍內進行并且可進行Et的定量或定性測定，那么在本發明的Et測定法中，抑肽酶可以任選方式進行應用。
通過確定由圖1所示級聯反應激活形成的凝固酶的活性可以以通常方法進行應用本發明試劑的內毒素測定。
為測定凝固酶的酰胺酶活性，可以應用前述含有生色殘基的合成肽底物以及其類似合成肽底物，該類似底物具有同樣肽順序但其C末端氨基酸的羧基被取代，在前述的生色殘基的位置上以已知的熒光殘基、發光殘基、氨等通過酰氨鍵替代。借助測定由凝固酶作用合成底物生成的反應產物而確定酰胺酶活性。例如，將上述合成底物與含本發明的試劑和內毒素的反應系統共存，則可以分光光度計、熒光光度計、化學發光探測器、氨檢測電極(JP-A-62-148860;這里所用的詞“JP-A”表示“未審查公開的日本專利申請)等方法分別檢測由反應(級聯反應和必要時的將反應產物轉變為其它染色物質的反應)生成的染色物質、熒光物質或氨。
借助一種方法可以測定凝固酶的蛋白酶活性，該方法為將凝固酶與含于本發明試劑中或另外加入的凝固原(底物)反應，然后用例如適宜儀器如濁度測量儀、粘度測量儀等或用肉眼判斷測定所產生的凝＃固活素凝膠化。
在本發明測定的實際應用中，有必要應用對前述級聯反應系統激活有效的二價金屬鹽。這些二價金屬鹽的例子包括如鎂、鈣、鍶等堿土金屬的氫鹵化物(氯化物)和硫酸鹽。
盡管這些金屬鹽可單獨加入鱟反應中，但最好是將二價金屬鹽加至溶解物試劑中并將混合物在無加熱條件下如凍干干燥至固體狀。用于測定酰胺酶活性的試劑除二價金屬鹽外優選與前述合成肽底物共存，它還可進一步干燥。
借助應用含上述試劑的藥盒可使根據本發明的內毒素測定更容易和更迅速。本發明的藥盒包括溶解物試劑和含抑肽酶的試劑。含抑肽酶試劑可進一步包括前述的緩沖劑。該藥盒的特殊例子包括(1)一種凍干的溶解物試劑和溶有溶解物試劑的溶液;(2)凍干的抑肽酶和溶有抑肽酶的溶液;(3)凍干的標準內毒素和溶有標準內毒素的溶液;以及(4)用于合成生色底物法的試劑，包括用于空白試驗的蒸餾水。
對進行Et測定的受試樣品并無特別限制，任何需要測定Et的樣品或證實其存在的樣品均可以使用。這些樣品的例如包括生物制品、藥物、醫療用水等。正如前述，本發明尤其在測定含絲氨酸蛋白酶樣品時有用。
根據本發明，對受試樣品中所含的絲氨酸蛋白酶類型無特別限定，條件是其活性可被抑肽酶抑制。這些絲氨酸蛋白酶的例子包括激肽釋放酶、血纖維素蛋白溶酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶等。
下面提供的實施例用于進一步說明本發明，但不應被理解為限制本發明的范圍。
實施例1用由將抑肽酶加至溶解物試劑而制備的試劑進行的Et測定1)將1.0升T.tridentatus的血淋巴于4℃以1，500rpm離心10分鐘，所獲得的約21g的沉淀物(變形細胞)與210ml0.02M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)混合并在攪勻器(Polytron R RT10，Kinematica生產的商標名)攪勻以進行提取。所產生的均漿在冰冷卻的條件下以10，000XG離心30分鐘以獲得190ml上清液(溶解物試劑)。
將0.04ml的含0.5、1.0、2.0、4.0或6.0mg抑肽酶的0.5M Tris-Hcl/0.4M硫酸鎂緩沖液(pH8.0)和0.02ml的4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml所獲得的溶解物試劑中，從而獲得含抑肽酶的溶解物試劑(發明)。另外，將0.04ml不含抑肽酶的0.5M Tris-Hcl/0.4M硫酸鎂緩沖液(pH8.0)和0.02ml4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml溶解物試劑中。向這些體系中各加入0.1ml蒸餾水(空白，本文此處以后稱為“DW”)或β-葡聚糖(500ng/ml，以下述的方法制備)成為受試樣品。在所得的每種混合物于37℃反應30分鐘后，按順序向反應混合物中加入0.5ml0.04%亞硝酸鈉(0.48M鹽酸溶液)、0.5ml0.3%氨基磺酸銨和0.5ml0.07%N-1-荼乙烯二胺二鹽酸鹽使所生成的對-硝基苯胺進行重氮偶合。然后測定于545nm處的吸收值，這些樣品與空白吸收值的差異被認為是反應性。結果見于表1(表中差異表示為“△”，其它表和圖中也是如此)。
表1抑肽酶量(mg) 反應性(△A545nm/30min)0 >1.50.5 0.4371.0 0.1532.0 0.0004.0 0.0006.0 0.000正如表1所顯示，當0.04ml溶解物試劑中加入2.0mg或更多抑肽酶時，溶解物試劑中G因子的激活可被完全抑制。
2)將0.04ml含能完全抑制溶解物試劑中G因子系統反應的2.0、4.0或6.0mg抑肽酶的0.5MTris-Hcl/0.4M硫酸鎂緩沖液(pH8.0)和0.02ml4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml上述1)制得的溶解物試劑中，以獲得含抑肽酶溶解物試劑。另外，將0.04ml不含抑肽酶的0.5M Tris-Hcl/0.4M硫酸鎂緩沖液(pH8.0)和0.02ml 4.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA加至0.04ml溶解物試劑中。向這些體系中各加入0.1mlDW(空白)或源自大腸桿菌0111∶B4(Westphal型，可從Sigma所得;6.25、12.5、25.0或50.0pg/ml)的Et制成樣品。此后，以前面1)所描述的相同的辦法進行反應以制備Et的校正曲線。結果見于圖2。
由圖2可以發現當加入的抑肽酶的量增加時與Et的反應性減小。借助于應用校正曲線，可以選出相應于每個樣品中Et濃度激活溶解物試劑中C因子系統反應的抑肽酶的量。
而且，很明顯使用鱟試劑可以有效進行Et測定而沒有β-葡聚糖的影響，鱟試劑是將抑肽酶加至常規溶解物試劑中制成的。
β-葡聚糖的制備按照WO90/02951公開的方法進行。將1克凝膠多糖(可從Wako Pure Chemical lndustries得到)懸浮于大約100ml5mM NaOH 水溶液中，并用SonicatorTM(Model5202 PZT，由Ohtakc Seisakusho，Tokyo生產)在冰冷卻條件下以20KHz、80W聲波處理12分鐘以降解凝膠多糖。用5M NaOH水溶液將所產生的溶液調至NaOH終濃度為3M，然后進行凝膠滲透層析(GPC柱，2個TSK凝膠G3000PWXL和一個G2500PWXL;流動相，0.3MNaOH水溶液;流量，0.5ml/min)。收集產生的餾分并再次進行層析以收集分子量為216，000的餾分，從而獲得GPC-分餾純化的β-葡聚糖制備物。
所得的β-葡聚糖制備物也用于下面的實施例實施例2用由將抑肽酶加至變形細胞然后提取制備的試劑進行的Et測定將1.0升T. tridentatus的血淋巴于4℃以1，500rpm離心10分鐘，所得的約21g沉淀物(變形細胞)與210ml含12g抑肽酶的0.02M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)混合并于Polytron R pT10中攪勻以進行提取。所得均漿在冷卻條件下以10，000XG離心30分鐘以獲得190ml上清液(含抑肽酶的溶解物試劑)。
向0.04ml如此獲得的含抑肽酶溶解物試劑(發明)和0.04ml以同樣方法制得但不加抑肽酶的溶解物試劑(對照)中均加入0.01ml 2M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)、0.03ml0.4M氯化鎂和0.02ml3.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA，然后再加0.1ml的DW(空白)、Et或β-葡聚糖制成樣品。進一步地加入含兩倍濃度的Et和β-葡聚糖各0.05ml制成另外一種樣品。將所得每種混合物于37℃孵育30分鐘，然后加入0.4ml0.8M乙酸中止反應，通過測定405nm處的吸收值確定生成的硝基苯胺以比較反應性。結果示于表2。
從結果中明顯看出用含抑肽酶的溶解物試劑可有效地進行Et測定而不受β-葡聚糖的影響，該 抑肽酶的溶解物試劑是在提取前將抑肽酶加至鱟血淋巴變形細胞中制得的。換句話說，證實了在本發明的測定系統中G因子系統反應基本被抑制而未抑制C因子系統反應。
表2反應性(△A405nm/30min)樣品 發明 對照Et* 0.317 0.344β-葡聚糖**0.000 0.183Et+β-葡聚糖 0.317 0.526*Et濃度 :3.0pg/0.1ml樣品**β-葡聚糖濃度 :5.0pg/0.1ml樣品實施例3用將凍干溶解物試劑溶于含抑肽酶溶液制備的試劑進行的Et測定將一管形瓶“Pyrotel-T”(用于凝膠化方法的、由L. Polyphemus制備的凍干溶解物試劑制備物，由Capecod生產，可從Seikagaku Corporation得到)溶于5.0ml預先已溶入270mg抑肽酶的DW中(發明)。將另一管形瓶凍干鱟試劑制備物溶于5.0ml不含抑肽酶的DW中(對照)。將這些溶液以0.1ml的量分散于試管中，然后加入0.1mlDW(空白)、Et或β-葡聚糖制成樣品。進一步地，加入含兩倍濃度的Et和β-葡聚糖各0.05ml制成另一種樣品。在輕柔混合反應混合物后，將每支試管排列于附于濁度分析儀(Toxinometer ET-201，可從Wako Pure ChemicalIndustries購得)上的分析倉上，于37℃溫育60分鐘以記錄凝膠化時間(Tg)并從而檢測本發明試劑的反應性。結果示于表3。
從該結果明顯看出在樣品加入之前，向商售凍干溶解物試劑(凝膠化法鱟試驗試劑)中加入抑肽酶可使Et測定有效地進行而不受β-葡聚糖的影響。
表3反應性(Tg,min)樣品 發明 對照DW(空白) >60 >60Et* 33.5 29.7β-葡聚糖** >60 32.3Et+β-葡聚糖 33.3 19.6*Et濃度 :2.0pg/0.1ml樣品**β-葡聚糖濃度 :40.0pg/0.1ml樣品實施例4用將含溶解物試劑和含合成底物的凍干制備物溶于含抑肽酶的溶液中制備的試劑進行Et測定將一管形瓶“Toxicolor System LS-200 Set”(一種含由T.tridentatus制備的溶解物試劑和用于生色合成底物法的Boc-Leu-Gly-Arg-pNA，由Seikagaku Corporation生產和銷售的凍干制備物)溶于2.8ml預先溶入140mg抑肽酶的0.2M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)中以獲得本發明的試劑。將另一管形瓶凍干制備物溶于2.8ml不含抑肽酶的0.2M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)中以作為對照試劑。向這些溶液中的每種溶液的0.1ml中加入0.1mlDW(空白)、Et或β-葡聚糖制成受試樣品。進一步地，加入含兩倍濃度的Et和β-葡聚糖各0.05ml制成另一樣品。這些混合中的每一種都以實施例1-1)所描述的同樣方法反應從而可評估本發明試劑的反應性。結果示于表4。
表4反應性(△A545nm/30min)樣品 發明 對照Et* 0.863 0.891β-葡聚糖**0.000 >1.5Et+β-葡聚糖 0.863 >1.5*Et濃度 :5.0pg/0.1ml樣品**β-葡聚糖濃度 :50.0ng/0.1ml樣品由該結果明顯看出在樣品加入之前向商售生色合成底物法鱟試驗試劑(凍干制備物)中加入抑肽酶可有效地進行Et測定而不受β-葡聚糖的影響。
實施例5用將抑肽酶加至變形細胞中，然后提取，凍干混合物和將其溶于溶液中制備的試劑進行Et測定將2.0ml以實施例2同樣的方式提取前加入抑肽酶至變形細胞制備的含抑肽酶溶解物試劑與0.4ml0.4M氯化鎂混合，然后凍干以得到用于本發明Et測定的試劑。也將2.0ml以實施例1-1)同樣的方式制備的不含抑肽酶溶解物試劑與0.4ml 0.4M氯化鎂混合，然后凍干得到對照試劑。將這兩種凍干制備物分別溶于2.0mlDW中。向各為0.1ml的這兩種溶液中加入0.1mlDW(空白)、Et或β-葡聚糖制成樣品。輕輕混合后，將混合物靜置于37℃溫育60分鐘，然后將試管傾斜180°通過肉眼判斷凝膠的生成以評估本發明試劑的反應性。結果示于表5。表中“+”表示凝膠生成，“-”表示無凝膠生成。
表5反應性樣品 發明 對照DW(空白) - -Et* + +β-葡聚糖** - +*Et濃度 :4.0pg/0.1ml樣品**β-葡聚糖濃度 :40.0ng/0.1ml樣品由該結果明顯看出由凍干在提取前將抑肽酶加至變形細胞制成的含抑肽酶溶解物試劑可以有效地進行Et測定而不受β-葡聚糖的影響。
實施例6用將含溶解物試劑、合成底物和抑肽酶的凍干制備物溶于溶液中制成的試劑進行Et測定將2.0ml由實施例1-1)制得的不含抑肽酶溶解物試劑與0.9ml3.4mM生色合成底物(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)、1.0ml0.8M硫酸鎂和0.5ml抑肽酶水溶液(240mg/ml)混合。凍干混合物得到用于本發明Et測定的試劑。按同樣的方法制備對照試劑，只是用0.5mlDW替代抑肽酶水溶液。將獲得的每種凍干制備物溶于5.0ml0.2M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)中。向各為0.1ml的所產生的溶液中加入0.1mlDW(空白)、Et或β-葡聚糖制成樣品。進一步地，將含兩倍濃度的Et和β-葡聚糖各0.05ml加入制成另一樣品。每種混合物均以實施例1-1)所述同樣的方法反應以評估本發明試劑的反應性。結果示于表6。
表6反應性(△A545nm/30min)樣品 發明 對照Et* 0.669 0.697β-葡聚糖** 0.000 >1.5Et+β-葡聚糖 0.669 >1.5*Et濃度 :4.0pg/0.1ml樣品**β-葡聚糖濃度 :40.0ng/0.1ml樣品由該結果明顯看出應用由凍干含溶解物試劑、合成底物和抑肽酶制備的試劑可以有效地進行Et測定而不受β-葡聚糖的影響。
實施例7先將抑肽酶加入樣品中的Et測定制備DW(空白)、Et、β-葡聚糖和含兩倍濃度的Et和β-葡聚糖同體積混合物，以其作為受試樣品。向0.05ml各樣本中加入0.05ml抑肽酶水溶液(100mg/ml)，然后加入0.1ml已溶于2.8ml0.2M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)中的“Toxicolor System Ls-200 Set”。而后，使各如此制備的混合物以實施例1-1)所述同樣的方式反應。重復同樣步驟，只是用同體積DW取代抑肽酶水溶液以比較其反應性。結果示于表7。
表7反應性(△A545nmn/30min)樣品 加抑肽酶 不加抑肽酶Et* 0.883 0.928β-葡聚糖** 0.000 >1.5Et+β-葡聚糖 0.885 >1.5*Et濃度 :5.0pg/0.05ml樣品**β-葡聚糖濃度 :30.0ng/0.05ml樣品由該結果明顯看出將抑肽酶先加至樣品可以有效地進行Et測定而不受β-葡聚糖的影響。
實施例8將樣品加至溶解物試劑中然后立即再加入抑肽酶所進行的Et測定將一管形瓶“Pyrotel”(用于凝膠化法的、由L.Polyphemus制備的溶解物試劑凍干制備物，由Capecod生命、可從Seikagaku Corporation得到)溶于5.0mlDW中。將制得的溶液在冰冷條件下以0.1ml每份分散于試管中，然后向試管中加入0.05mlDW(空白)、Et或β-葡聚糖制成樣品。其后立即分別向試管中加入0.05ml抑肽酶水溶液(110mg/ml)。輕輕混合，將各混合物于37℃靜置溫育60分鐘，以實施例5所述同樣的方法判斷凝膠的生成。重復同樣步驟，只是以同體積DW替代抑肽酶水溶液以比較其反應性。結果示于表8。
表8反應性樣品 加抑肽酶 不加抑肽酶DW(空白) - -Et* + +β-葡聚糖** - +*Et濃度 :2.0pg/0.05ml樣品**β-葡聚糖濃度 :20.0ng/0.05ml樣品由該結果明顯看出將樣品加至溶解物試劑中然后立即再加入抑肽酶可有效地進行Et測定而不受β-葡聚糖的影響。
實施例9將抑肽酶加至含絲氨酸蛋白酶樣品中進行的Et測定將0.01mlDW或Et溶液(400pg/ml)加至0.01ml100ug/ml的胰蛋白酶(來源于牛胰腺，由Miles Laboratories生產，可從Seikagaku Corporation得到)溶液或DW中，再向其加入0.08ml抑肽酶水溶液(5.0mg/ml)，然后混合。各種制得的混合物進一步與0.1ml用于Et-特異性生色合成底物法的鱟試驗試劑(Endospecy，可從Seikagaku Corporation得到)混合，然后按實施例1-1)所述進行同樣的反應，以測定加至胰蛋白酶樣品中的Et的回收率。重復同樣步驟，只是以0.08mlDW取代抑肽酶水溶液。結果示于表9。
表9樣品中加入 加入Et 未加入Et △A545nm Et的回收率樣品 抑肽酶 (A545nm) (A545nm) (%)DW 有 0.729 0.070 0.659 100胰蛋白酶 有 0.743 0.095 0.648 98.3DW 無 0.701 0.031 0.670 100胰蛋白酶 無 >1.5 >1.5 - -由表9所示結果明顯看出預先將抑肽酶加至胰蛋白酶樣品中進行鱟試驗可以準確地進行含胰蛋白酶樣品的Et測定。
實施例10將抑肽酶加至溶解物試劑中所進行的含絲氨酸蛋白酶樣品的Et測定將0.08ml抑肽酶水溶液(8mg/ml)加至0.1ml Toxicolar System Ls-200 Set中，然后混合。再向其中加入0.02ml由10單位/ml凝血酶(源于牛血清，可以從Sigma得到)溶液或DW與同體積Et溶液(400pg/ml)混合制成的溶液。使每一種制得的混合物按實施例1-1)所述進行同樣反應以測定加至凝血酶樣品中的Et的回收率。重復同樣步驟，只是以0.08mlDW取代抑肽酶水溶液。結果示于表10。
表10溶解物試劑中 加入Et 未加入Et △A545nm Et的回收率樣品 加入抑肽酶 (A545nm) (A545nm) (%)DW 有 0.718 0.068 0.650 100凝血酶 有 0.764 0.116 0.648 99.7DW 無 0.693 0.028 0.665 100凝血酶 無 >1.5 >1.5 - -由表10所示結果明顯看出將抑肽酶加至鱟試驗試劑中可準確地進行含凝血酶樣品中的Et測定。
實施例11在鱟試驗前將含絲氨酸蛋白酶的樣品用固定有抑肽酶的不溶性載體預處理所進行的Et測定將10ml200ug/ml胰蛋白酶(源于豬胰腺，Sigma生產)溶液應用于層析柱(1.2×400m)上，該柱裝有已用含0.15MNacl的0.1M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)平衡過的無Et的、固定有抑肽酶的Cellulofine(按下面的方法制備)。然后用含0.15MNacl的0.1M Tris-Hcl緩沖液(pH8.0)洗脫，收集過柱的餾分。向0.1ml收集的餾分或0.1mlDW中加入0.01mlET溶液(400pg/ml)，再加0.1ml Endospecy。所得混合物按實施例1-1)中同樣的方法反應以測定餾分中Et的回收率。重復同樣步驟，只是將0.1mlDW或Et溶液以及之后加的0，1ml Endospecy加至0.01ml未處理的胰蛋白酶溶液中。結果示于表11。
表11加Et 不加Et Et的回收率樣品 (A545nm) (A545nm) △A545nm (%)DW 0.709 0.032 0.677 100過柱餾分 0.710 0.034 0.676 99.9未處理胰蛋白酶 >1.5 >1.5 - -由表11所示的結果明顯看出將胰蛋白酶預先與固定有抑肽酶的不溶性載體接觸后進行鱟試驗可準確地測定含胰蛋白酶樣品中的Et。固定有抑肽酶的Cellulofine的制備。
將10g甲酰-Cellulofine(由Chisso生產并可從Seikaqaku Corporation得到)以0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.1)充分洗滌，并懸浮于20ml抑肽酶溶液(溶于0.1M磷酸鈉緩沖液中，pH7.1濃度為20mg/ml)中。向懸浮液中加入50mgNaCNBH3。室溫下輕輕攪動8小時后，將懸浮物用0.2M Tris-Hcl緩沖液(pH7.0)洗滌并過濾。然后向所得殘留物中加含10mgNaCNBH3的5ml上述緩沖液，再于室溫下搖動3小時。其后，用含0.15MNacl的0.1MTris-Hcl緩沖液(pH8.0)充分洗滌所得的懸浮物。
實施例12重復實施例2的步驟，只是應用了0.1ml來自被懷疑患有并發膿毒癥病人的富含血小板血漿作為樣品，該血漿按照美國專利4，495，294所述的方法用高氯酸處理過并被中和。改樣品也按通常方法進行培養以檢測微生物感染。結果，與Et定量反應性一致，測出了許多大腸桿菌菌落。
當將同一樣品按照與實施例3至8的一致步驟試驗時，也證實了本發明試劑或方法的有效性。
因此，用于Et測定的試劑可以通過將溶解物試劑與抑肽酶聯合起來這一簡單和經濟的方法制備。它對于測定來自于被懷疑患有感染性疾病或膿毒癥病人、但又未證實含有內毒素的臨床樣品尤其有用，并且它能準確地判斷真正的革蘭氏陰性菌感染(內毒素血癥)。而且，本發明的優點還在于許多含絲氨酸蛋白酶樣品中所含的內毒素能容易和準確地被測出，而這些樣本由于絲氨酸蛋白酶很強地干擾鱟反應所以不能以常規鱟試驗進行測定，或者需要進行復雜的預處理。
由于已詳細描述了本發明及有關特殊實施例，本領域技術人員應清楚在不離開本發明的精神和范圍的情況下可以在其中進行許多變化和修改。
權利要求
1.一種包括鱟血液變形細胞溶解物試劑和抑肽酶的用于內毒素測定的試劑。
2.根據權利要求1用于內毒素測定的試劑，其中所說的抑肽酶含量為能有效抑制存在于所說鱟血液變形細胞溶解物試劑中G因子的激活的量。
3.一種包括鱟血液變形細胞溶解物試劑和含抑肽酶的試劑、用于內毒素測定的藥盒。
4.根據權利要求3的藥盒，其中所說含抑肽酶的試劑進一行含有緩沖劑。
5.一種用鱟血液變形細胞溶解物試劑測定樣品中內毒素的方法，其中將抑肽酶加至所說鱟血液變形細胞溶解物試劑和/或樣品中。
6.根據權利要求5用于內毒素測定的方法，其中加至鱟血液變形細胞溶解物試劑中的抑肽酶的量為能有效抑制存在于鱟血液變形細胞溶解物中G因子的激活的量。
7.根據權利要求5用于內毒素測定的方法，其中所說的樣本含絲氨酸蛋白酶，加至所述鱟血液變形細胞溶解物試劑和/或樣品中的抑肽酶的量為能有效抑制樣品中所說的絲氨酸蛋白酶的量。
8.根據權利要求5用于內毒素測定的方法，其中抑肽酶是以能有效抑制存在于鱟血液變形細胞溶解物試劑中的G因子激活和有效抑制樣品中存在的絲氨酸蛋白酶的量應用的。
9.一種用鱟血液變形細胞溶解物試劑測定樣品中內毒素的方法，其中鱟血液變形細胞溶解物試劑中的G因子被去除或失活，加入含絲氨酸蛋白酶樣品中的抑肽酶的量為能有效抑制所說絲氨酸蛋白酶的量。
10.一種用鱟血液變形細胞溶解物試劑測定含絲氨酸蛋白酶樣品中內毒素的方法，其中測定前樣本與固定有抑肽酶的不溶性載體接觸。
11.一種根據權利要求10測定內毒素的方法，其中鱟血液變形細胞溶解物試劑含有能有效抑制鱟血液變形細胞溶解物試劑中存在的G因子激活量的抑肽酶。
12.一種在用鱟血液變形細胞溶解物試劑進行內毒素測定之前預處理含絲氨酸蛋白酶樣品的不溶性載體，其上固定有抑肽酶。
13.一種用于抑制鱟血液變形細胞溶解物試劑中存在的G因子激活的方法，它包括將抑肽酶加至鱟血液變形細胞溶解物試劑中。
14.一種G因子激活抑制劑，它包括作為一種活性成分、能抑制鱟血液變形細胞溶解物試劑中存在的G因子激活的抑肽酶和一種用于為C因子與內毒素反應維持理想pH范圍的緩沖劑。
全文摘要
本發明提供了(1)一種用于內毒素測定的試劑；(2)一種用于內毒素測定的藥盒；(3)一種用鱟血液變形細胞溶解物試劑測定樣品中內毒素的方法；(4)一種用鱟血液變形細胞溶解物試劑測定含絲氨酸蛋白酶樣品中內毒素的方法；(5)一種用于預處理含絲氨酸蛋白酶樣品的載體；(6)一種抑制G因子激活的方法；(7)一種G因子激活抑制劑。
文檔編號G01N33/579GK1105757SQ9410328
公開日1995年7月26日 申請日期1994年2月26日 優先權日1993年2月26日
發明者田中重則, 田村弘志, 相田和博 申請人:生化學工業株式會社