專利名稱：一種刺五加的檢測方法
技術領域：
本發明屬于中藥刺五加的檢測方法，具體涉及一種刺五加的毛細管電泳電化學檢測方法。
背景技術：
刺五加是一種廣泛種植在河北、吉林、遼寧和華北地區的草藥。但是只有產于黑龍江省的刺五加被認為是道地藥材。在中國藥典中，中草藥刺五加是五加科植物刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr.Et Maxim.)Harms)的干燥根及根莖或莖。此外，植物刺五加的葉也可藥用。刺五加的藥物活性與人參相似，具有強身健體的作用。因此，關于刺五加的研究引起了研究者的廣泛興趣。異秦皮啶、綠原酸和蘆丁是刺五加中的重要生物活性成分。其中，異秦皮啶的含量是制定刺五加類藥物標準的重要指標。很多方法已被使用分析刺五加的成分，而且刺五加葉的質量檢測已有專利文獻報道(專利號01104005)。但是，不同產地的刺五加莖和刺五加的不同部位的鑒別，以及這些活性成分在不同部位中的分布迄今為止還沒有分析以及專利報道。
目前，用于中草藥指紋分析的方法主要是高效液相色譜紫外檢測法。毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE)法用于中草藥的分析與其相比具有許多優勢①毛細管柱易清洗；②樣品前處理簡單③分析時間短；④由于柱效高，有可能使同一分離條件適合多種樣品中多組分的分析；⑤超小的樣品體積和低的溶劑消耗；⑥分離模式多，適合于中草藥中各類化學成分的分析。紫外檢測法具有好的通用性，但短的毛細管光路使得其靈敏度較低。相比之下，電化學檢測法(electrochemical detection，ED)提供了高的靈敏度，且裝置簡單。因此，采用高效的CE和靈敏的ED指紋分析中草藥可以更好地保證其真實、質量、安全和藥效。

發明內容
本發明提供一種刺五加的檢測方法，是一種儀器廉價、操作簡單及快速和靈敏的毛細管電泳電化學分析方法，是將指紋圖譜分析與活性成分含量測定相結合從而控制及評價草藥刺五加質量的方法。
本發明的方法分以下幾個步驟(1)緩沖溶液的配制直接混合NaH2PO4和Na2B4O7的水溶液，并用0.20mol L-1HCl或0.20molL-1NaOH調節其pH值為5.0-9.0。
(2)草藥刺五加中活性成分標準品溶液的制備及其循環伏安實驗草藥刺五加的主要活性成分是異秦皮啶、綠原酸和蘆丁，它們分別用甲醇溶解成濃度為3-8mol L-1的溶液。
活性成分標準品溶液的循環伏安實驗過程是將33μm碳纖維微盤電極(CFE)在分別含有異秦皮啶、綠原酸和蘆丁的NaH2PO4和Na2B4O7混合溶液中循環掃描，考察其循環伏安行為。
(3)檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察在0.45-1.35V間變化檢測電位、5.0×10-3-8.5×10-3mol L-1和5.0×10-3-9.0×10-3mol L-1間變化NaH2PO4和Na2B4O7的濃度、5.0-9.0間變化緩沖溶液pH值、8-35s間變化進樣時間和5-17.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響。
(4)草藥樣品溶液的制備用帶有20-80目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.3-0.8g的草藥樣品，用甲醇水浴超聲15-30min，之后傾出上清夜，此萃取過程再重復1-3次。最后，萃取液減壓蒸餾近干，用甲醇溶解殘渣并定容于3-8mL的甲醇中。操作前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度直接進樣分析。
(5)刺五加CE-ED指紋圖譜的獲得刺五加CE-ED指紋圖譜的獲得是在步驟(3)中所獲得的最佳條件下進行電泳分析得到的。
(6)對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分的峰高確定實際樣品中活性成分的含量；(7)對比所獲得的CE-ED指紋圖譜，分別從幾個不同的指紋片段鑒別草藥刺五加的不同部位以及不同產地的刺五加莖。
本發明所闡述的草藥刺五加質量控制與指紋鑒別方法的優點是
CE-ED法儀器簡單只需一根廉價的毛細管、一個微盤工作電極、直流高壓儀器(±30kV)、電化學分析儀；消耗試劑和溶液少采樣體積通常只有幾納升，對環境影響很小；高效和快速通常CE完成一個檢測過程只要幾分鐘到十幾分鐘，并且可以得到高達幾十萬/米的理論塔板數；由于其只對電活性組分有響應，所以其選擇性好，且檢測限低，通常可達到10-8mol L-1，線性范圍達2-3個數量級。


圖1是不同產地刺五加莖(即a帽兒山；b五大連池；c五常；d牡丹江)的CE-ED指紋圖譜對比；圖中I、II、III、II’和III’分別是指紋片段I、II、III、II’和III’；峰1為異秦皮啶，峰3為綠原酸。
圖2是草藥刺五加不同部位(即a根；b葉；c根莖；d莖)的CE-ED指紋圖譜對比；圖中I、II、III和III’分別是指紋片段I、II、III和III’；峰1為異秦皮啶，峰2為蘆丁，峰3為綠原酸。
具體實施例方式
下面，結合實施例對本發明作進一步說明。
實施例1不同產地刺五加莖的定量檢測及指紋鑒別分析(1)緩沖溶液的配制，其具體方法是直接混合NaH2PO4和Na2B4O7的水溶液，pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的溶液用0.20mol L-1HCl或0.20mol L-1NaOH調節。
(2)活性成分標準品溶液的制備及其循環伏安實驗，過程如下標準品溶液的制備濃度均為5.0×10-3mol L-1異秦皮啶、蘆丁和綠原酸的溶液分別用甲醇溶解，并儲備于4℃的冰箱中，使用前用二次水稀釋到所需濃度。
標準品溶液的循環伏安實驗首先將33μm CFE電極在NaH2PO4和Na2B4O7混合溶液中循環掃描一周作為背景。然后將此電極分別在含有1.0×10-4mol L-1異秦皮啶、1.0×10-4molL-1蘆丁和1.0×10-4mol L-1綠原酸的NaH2PO4和Na2B4O7混合溶液中循環掃描一周，考察它們的循環伏安行為。
(3)檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察；檢測條件優化的具體過程是
在0.45-1.35V間變化檢測電位、5.0×10-3-8.5×10-3mol L-1和5.0×10-3-9.0×10-3mol L-1間變化NaH2PO4和Na2B4O7的濃度、5.0-9.0間變化緩沖溶液pH值、8-35s間變化進樣時間和5-17.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響。
在最佳的分離和檢測條件下檢測電位為1.20V；緩沖溶液為7.0×10-3molL-1NaH2PO4+7.5×10-3mol L-1Na2B4O7(pH＝7.0)；17cm高度進樣25s；分離電壓為15kV，在6min內分析物異秦皮啶、蘆丁和綠原酸達到基線分離并具有高的靈敏度。
在上面所描述的最佳條件下，實驗了一系列標準混合溶液，濃度范圍從1.0×10-7到1.0×10-4mol L-1的異秦皮啶、2.0×10-7到1.0×10-4mol L-1的蘆丁和1.5×10-6到5.0×10-5mol L-1的綠原酸。得到了跨越1-3個數量級的線性范圍，相關系數超過0.99。采用此CE-ED方法實際檢測到的異秦皮啶、蘆丁和綠原酸的檢測限分別為1.0×10-7mol L-1、2.0×10-7mol L-1和1.5×10-6mol L-1(信噪比為3)。
在最佳條件下，連續進標準混合樣品1.0×10-5mol L-1異秦皮啶、2.0×10-5mol L-1蘆丁和2.0×10-5mol L-1綠原酸，考察此方法的日內重現性。連續6次進樣，它們的峰電流和遷移時間的RSDs(n＝6)值分別為1.5，0.63％、2.4，0.69％和1.2，0.70％。
(4)草藥樣品溶液的制備，具體過程是用帶有40目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.5g的草藥樣品，用甲醇水浴超聲20min，之后傾出上清夜，此萃取過程再重復2次。最后，萃取液減壓蒸餾近干，用甲醇溶解殘渣并定容于5mL的甲醇中。實驗前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度直接進樣分析。
(5)刺五加莖CE-ED指紋圖譜的獲得；刺五加莖CE-ED指紋圖譜的獲得是在(3)中所獲得的最佳條件下進行電泳分析得到的(如圖1所示)，可分別從幾個不同的指紋片段對所獲得不同產地刺五加莖的譜圖進行視覺分析、直接辯識。
(6)對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分的峰高確定實際樣品中活性成分的含量。不同產地的刺五加莖中活性成分異秦皮啶、蘆丁和綠原酸的含量均列于表1中。
表1 不同產地的刺五加莖中活性成分的含量測定結果

NF表示未檢測到。
由表1可見，在所有產地的刺五加莖中均未檢測到蘆丁，且異秦皮啶和綠原酸的含量對于不同產地的刺五加莖來說也是不同的。來自五常的刺五加莖中異秦皮啶的含量與牡丹江的差不多，而且是最高的。相反，來自五大連池的刺五加莖中異秦皮啶的含量是最低的，只有五常的十分之一，而帽兒山刺五加莖中異秦皮啶的含量是五常的十分之三。牡丹江的刺五加莖中綠原酸的含量是最高的，五大連池的刺五加莖中綠原酸的含量是最低的。
實施例2草藥刺五加不同部位的定量檢測及指紋鑒別分析(1)緩沖溶液的配制，其具體方法是直接混合NaH2PO4和Na2B4O7的水溶液，pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的溶液用0.20mol L-1HCl或0.20mol L-1NaOH調節。
(2)標準品溶液的制備及其循環伏安實驗，過程如下標準品溶液的制備濃度均為5.0×10-3mol L-1異秦皮啶、蘆丁和綠原酸的溶液分別用甲醇溶解，并儲備于4℃的冰箱中，使用前用二次水稀釋到所需濃度。
標準品溶液的循環伏安實驗首先將33μm CFE電極在NaH2PO4和Na2B4O7混合溶液中循環掃描一周作為背景。然后將此電極在分別含有1.0×10-4mol L-1異秦皮啶、1.0×10-4mol L-1蘆丁和1.0×10-4mol L-1綠原酸的NaH2PO4和Na2B4O7混合溶液中循環掃描一周，考察它們的循環伏安行為。
(3)檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察；
檢測條件優化的具體過程是在0.45-1.35V間變化檢測電位、5.0×10-3-8.5×10-3mol L-1和5.0×10-3-9.0×10-3mol L-1間變化NaH2PO4和Na2B4O7的濃度、5.0-9.0間變化緩沖溶液pH值、8-35s間變化進樣時間和5-17.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響。
在最佳的分離和檢測條件下檢測電位為1.20V；緩沖溶液為7.0×10-3molL-1NaH2PO4+7.5×10-3mol L-1Na2B4O7(pH＝7.0)；17cm高度進樣25s；分離電壓為15kV，在6min內分析物異秦皮啶、蘆丁和綠原酸達到基線分離并具有高的靈敏度。
在上面所描述的最佳條件下，實驗了一系列標準混合溶液，濃度范圍從1.0×10-7到1.0×10-4mol L-1的異秦皮啶、2.0×10-7到1.0×10-4mol L-1的蘆丁和1.5×10-6到5.0×10-5mol L-1的綠原酸。得到了跨越1-3個數量級的線性范圍，相關系數超過0.99。采用此CE-ED方法實際檢測到的異秦皮啶、蘆丁和綠原酸的檢測限分別為1.0×10-7mol L-1、2.0×10-7mol L-1和1.5×10-6mol L-1(信噪比為3)。
在最佳條件下，連續進標準混合樣品1.0×10-5mol L-1異秦皮啶、2.0×10-5mol L-1蘆丁和2.0×10-5mol L-1綠原酸，考察此方法的日內重現性。連續6次進樣，它們的峰電流和遷移時間的RSDs(n＝6)值分別為1.5，0.63％、2.4，0.69％和1.2，0.70％。
(4)草藥樣品溶液的制備，具體過程是用帶有40目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.5g的草藥樣品，用甲醇水浴超聲20min，之后傾出上清夜，此萃取過程再重復2次。最后，萃取液減壓蒸餾近干，用甲醇溶解殘渣并定容于5mL的甲醇中。實驗前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度直接進樣分析。
(5)刺五加不同部位CE-ED指紋圖譜的獲得；刺五加不同部位CE-ED指紋圖譜的獲得是在(3)中所獲得的最佳條件下進行電泳分析得到的(如圖2所示)，可分別從幾個不同的指紋片段對所獲得刺五加不同部位的譜圖進行視覺分析、直接辯識。
(6)對比標準混合溶液和實際樣品中活性成分的峰高確定實際樣品中活性成分的含量，草藥刺五加的不同部位中活性成分異秦皮啶、蘆丁和綠原酸的含量均列于表2中。
表2 草藥刺五加不同部位中活性成分含量的測定結果

NF表示未檢測到。
由表2可見，對于草藥刺五加的不同部位，分析物的含量也是明顯不同的。只有在刺五加的葉中檢測到了蘆丁，莖中異秦皮啶的含量與根莖中是可比的，且是葉中的十倍。而葉中異秦皮啶的含量與根中是相似的。根中綠原酸的含量是最高的，葉中是最低的。
權利要求
1.一種刺五加的檢測方法，其特征在于將毛細管電泳電化學法用于指紋鑒別不同產地的刺五加以及刺五加的不同部位，其步驟和條件如下(1)緩沖溶液的配制直接混合NaH2PO4和Na2B4O7的水溶液，并用0.20mol L-1HCl或0.20molL-1NaOH調節其pH值為5.0-9.0；(2)草藥刺五加中活性成分標準品溶液的制備及其循環伏安實驗草藥刺五加的主要活性成分是異秦皮啶、綠原酸和蘆丁，它們分別用甲醇溶解成濃度為3-8mol L-1的溶液；活性成分標準品溶液的循環伏安實驗過程是將33μm碳纖維微盤電極(CFE)在分別含有異秦皮啶、綠原酸和蘆丁的NaH2PO4和Na2B4O7混合溶液中循環掃描，考察其循環伏安行為；(3)檢測條件的優化，并在此優化條件下進行重現性、檢測限和線性范圍的考察在0.45-1.35V間變化檢測電位、5.0×10-3-8.5×10-3mol L-1和5.0×10-3-9.0×10-3mol L-1間變化NaH2PO4和Na2B4O7的濃度、5.0-9.0間變化緩沖溶液pH值、8-35s間變化進樣時間和5-17.5kV間變化分離電壓考察對峰電流、遷移時間、分離度和分離效率的影響；(4)草藥樣品溶液的制備用帶有20-80目篩子的植物粉碎機粉碎草藥樣品，稱取0.3-0.8g的草藥樣品，用甲醇水浴超聲15-30min，之后傾出上清夜，此萃取過程再重復1-3次；最后，萃取液減壓蒸餾近干，用甲醇溶解殘渣并定容于3-8mL的甲醇中，操作前，所有的樣品溶液均用0.22μm的纖維素酯膜過濾并稀釋到所需要的濃度直接進樣分析；(5)刺五加CE-ED指紋圖譜的獲得刺五加CE-ED指紋圖譜的獲得是在步驟(3)中所獲得的最佳條件下進行電泳分析得到的；(6)對比刺五加標準混合溶液和刺五加實際樣品中活性成分的峰高確定刺五加實際樣品中活性成分的含量；(7)對比所獲得的CE-ED指紋圖譜，分別從幾個不同的指紋片段鑒別草藥刺五加的不同部位以及不同產地的刺五加莖。
全文摘要
本發明提供了一種刺五加的檢測方法，是通過高效、快速和靈敏的毛細管電泳電化學檢測手段進行鑒別分析的方法。此方法結合了簡單的甲醇超聲萃取和毛細管電泳電化學檢測分析方法，通過對比活性成分的含量及所獲得的毛細管電泳電化學指紋圖譜，基于峰數、峰高及峰高比值鑒別了草藥刺五加的不同部位以及不同產地的刺五加。本法實現了對中草藥刺五加內在質量的綜合評價和整體性質的全面控制。
文檔編號G01N27/447GK1895312SQ20061001692
公開日2007年1月17日 申請日期2006年6月7日 優先權日2006年6月7日
發明者由天艷, 周曉光 申請人:中國科學院長春應用化學研究所