用于純化疫苗和病毒的色譜介質的制作方法
【專利說明】用于純化疫苗和病毒的色譜介質
[0001] 本申請要求2013年1月31日提交的美國臨時申請61/758,926號的優先權，其公 開內容通過引用結合到本文中來。
[0002] 領域 本文公開的實施方案設及適合純化疫苗和病毒并適合用于純化單克隆抗體進料流的 病毒清除應用的色譜介質。
[000引背景 用于制備疫苗的新純化技術的發展在作為對近來大流行病爆發的響應W及用于新興 治療應用兩方面而言具有重大意義。通常需要運樣的新技術來改進收率、增加產品純度和 加速生產率。目前采用的疫苗純化技術包括氯化飽密度梯度離屯、、切向流過濾及色譜法。運 些技術中的每一種提供獨特的優勢和劣勢，且疫苗生產商必須基于他們的生產規模、純度 及產品成本需要選擇特定的純化技術。典型的疫苗純化工藝描述在圖1中列出的工藝流程 圖中。
[0004] 切向流過濾和梯度離屯、方法兩者廣泛用于疫苗生產中，但運些單元操作是價格昂 貴且耗時的批量操作，可規模化差，需要專用設備及人員，并提供低收率和感染性損失。用 于運樣的操作的設備幾乎沒有一次性的，且必須進行昂貴的再生、清潔和驗證過程W準備 用于下一批的純化設備。
[0005] 相比之下，將基于珠粒的樹脂用于疫苗的結合/洗脫色譜純化令人感興趣，因為 運些純化方法可W大得多的規模進行。遺憾的是，用于運些應用的市售可得的樹脂通常提 供太小W致于較大病毒顆粒無法到達的孔徑。因此，運樣的介質展現出弱結合容量，因為病 毒僅可到達珠粒的外表面。低結合容量同與適合于該應用的色譜樹脂相關的高成本結合在 一起，要求生產商使用該色譜介質進行多次結合/洗脫和柱再生循環W使得運樣的過程成 本有效。再生過程由于產品通過量、緩沖劑和清潔劑的消耗量增加、驗證成本和資本設備需 要增加而進一步增加生產成本。目前，新興技術處于發展之中，其可提供增加的病毒結合容 量且運些包括使用商業樹脂體系的膜吸附器、整體料和流通吸附器純化方法。雖然膜吸附 器和整體料可W使得運些應用的結合容量增加稱為可能，但是運些技術通常具有它們自己 的規模局限性且運樣的純化介質的極高成本排除將運些產品用作一次性裝置并且可進一 步限制其在傳統上價格敏感的疫苗工業中被采用。
[0006] 概述 為了解決本領域目前已知的純化技術的許多局限性，已經開發了一種新型色譜介質， 其包含極低成本的熱塑性纖維和在所述纖維的表面上的配體官能團。所述配體能夠自細胞 培養物進料流選擇性地結合病毒，例如通過離子交換。所結合的病毒可隨后在例如通過使 用具有較高離子強度的洗脫緩沖劑改變溶液條件時從所述色譜介質釋放。基于纖維的固定 相是無孔的且展示提供回旋狀表面結構，其對于高病毒結合容量而言足夠的表面積。因為 病毒結合僅在纖維的表面上發生，所W不存在如在基于多孔珠粒的結合/洗脫體系的情況 下見到的關于病毒結合的尺寸排阻問題。此外，因為病毒顆粒可通過對流直接輸送到配體 位點，所W在體系和疫苗進料流方面沒有擴散限制，例如可在高得多的流速或短得多的駐 留時間下處理。
[0007] 根據某些實施方案，所述色譜介質來源于成型纖維。在某些實施方案中，所述成型 纖維提供纖化或隆起結構（例如，圖1(b))。當與普通纖維（例如，圖1(a))相比較時，運 些隆起可大大增加纖維的表面積。因此，在不減小纖維直徑的情況下獲得高表面積，所述 減小纖維直徑通常引起床滲透率顯著減小且流速相應降低。根據某些實施方案的高表面 積纖維的實例為"有翼"纖維，其自AllassoIn化stries,Inc. (Ralei曲，NC)商售可得。 Allasso有翼纖維的截面SEM圖像提供在圖1 (d)中。運些纖維提供在約1-14平方米/克 范圍內的表面積。該纖維介質的表面積測量通過常規氣體吸附技術確定，例如使用氯或氮 氣的化unauer、Emmett和Teller度ET)的方法。
[0008] 本文還公開了將例如提供陰離子交換（AE訝官能團的表面懸垂官能基團到高表 面積纖維的方法。該懸垂官能團可用于疫苗和例如流感病毒的病毒的離子交換色譜純化。
[0009] 本文公開的實施方案還設及用包含高表面積官能化纖維的介質純化疫苗和病毒 的方法。運些方法可W流通模式或結合/洗脫模式進行。
[0010] 根據某些實施方案，本文公開的介質具有高床滲透率（例如，300-900毫達西）、相 對于基于珠粒的色譜介質而言的低材料成本、20-60mg/mLBSA動態結合、高分離效率（例 如，肥TP< 0.lcm)、50-200mg/gIgG靜態結合容量和吸附物至配體結合位點的快速對流主 導輸送。
[0011] 根據某些實施方案，使用獨特的高表面積壓紡纖維（例如，熱塑性纖維）在構造成 0.5-6mm長的隨機定向切斷纖維的填充床時允許高流動滲透率（液體）和均勻流動分布。 提供使所述纖維表面官能化的化學處理方法W使得基于一種或多種吸附相互作用的分離 可行。化學處理方法可基于離子、親和性、疏水等相互作用或相互作用的組合將多種表面化 學官能團賦予所述纖維。纖維生產和簡單表面化學處理方法的組合經濟產生用于在生物醫 藥W及疫苗生產和病毒純化中的純化操作的經濟且可容易地規模化的技術。
[0012] 根據某些實施方案，提供允許快處理速率的吸附分離材料，因為，與基于珠粒的介 質形成相比，溶質向纖維表面和自纖維表面的質量輸送主要通過穿過介質的流體對流來控 審IJ，在基于珠粒的介質中，擴散輸送要求接觸時間較長且因此處理速率較慢。提供捕集或除 去諸如病毒等大生物物種的能力，運些生物物種由于珠粒孔的空間局限而不能使用常規基 于珠粒的介質有效地分離。
[0013] 附圖簡述 圖1(a)為根據現有技術的纖維的示意圖； 圖1(b)為可根據某些實施方案使用的隆起纖維的示意圖； 圖1(c)為根據某些實施方案具有連接的懸垂基團的圖化的纖維的示意圖； 圖1 (d)為可根據某些實施方案使用的隆起纖維的SEM圖像； 圖1(e)為根據某些實施方案的纖維的官能化的示意圖； 圖2為根據某些實施方案BSA-膠乳顆粒對于所選的吸附物的靜態結合容量的繪圖； 圖3 (a)-(d)為各種纖維的SEM圖像； 圖4為AEX纖維介質W及所選的商業膜吸附器和基于珠粒的AEX介質收集的流通級分 的巫6LRV的繪圖； 圖5為洗脫池Φ6滴度的繪圖； 圖6為病毒清除比較的繪圖； 圖7為流感病毒突破的繪圖； 圖8為流感病毒突破的繪圖； 圖9為流通MVM清除LRV值的繪圖； 圖10為根據某些實施方案呈雪花形狀的纖維的橫截面圖； 圖11為根據某些實施方案呈太陽形狀的纖維的橫截面圖； 圖12為根據某些實施方案呈維菊形狀的纖維的橫截面圖； 圖13(a)-(e)為根據某些實施方案具有突出和分支亞突出的纖維的橫截面圖；和 圖14(a)-(d)為根據某些實施方案具有增加的表面積的成型纖維的橫截面圖。
[0014] 發明詳述 根據本文公開的實施方案的成型纖維介質僅依賴于纖維本身的表面。因為所述成型纖 維提供高表面積W及高流動滲透率，所W不必加入瓊脂糖水凝膠或多孔微粒來加強在纖維 載體上的可用表面積W滿足關于容量和效率的性能目標。此外，不需要通過加入水凝膠或 多孔微粒增強表面積，本文所述的介質的生產成本被保持到最低。
[0015] 纖維可具有任何長度和直徑且優選為切斷纖維或短纖維或非機織織物。它們不必 結合在一起成為集成結構，而可有效地充當單個離散實體。它們可W呈連續長度的形式， 例如不確定長度的線或單絲，或者它們可例如通過切割諸如非機織或機織織物的纖維材料 (例如，短纖維）、將連續長度纖維切成單個碎片，通過結晶生長方法等形成而形成較短的 單個纖維。優選所述纖維由熱塑性聚合物制成，所述熱塑性聚合物，例如聚丙締、聚醋、聚乙 締、聚酷胺、熱塑性氨基甲酸乙醋、共聚醋或液晶聚合物。優選具有約1-3的旦尼爾的纖維。 在某些實施方案中，所述纖維具有約1ym-約100μηι的截面長度和約1μηι-約100μηι的 截面寬度。一種合適的纖維具有約20μm的截面長度和約10μm的截面寬度及約1. 5的旦 尼爾。具有約l〇,〇〇〇cm2/g-約l，000,000cm2/g的表面積的纖維為合適的。優選所述纖維 具有約10-20μm的截面長度。
[0016] 在某些實施方案中，所述纖維可在壓縮下容易地填充到具有適當的開口和尺寸的 裝置或容器中W適應所述應用。所述纖維也可W預成形床格式使用，例如在非織造織物工 業中常見的通過紡粘（長絲）或濕法成網（切斷纖維）產生的非織造片料。合適的預成 形纖維格式包括片材、墊子、網格、整體料等。
[0017] 在某些實施方案中，所述纖維截面通常為翼形的，具有本體區域和從所述本體區 域向外徑向延伸的多個突出。所述突出形成沿所述纖維的長延伸的一陣列共線通道，通常 每根纖維20-30個運樣的通道。在某些實施方案中，所述突出的長度與所述本體區域的長 度相比較短。在某些實施方案中，所述纖維截面通常為翼形的，其具有包括向下行進到所述 纖維的中屯、的縱軸的中間區域且具有從所述中間區域延伸的多個突出（圖1(d))。在某些 實施方案中，多個所述突出通常從所述中間區域徑向延伸。由于該構造，多個通道由所述突 出限定。在突出之間的合適通道寬度的范圍為約200-約1