用于透射電子顯微鏡的樣品制備
【專利說明】用于透射電子顯微鏡的樣品制備 技術領域
[0001] 本發明涉及一種用于制備含有均勻分布的納米顆粒的樣品的方法。這樣的均勻分 布的樣品適用于使用透射電子顯微鏡（TEM)的基于成像的觀察和定量表征。本發明有助于 在液體樣品中的納米顆粒的形貌、尺寸和分布的實時研究，且不會由于樣品盒的幾何約束 引起納米顆粒的團聚。 【背景技術】
[0002] 納米顆粒或基于納米顆粒的配方具有為了增強的治療或診斷目的而向靶組織有 效遞送的優點，這通常與它們的大小、形狀、表面性質、和聚集/團聚狀態相關。關于納米 顆粒在水性或生理環境中的尺寸分布、聚集/團聚狀態、以及形狀的納米顆粒的綜合物理 化學性能對于它們在生物醫學應用和遵從安全規定中的用途而言是重要的，又是有挑戰性 的。納米顆粒在生物體液中的聚集/團聚在確定對于生物識別而言至關重要的物理尺寸、 形狀和表面性質中起到了關鍵作用，但這樣的聚集/團聚的基于圖像的觀測在固相中是難 以實現的。透射電子顯微鏡（TEM)是用于觀測納米顆粒的獨特且有力的工具。然而，由于 納米顆粒在常規的TEM樣品中的不均勻的空間分布，所述樣品是通過將納米顆粒的溶液在 銅網上干燥，或者通過在低溫臺樣品夾（cryostageholder)上冷凍而制備的，因此TEM很 少用于評價納米顆粒在水性溶液中的空間分布。
【發明內容】

[0003] 本發明涉及一種微片納米吸量管的制造，所述微片納米吸量管具有受控的腔室寬 度以用于分選來自如血液樣品或乳狀液體的液體樣品的納米顆粒，并防止干燥過程中所述 顆粒的聚集，這使得可以定量分析它們在水溶液中的聚集/團聚狀態和顆粒濃度。這種微 片適用于和兼容所有類型的商業TEM夾具。這樣的納米吸量管證明是用于基于TEM圖像的 定量表征的簡單方便的取樣裝置。
[0004] 在一個方面，本發明涉及一種用于制備用于TEM納米顆粒表征的樣品的方法，其 包括：
[0005] (a)提供樣品盒，所述樣品盒包括：
[0006] (i)頂基板和底基板，所述基板各自具有頂表面和底表面，以及長度Ll，寬度Wl和 厚度T1，所述頂基板和底基板是透明的且基本上彼此平行；
[0007] (ii)第一間隔物和第二間隔物，其各自具有長度L2,寬度W2和厚度h，位于所述頂 基板下方和坐落在所述底基板上，所述第二間隔物被設置成與所述第一間隔物相對，并以 間距d與所述第一間隔物間隔開；其中，所述間隔物的寬度W2小于所述頂基板的寬度Wl; 和
[0008] (iii)非封閉的腔室，其具有兩個向大氣開放的端部，并在所述頂基板和底基板之 間和在所述第一和第二間隔物之間形成，所述腔室的特征在于，具有長度L1，寬度d，以及 由所述間隔物的厚度所限定的高度h，其中該高度h比紅血細胞的直徑更小；（請提供圖像 或示意圖的參考）
[0009] (b)向所述腔室中裝載含納米顆粒的液體樣品；以及
[0010] (C)在所述腔室中干燥所述液體樣品，以得到含有納米顆粒的干燥樣品，所述納米 顆粒附著在頂基板的底表面和底基板的頂表面上。
[0011] 在另一個方面，本發明涉及上述的樣品盒。
[0012] 在另一個方面，本發明涉及一種用于分析在液體樣品中的納米顆粒的TEM圖像的 方法，包括：（請標出參考的附圖以解釋下文）
[0013] (a)根據上述的方法制備用于TEM納米顆粒表征的干燥樣品；
[0014] (b)將所述干燥樣品放置在TEM下；以及
[0015] (c)觀察并分析在所述干燥樣品中的納米顆粒的TEM圖像，以得到在液體樣品中 的納米顆粒的聚集、團聚和/或濃度的信息。
[0016] 此外，在另一個方面，本發明涉及一種用于分析在組合物中的顆粒的TEM圖像的 系統，包括：（請標出參考的附圖以解釋下文）
[0017] (a)如上所述的樣品盒；以及
[0018] (b)包含算法以進行以下功能的計算機軟件：
[0019] ⑴獲得納米顆粒的TEM圖像并將該圖像存儲在計算機中；
[0020] (ii)預處理該TEM圖像以增強對比度，降低噪音和背景；
[0021] (iii)將圖像中的納米顆粒從背景中分割出；
[0022] (iv)構建具有用戶界面的訓練數據庫；以及
[0023] (V)基于在所述訓練數據庫中的信息將單個顆粒分類。
[0024] 在另一方面，本發明涉及一種干燥的含納米顆粒的樣品，其包含在上述樣品盒的 非封閉的腔室中均勻分布的干燥形式的納米顆粒，其中，所述納米顆粒是作為在液體樣品 中分散的非干燥的顆粒形式裝載到所述腔室中的，且所述在腔室中均勻分布的干燥形式的 納米顆粒附著在所述底基板的頂表面和所述頂基板的底表面，且其中，在所述非封閉的腔 室中的納米顆粒的均勻分布反映了在所述液體樣品中分散的非干燥的納米顆粒的狀態，而 且其中，所述干燥樣品不包含細胞。所述底基板的頂表面和所述頂基板的底表面形成了所 述腔室內表面的部分（頂內表面和底內表面）。
[0025] 上述這些以及其他的方面將從以下的優選實施方式的描述并結合附圖而變得更 明顯，雖然在不脫離本公開新穎概念的實質和范圍內，可能會有其變化和修改帶來的影響。
[0026] 【附圖說明】了本發明的一個或多個實施方式，并且與書面描述一起用于解釋本發明 的原理。只要可能，在整個附圖中使用相同的附圖標記來表示實施方式中相同或類似的元 件。 【附圖說明】
[0027] 圖IA-E是顯示出用于制備顯微樣品的常規方法的示意性的側視圖（圖1A-D)和 頂視圖（圖1E)。
[0028] 圖2A-E是顯示出用于制備另一種顯微樣品的常規方法的示意性的側視圖（圖 2A-D)和頂視圖（圖2E)。
[0029] 圖3A-E是顯示出制備根據本發明的干燥的顯微樣品的示意性的側視圖（圖3A-D) 和頂視圖（圖3E)。
[0030]圖4A-4E是顯示出制備根據本發明的顯微樣品的示意性的側視圖（圖4A-D)和頂 視圖（圖4E)。
[0031] 圖5是根據本發明的一個實施方式的樣品盒（或微片納米吸量管）的示意性透視 圖。
[0032] 圖6是樣品盒（微片納米吸量管）的示意性橫截面圖。
[0033] 圖7A-7B是根據本發明的一個實施方式的樣品盒沿著線702的示意性頂視圖（圖 7A)和橫截面圖（圖7B)。
[0034] 圖8A-8B是根據本發明的另一個實施方式的樣品盒沿著線702的示意性頂視圖 (圖8A)和橫截面圖（圖8B)。
[0035] 圖9A-9B是根據本發明的另一個實施方式的樣品盒沿著線702的示意性頂視圖 (圖9A)和橫截面圖（圖9B)。
[0036] 圖10顯示出窗口型的TEM微片納米吸量管的幾何結構和用于樣品制備的制樣過 程：(A)裝置的示意圖，所述裝置具有如所指出的尺寸和材料；(B)納米吸量管作為用于簡 單方便地分選納米顆粒的過濾器，以防止血液中的更大的物質的進入；(C)用于控制干燥 過程的具有恰當限定的腔室寬度的腔室的放大示意圖。
[0037] 圖11顯示出cPEG5k_GNP在銅網和納米吸量管上的干燥過程和分布：(A)在銅網 上（具有碳和SiOx膜）和在納米吸量管（具有SixNy膜）中干燥的cPEG5k-GNP在5%葡 萄糖溶液中的TEM圖像；(B)在四個單獨圖像區域（2. Oii mX2. 7 iim)中的