專利名稱：中草藥的鑒別方法
技術領域：
本發明涉及中草藥的鑒別方法。
背景技術：
中草藥的應用在我國已有上千年的歷史，是中華民族優秀文化的結晶。中草藥的分析是十分重要的，但同時也是非常復雜的。首先，種類不同的草藥含有的活性成分不同；其次，同種草藥的活性成分還受土壤、氣候和生長階段等因素影響，甚至是同一個草藥，不同部位活性成分的含量也是不同的；再者，中草藥也有一定的毒副作用。因此，如何快速、高效和方便的對中草藥中的活性成分進行定性定量分析，一直是中藥分析研究者努力的目標。
目前，用于中藥研究的方法主要是高效液相色譜(HPLC)法，而且其用于中草藥的指紋分析已有專利文獻報道(專利號200410014271)。此外核磁共振法指紋鑒別中草藥也申請了專利(專利號200510044396)。HPLC在分析中藥有效成分時，其優點是柱效較高、選擇性好、適用面廣等，但也存在以下不利因素(1)中藥成分復雜且不甚清楚，增加了樣品前處理的難度，且易造成污染，影響柱壽命；(2)每根柱的柱效實際不足1萬塔板；(3)消耗溶劑量大；(4)分析時間一般較長。核磁共振法不僅能夠進行定性和定量的分析，而且還能獲得更多的結構信息，但其操作較復雜且儀器昂貴，從而限制了其廣泛應用。
與它們相比，毛細管電泳法(CE)是一種新的分離分析技術，但發展迅速，且分離效率比HPLC高，用于中藥分析時具有許多優點(1)毛細管柱易清洗，不必擔心柱污染而報廢；(2)樣品前處理簡單；(3)分析時間短；(4)由于柱效高，有可能使同一分離條件適合多種樣品中多組分的分析；(5)所用化學試劑少，價廉，分析成本低；(6)分離模式多，適合于中藥中各類化學成分的分析。
與CE聯用用于檢測中草藥成分的主要方法是紫外光譜(UltravioletSpectrophotometry，UV)，UV檢測由于其通用性較好，結構簡單，是目前中草藥成分分析中最廣泛使用的檢測方法，但其主要缺點是靈敏度不高，這主要是光程太短所造成的。而電化學檢測法(ED)相對于UV法來說具有許多優點，如選擇性好、靈敏度高、設備和操作簡單、便于推廣使用等。這樣，將具有高分離效率的CE與高靈敏度的ED結合起來用于指紋鑒別中草藥對于保證入藥所用的草藥的真偽、質量、安全和藥效是非常有利的。但迄今為止，還沒有CE-ED法指紋鑒別中草藥的文獻以及專利報道。

發明內容
為了解決上述現有技術的不足，本發明提供一種新的中草藥的指紋鑒別方法，其特征在于通過毛細管電泳電化學分析方法鑒別中草藥。這是一種儀器廉價、操作簡單及快速和靈敏的分析方法，是將中草藥指紋圖譜分析與活性成分含量測定相結合從而控制及評價中草藥質量的方法。
本發明的方法分以下幾個步驟為了保證分離和檢測結果的重現性，分離毛細管和電極的處理是十分重要的1)、分離毛細管和電極的處理(1)毛細管處理毛細管在第一次使用前，通0.1mol L-1NaOH水溶液過夜。在操作過程中，為了保證分析結果的重現性，每次進樣間，用1-3min二次水、4-6min緩沖溶液沖洗毛細管；(2)電極的處理當分析標準品溶液時，操作前將碳纖維微盤電極(CFE)超聲0.5-1.5min，其可以使用至少1周；每次操作前將電極超聲外，還要將電極在緩沖溶液中循環掃描10-30周(-0.2V-1.2V)進行活化；2)、緩沖溶液的配制pH≥9.5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)用1.0mol L-1NaOH調pH值，pH值＜9.5的PBS緩沖溶液的配制是直接混合Na2HPO4和NaH2PO4的水溶液即可；3)、中草藥中活性成分標準品溶液的制備及其循環伏安實驗活性成分標準品溶液的制備將活性成分標準品用甲醇溶解配制成3-8mol L-1的溶液；活性成分標準品溶液的循環伏安實驗將33μm CFE在含有標準品的PBS溶液中循環掃描，考察其循環伏安行為；4)、檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察檢測條件的優化在1.0-1.3V間變化檢測電位、5-50mmol L-1間變化緩沖溶液濃度、7-11間變化緩沖溶液pH值、5-40s間變化進樣時間和5-22.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響；5)、中草藥樣品溶液的制備用帶有20-80目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.3-0.8g的草藥樣品用甲醇浸泡10-18h，然后水浴超聲30-60min，之后2000-3500rpm離心5-10min，此萃取過程再重復1-3次，最后，萃取液定容于5-10mL的甲醇中；進樣前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度進行分析；6)、中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得是在步驟4)中所獲得的最佳條件下進行電泳分析得到的；7)、對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分的峰高確定實際樣品中活性成分的含量；8)、對比所獲得的CE-ED指紋圖譜，分別從幾個不同的指紋片段鑒別同種植物的不同部位以及不同種植物，從而鑒別中草藥及其混淆品。
本發明的中草藥的鑒別方法與其它中草藥分析方法相比，其優點在于(1)CE的顯著特點是簡單、高效、快速和微量只需一根廉價的毛細管、一個微盤工作電極、直流高壓儀器(±30kV)、電化學分析儀和一些常用試劑即可；通常CE完成一個檢測過程只要幾分鐘到十幾分鐘，并且可以得到高達幾十萬/米的理論塔板數；采樣體積通常只有幾納升，特別是在分析有毒樣品時，對環境影響很小。
(2)毛細管通常是由石英玻璃制成，可以經受強堿、強酸的清洗，在復雜的中草藥樣品的測定中，有利于柱中樣品雜質的清除。
(3)電化學檢測與其它檢測方法相比，由于其只對電活性組分有響應，所以其選擇性好。另外，安培檢測的檢測限低，通常可達到10-8mol L-1，線性范圍達2-3個數量級。


圖1是馬兜鈴植物的根、徑葉和果實(即a青木香；b馬兜鈴；c天仙藤)的CE-ED指紋圖譜對比；圖中I和II分別是指紋片段I和II。
圖2是三種木通(即d關木通；e川木通；f木通)的CE-ED指紋圖譜對比；圖中I、II和III分別是指紋片段I、II和III。
具體實施例方式
本發明以馬兜鈴植物和三種木通為例，結合實施例作進一步說明。
在馬兜鈴屬和細辛屬植物中發現的馬兜鈴酸(AAs)(包括馬兜鈴酸I和II，即AA-I和AA-II)具有硝基菲羧酸的結構，在中草藥中具有利尿和止痛的作用。然而過量的攝入，由馬兜鈴屬植物所制的保健品、減肥藥和中草藥中AAs可以導致嚴重的腎損傷。近年來，由于食用含有AAs的廣防己所制的減肥藥引發了很多的中毒事件，因此引起世界各國的高度重視。美國食品和藥品管理局頒布了含有AAs的草藥制劑信息以防中毒事件的進一步發生。關木通、廣防己和青木香由于含有大量的AAs而從2005年版的《中華人民共和國藥典》中刪除，不再藥用。因此，定量分析藥草及其產品中AAs的含量是非常重要的。
實施例1馬兜鈴植物不同部位的定量檢測及指紋鑒別分析植物馬兜鈴的果實、徑葉和根都是草藥，它們分別叫做馬兜鈴、天仙藤和青木香。
(1)緩沖溶液的配制，其具體方法是pH值為9.5、10.0、10.5和11.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)用1.0mol L-1NaOH調節，pH值為7.0、8.0和9.0的緩沖溶液的配制是直接混合Na2HPO4和NaH2PO4的水溶液即可。
(2)AAs標準品溶液的制備及其循環伏安實驗，過程如下AAs標準品溶液的制備含有7.6×10-4mol L-1AA-I和2.0×10-3mol L-1AA-II的混合溶液用甲醇配制，并儲備于4℃的冰箱中，使用前用二次水稀釋到所需濃度。
AAs標準品溶液的循環伏安實驗首先將33μm CFE在PBS溶液中循環掃描一周作為背景。然后將此電極在含有5×10-5mol L-1AA-I及5.0×10-5molL-1AA-I和1.3×10-4mol L-1AA-II混合物的PBS溶液中分別循環掃描一周，考察AA-I和AA-II的循環伏安行為。
(3)檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察；
檢測條件的優化具體過程是在1.0-1.3V間變化檢測電位、5-50mmol L-1間變化緩沖溶液濃度、7-11間變化緩沖溶液pH值、5-40s間變化進樣時間和5-22.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響。
在最佳的分離和檢測條件下檢測電位為1.20V；緩沖溶液為2.0×10-2molL-1PBS(pH＝10.0)；17cm高度進樣25s；分離電壓為12.5kV，在5min內AA-I和AA-II達到基線分離并具有高的靈敏度。
在上面所描述的最佳條件下，實驗了一系列標準混合溶液，濃度范圍從4.0×10-8到1.9×10-5mol L-1的AA-I和1.0×10-7到7.0×10-5mol L-1的AA-II。得到了跨越兩個數量級的線性范圍，相關系數超過0.999。采用此CE-ED方法實際檢測到的AA-I和AA-II的檢測限分別為4.0×10-8mol L-1和1.0×10-7molL-1(信噪比為3)。
在最佳條件下，連續進標準混合樣品9.5×10-6mol L-1AA-I和2.5×10-5molL-1AA-II，考察此方法的日內重現性。連續7次進樣，AA-I和AA-II的峰電流和遷移時間的RSD(n＝7)值分別為2.7，0.5％和2.2，0.4％。我們也考察了此法的日間重現性，AA-I和AA-II的峰電流和遷移時間的RSD(n＝6)值分別為4.9，0.7％和2.9，0.7％。
(4)中草藥樣品溶液的制備，具體過程是用帶有40目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.5g草藥樣品用甲醇浸泡16h，然后水浴超聲30min，之后3000rpm離心8min，此萃取過程再重復兩次(1.0mL×2)，最后，萃取液定容于7mL甲醇中。實驗前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度直接進樣分析。
(5)中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得；中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得是在(3)中所獲得的最佳條件下進行電泳分離檢測得到的(如圖1所示)，可分別從2個不同的指紋片段對所獲得的譜圖進行視覺分析、直接辯識。
(6)對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分AAs的峰高確定實際樣品中活性成分AAs的含量。在馬兜鈴植物不同部位(即根、徑葉和果實)中AAs的含量均列于表1中。
表1 馬兜鈴植物不同部位中活性成分AAs含量測定結果

NF表示未檢測到。
由表1可見，在馬兜鈴植物的不同部位中AAs的含量是明顯不同的。根中AAs的含量是最多的，其次是果實，然而在徑葉中卻未檢測到AAs。
為了保證分離和檢測結果的重現性，分離毛細管和電極的處理是十分重要的(1)毛細管處理的具體過程是毛細管在第一次使用前，通0.1mol L-1NaOH水溶液過夜。在實驗過程中，為了保證分析結果的重現性，每次進樣間，用2min二次水、4-6min緩沖溶液沖洗毛細管。
(2)電極的處理過程是當分析標準品溶液時，在每天實驗前將碳纖維微盤電極超聲1min后可以使用至少1周。而分析實際樣品時，由于實際樣品中的成分較復雜，對電極的狀態影響較大，因此，除了每天實驗前將電極超聲1min外，還要將電極在緩沖溶液中循環掃描20周(-0.2V-1.2V)進行活化。
實施例2三種木通的定量檢測及指紋鑒別分析三種草藥關木通、川木通和木通經常被人們混淆，因為它們的外貌相似，且在漢語中都被稱做“木通”。然而，它們屬于不同種類的植物。在實際應用中，人們常誤用腎毒性和致癌性的關木通代替無毒的川木通和木通。關木通中具有腎毒性和致癌性的主要活性成分是AAs，因此，AAs的定量檢測及指紋鑒別這三種木通對于安全使用這些藥草制備中藥是十分有益的。
(1)緩沖溶液的配制，其具體方法是pH值為9.5、10.0、10.5和11.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)用1.0mol L-1NaOH調節，pH值為7.0、8.0和9.0的緩沖溶液的配制是直接混合Na2HPO4和NaH2PO4的水溶液即可。
(2)AAs標準品溶液的制備及其循環伏安實驗，過程如下AAs標準品溶液的制備含有7.6×10-4mol L-1AA-I和2.0×10-3mol L-1AA-II的混合溶液用甲醇配制，并儲備于4℃的冰箱中，使用前用二次水稀釋到所需濃度。
AAs標準品溶液的循環伏安實驗首先將33μm CFE在PBS溶液中循環掃描一周作為背景。然后將此電極在含有5×10-5mol L-1AA-I及5.0×10-5molL-1AA-I和1.3×10-4mol L-1AA-II混合物的PBS溶液中分別循環掃描一周，考察AA-I和AA-II的循環伏安行為。
(3)檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察；檢測條件的優化具體過程是在1.0-1.3V間變化檢測電位、5-50mmol L-1間變化緩沖溶液濃度、7-11間變化緩沖溶液pH值、5-40s間變化進樣時間和5-22.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響。
在最佳的分離和檢測條件下檢測電位為1.20V；緩沖溶液為2.0×10-2molL-1PBS(pH＝10.0)；17cm高度進樣25s；分離電壓為12.5kV，在5min內AA-I和AA-II達到基線分離并具有高的靈敏度。
在上面所描述的最佳條件下，實驗了一系列標準混合溶液，濃度范圍從4.0×10-8到1.9×10-5mol L-1的AA-I和1.0×10-7到7.0×10-5mol L-1的AA-II。得到了跨越兩個數量級的線性范圍，相關系數超過0.999。采用此CE-ED方法實際檢測到的AA-I和AA-II的檢測限分別為4.0×10-8mol L-1和1.0×10-7molL-1(信噪比為3)。
在最佳條件下，連續進標準混合樣品9.5×10-6mol L-1AA-I和2.5×10-5molL-1AA-II，考察此方法的日內重現性。連續7次進樣，AA-I和AA-II的峰電流和遷移時間的RSD(n＝7)值分別為2.7，0.5％和2.2，0.4％。我們也考察了此法的日間重現性，AA-I和AA-II的峰電流和遷移時間的RSD(n＝6)值分別為4.9，0.7％和2.9，0.7％。
(4)中草藥樣品溶液的制備，具體過程是用帶有40目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.5g草藥樣品用甲醇浸泡16h，然后水浴超聲30min，之后3000rpm離心8min，此萃取過程再重復兩次(1.0mL×2)，最后，萃取液定容于7mL甲醇中。實驗前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度直接進樣分析。
(5)中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得；中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得是在(3)中所獲得的最佳條件下進行電泳分離檢測得到的(如圖2所示)，可分別從3個不同的指紋片段對所獲得的譜圖進行視覺分析、直接辯識。
(6)對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分AAs的峰高確定實際樣品中活性成分AAs的含量。在三種木通(即關木通、川木通和木通)中AAs的含量均列于表2中。
表2 三種木通中活性成分AAs含量測定結果

NF表示未檢測到。
由表2可見，在關木通中含有AA-I和AA-II，而在川木通和木通中未檢測到AAs。因此，誤用可以把腎毒性和致癌性的AAs引入體內并造成傷害。
為了保證分離和檢測結果的重現性，分離毛細管和電極的處理是十分重要的(1)毛細管處理的具體過程是毛細管在第一次使用前，通0.1molL-1NaOH水溶液過夜。在實驗過程中，為了保證分析結果的重現性，每次進樣間，用2min二次水、4-6min緩沖溶液沖洗毛細管。
(2)電極的處理過程是當分析標準品溶液時，在每天實驗前將CFE電極超聲1min后可以使用至少1周。而分析實際樣品時，由于實際樣品中的成分較復雜，對電極的狀態影響較大，因此，除了每天實驗前將CFE電極超聲1min外，還要將電極在緩沖溶液中循環掃描20周(-0.2V-1.2V)進行活化。
權利要求
1.一種中草藥的鑒別方法，其特征在于通過毛細管電泳電化學分析方法指紋鑒別中草藥，其步驟和條件如下1)、分離毛細管和電極的處理(1)毛細管處理毛細管在第一次使用前，通0.1mol L-1NaOH水溶液過夜，在操作過程中，為了保證分析結果的重現性，每次進樣間，用1-3min二次水、4-6min緩沖溶液沖洗毛細管；(2)電極的處理當分析標準品溶液時，操作前將碳纖維微盤電極(CFE)超聲0.5-1.5min；每次操作前將電極超聲外，還要將電極在緩沖溶液中循環掃描10-30周(-0.2V-1.2V)進行活化；2)、緩沖溶液的配制pH≥9.5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)用1.0mol L-1NaOH調pH值，pH值＜9.5的PBS緩沖溶液的配制是直接混合Na2HPO4和NaH2PO4的水溶液即可；3)、中草藥中活性成分標準品溶液的制備及其循環伏安實驗活性成分標準品溶液的制備將活性成分標準品用甲醇溶解配制成3-8mol L-1的溶液；活性成分標準品溶液的循環伏安實驗將33μm CFE在含有標準品的PBS溶液中循環掃描，考察其循環伏安行為；4)、檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察檢測條件的優化在1.0-1.3V間變化檢測電位、5-50mmol L-1間變化緩沖溶液濃度、7-11間變化緩沖溶液pH值、5-40s間變化進樣時間和5-22.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響；5)、中草藥樣品溶液的制備用帶有20-80目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.3-0.8g的草藥樣品用甲醇浸泡10-18h，然后水浴超聲30-60min，之后2000-3500rpm離心5-10min，此萃取過程再重復1-3次，最后，萃取液定容于5-10mL的甲醇中；進樣前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度進行分析；6)、中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得中草藥CE-ED指紋圖譜的獲得是在步驟4)中所獲得的最佳條件下進行電泳分析得到的；7)、對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分的峰高確定實際樣品中活性成分的含量；8)、對比所獲得的CE-ED指紋圖譜，分別從幾個不同的指紋片段鑒別同種植物的不同部位以及不同種植物，從而鑒別中草藥及其混淆品。
全文摘要
本發明涉及一種中草藥的鑒別方法，其特征在于通過毛細管電泳電化學分析方法指紋鑒別中草藥。步驟為配制緩沖溶液；進行中草藥中活性成分標準品溶液的配制及其循環伏安實驗；對檢測條件進行優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍考察；中草藥樣品溶液的制備；中草藥CE－ED指紋圖譜的獲得；通過對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分的峰高確定實際樣品中活性成分的含量；通過對比活性成分的含量及所獲得的CE－ED指紋圖譜，鑒別中草藥。本發明能夠建立中草藥的標準CE－ED指紋圖譜，同時進行活性成分的定量檢測，具有高的分離效率、低的檢測限、成本低、重現性好等優點，是控制及評價中草藥質量的先進方法。
文檔編號G01N27/447GK1895289SQ20061001692
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月7日 優先權日2006年6月7日
發明者由天艷, 周曉光 申請人:中國科學院長春應用化學研究所