一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法
【專利摘要】本發明涉及一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，包括如下步驟：將固態的叔丁醇加熱到第一預設溫度使其熔化為液態，將待觀察的植物樣品加入到液態叔丁醇中后，在第二預設溫度下放置預設時間；然后將上述叔丁醇在第三預設溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至預設壓力值，即可得到掃描電鏡用植物樣品。根據本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，在傳統叔丁醇冷凍干燥的基礎上，減少了固定、脫水、置換等步驟，減少了中間液對樣品成分的溶解等破壞作用，避免了機械損傷，使得制樣過程更加簡便快捷。
【專利說明】
一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法
技術領域
[0001]本發明涉及掃描電鏡樣品處理領域，具體涉及一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，隨著科學技術的不斷發展，掃描電子顯微鏡(Scanning ElectronMicroscope，SEM)的功能日臻完善，其在各個專業領域的應用越來越廣。目前，SEM已成為一種研究微觀世界的有力工具，很多重大發現和研究成果都是通過SEM觀察獲得的。雖然近年來出現了環境掃描電鏡(Environment Scanning Electron Microscope，ESEM)和冷凍掃描電鏡(Cryo-Scanning Electron Microscope,Cryo-SEM)，可以觀察新鮮的含水樣品，但二者的不足之處均是分辨率較低，因此目前使用最多的還是觀察不含水樣品的SEM。
[0003]就植物樣品而言，只有極少數如干種子等含水量極低的樣品可以直接噴金用于掃描電鏡觀察。如果含水量高的樣品直接放入樣品室，水分蒸發后樣品會收縮變形，破壞表面的微細結構。水蒸氣會引起電子束流大幅度波動，使圖像模糊，出現霧狀，造成物鏡、鏡頭、光闌等的污染。此外，燈絲碰到水蒸氣會氧化變質乃至熔斷。所以絕大多數植物樣品需要進行干燥處理。干燥是生物樣品制備中的關鍵環節，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度。大多數植物，特別是柔軟的細胞和組織，如花器官、嫩芽、幼胚、幼根等，在干燥時由于體積應力和表面張力的作用，容易發生明顯的皺縮、塌陷和變形，所以對干燥環節技術要求更高。
[0004]常用的方法有自然干燥法、冷凍干燥法、烘干干燥法、叔丁醇干燥法和CO2臨界點干燥法。
[0005]CO2臨界點干燥被認為是目前生物學掃描電鏡樣品制備中最可靠、最理想的干燥方法。每種物質在一個特定的溫度都可以進行相態轉化，這個溫度就是該物質的臨界點。CO2的氣液態臨界溫度為31.TC，在臨界點的壓力為臨界壓力。在臨界狀態下，液體和氣體的密度相等，界面完全消失，液體的表面張力系數為零。CO2臨界點干燥就是利用這一原理，在樣品經歷從液態到氣態的轉變過程中，避免其表面結構因張力而受到損傷。臨界點干燥雖然是一種非常好的干燥方法，但是操作時有諸多的細節要求嚴苛，細小環節的操作不當會導致樣品縮水，干燥失敗，而且臨界點干燥需要固定液、乙醇和乙酸異戊酯等中間液，而這些液體對植物樣品的有些成分如蠟質等有溶解作用，造成假象。另外，CO2臨界點干燥需要的操作步驟較多，有可能會對樣品造成機械損傷。
[0006]冷凍干燥也是一種常用的掃描電鏡樣品制備方法，用有機溶劑如叔丁醇置換樣品中的游離水，在冷凍和低真空條件下，有機溶劑由固相直接升華，存在于液-氣之間的表面張力小，幾乎等于零，可以減少樣品損傷，達到干燥樣品的目的。有機溶劑在冷凍時形成無定形結構的機會多，并且固相重結晶的機會少，可以減少冰晶對樣品的損傷。叔丁醇是一種傳統的冷凍干燥置換溶劑。傳統的叔丁醇冷凍干燥法需要樣品固定、脫水、置換，一般需要戊二醛-鋨酸雙固定或FAA固定(需乙醇、甲醛、醋酸)，此外，還需叔丁醇和乙醇等，步驟非常繁瑣。

【發明內容】

[0007]本發明的一個目的在于提出一種簡單易行，對材料影響小，冷凍效果好的叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法。
[0008]根據本發明實施例的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，包括如下步驟:SlOl:將固態的叔丁醇加熱到第一預設溫度使其熔化為液態，將待觀察的植物樣品加入到液態叔丁醇中后，在第二預設溫度下放置預設時間；S102:將經步驟SlOl處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在第三預設溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至預設壓力值，即可得到掃描電鏡用植物樣品。
[0009]根據本發明實施例的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，在傳統叔丁醇冷凍干燥的基礎上，減少了固定、脫水、置換等步驟，在冷凍干燥過程中，只需要叔丁醇一種溶液，叔丁醇是一種表面張力較小的有機溶劑，可以代替組織細胞中的游離水，使樣品在冷凍干燥時表面張力小而減少樣品的縮水變形，減少了中間液對樣品成分的溶解等破壞作用，避免了機械損傷。
[0010]另外，根據本發明上述實施例的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，還可以具有如下附加的技術特征:
[0011]進一步地，在步驟SlOl中，第一預設溫度為26°C?40°C。
[0012]進一步地，在步驟SlOl中，第一預設溫度為35°C。
[0013]進一步地，在步驟SlOl中，第二預設溫度為_15°C?_25°C。
[0014]進一步地，在步驟SlOl中，第二預設溫度為-200C。
[0015]進一步地，在步驟SlOl中，預設時間為8h?12h。
[0016]進一步地，在步驟S102中，采用冷凍干燥器對經步驟SlOl處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇進行冷凍干燥。
[0017]進一步地，在步驟S102中，第三預設溫度為_15°C?_25°C。
[0018]進一步地，在步驟S102中，第三預設溫度為-20 0C。
[0019]進一步地，在步驟S102中，預設壓力值為12Pa?14Pa。
[0020]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0021]圖1是本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法的流程圖；
[0022]圖2是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的擬南芥葉片的SEM圖；
[0023]圖3是采用CO2臨界點法干燥的擬南芥葉片的SEM圖；
[0024]圖4是采用常規叔丁醇冷凍干燥的擬南芥葉片的SEM圖；
[0025]圖5是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的矮牽牛花瓣的SEM圖；
[0026]圖6是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的蒲公英花瓣的SEM圖；
[0027]圖7是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的西紅柿葉片的SEM圖；
[0028]圖8是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的蒲公英花藥的SEM圖；
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖詳細描述本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法。
[0030]如圖1所示，根據本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，包括如下步驟:
[0031]SlOl:將固態的叔丁醇加熱到第一預設溫度使其熔化為液態，將待觀察的植物樣品加入到液態叔丁醇中后，在第二預設溫度下放置預設時間。叔丁醇的熔點為25.5°C，室溫低于25.5°C，所以叔丁醇在室溫下一般為固態。加熱溫度至約260C?40 V后，叔丁醇熔化為液態，然后將待觀察的植物樣品加入到液態叔丁醇中，在約-10°C?-30°C溫度下，冷凍大概8h?12h0
[0032]S102:將經步驟SlOl處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在第三預設溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至預設壓力值，即可得到掃描電鏡用植物樣品。具體地，將經步驟SlOl處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在約-10°c?-30°c溫度下，通過冷凍干燥器進行冷凍干燥操作并同時進行抽真空處理，待真空度降至約12Pa?14Pa后，即可得到掃描電鏡用植物樣品。
[0033]下面通過具體實施例詳細描述本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法。
[0034]實施例1
[0035]實施例1是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用擬南芥葉片的過程，包括如下步驟:
[0036](I)將固態的叔丁醇加熱到26°C使其熔化為液態，將擬南芥葉片加入到液態叔丁醇中后，在-10°C溫度下放置12h。
[0037](2)將經步驟(I)處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在-10°C溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至12Pa，即可得到掃描電鏡用植物樣品。
[0038]如圖2所示，與圖3和圖4比較，可以發現，根據本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的方法處理的擬南芥葉片樣品與采用CO2臨界點法干燥的擬南芥葉片和常規叔丁醇冷凍干燥的擬南芥葉片沒有很大差異，可以達到掃描電鏡用植物樣品的標準，而根據本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥的方法省去了固定、脫水、置換等步驟，操作更加簡單。
[0039]實施例2
[0040]實施例2是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用矮牽牛花瓣的過程，包括如下步驟:
[0041](I)將固態的叔丁醇加熱到40 °C使其熔化為液態，將待觀察的矮牽牛花瓣加入到液態叔丁醇中后，在-30 0C溫度下放置Sh。
[0042 ] (2)將經步驟(I)處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在-30 0C溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至14Pa，即可得到掃描電鏡用矮牽牛花瓣樣品，如圖5所示。
[0043]實施例3
[0044]實施例3是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用蒲公英花瓣的過程，包括如下步驟:
[0045](I)將固態的叔丁醇加熱到35°C使其熔化為液態，將待觀察的蒲公英花瓣加入到液態叔丁醇中后，在-20 0C溫度下放置I Oh。
[0046](2)將經步驟(I)處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在-20 0C溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至13Pa，即可得到掃描電鏡用蒲公英花瓣樣品，如圖6所示。
[0047]實施例4
[0048]實施例4是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用西紅柿葉片的過程，包括如下步驟:
[0049](I)將固態的叔丁醇加熱到30°C使其熔化為液態，將待觀察的西紅柿葉片加入到液態叔丁醇中后，在-15 °C溫度下放置I Ih。
[0050](2)將經步驟(I)處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在_15°C溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至14Pa，即可得到掃描電鏡用西紅柿葉片樣品，如圖7所示。
[0051 ] 實施例5
[0052]實施例5是采用本發明的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用蒲公英花藥的過程，包括如下步驟:
[0053](I)將固態的叔丁醇加熱到38°C使其熔化為液態，將待觀察的蒲公英花藥加入到液態叔丁醇中后，在-25 °C溫度下放置19h。
[0054](2)將經步驟(I)處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在_25°C溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至llPa，即可得到掃描電鏡用蒲公英花藥樣品，如圖8所示。
[0055]根據本發明實施例的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，在傳統叔丁醇冷凍干燥的基礎上，減少了固定、脫水、置換等步驟，在冷凍干燥過程中，只需要叔丁醇一種溶液，叔丁醇是一種表面張力較小的有機溶劑，可以代替組織細胞中的游離水，使樣品在冷凍干燥時表面張力小而減少樣品的縮水變形，減少了中間液對樣品成分的溶解等破壞作用，避免了機械損傷。
[0056]在本發明的描述中，術語“第一”、“第二”、“第三”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術特征的數量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發明的描述中，“多個”的含義是兩個以上，除非另有明確具體的限定。
[0057]在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。
[0058]盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【主權項】
1.一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，包括如下步驟: SlOl:將固態的叔丁醇加熱到第一預設溫度使其熔化為液態，將待觀察的植物樣品加入到液態叔丁醇中后，在第二預設溫度下放置預設時間； S102:將經步驟SlOl處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇在第三預設溫度下冷凍干燥并進行抽真空處理至預設壓力值，即可得到掃描電鏡用植物樣品。2.根據權利要求1所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟SlOl中，第一預設溫度為26°C?40°C。3.根據權利要求2所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟SlOl中，第一預設溫度為35°C。4.根據權利要求1所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟SlOl中，第二預設溫度為-15°C?_25°C。5.根據權利要求4所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟SlOl中，第二預設溫度為-20°C。6.根據權利要求1所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟SI OI中，預設時間為8h?12h。7.根據權利要求1所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟S102中，采用冷凍干燥器對經步驟SlOl處理后的加入待觀察的植物樣品的叔丁醇進行冷凍干燥。8.根據權利要求1所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟S102中，第三預設溫度為-15°C?_25°C。9.根據權利要求8所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟S102中，第三預設溫度為-20°C。10.根據權利要求1所述的一種叔丁醇一步法冷凍干燥掃描電鏡用植物樣品的方法，其特征在于，在步驟S102中，預設壓力值為12Pa?14Pa。
【文檔編號】G01N23/22GK106093092SQ201610399522
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】徐秀蘋
【申請人】中國科學院植物研究所