一種陰離子交換層析柱的清洗方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及層析柱的清洗方法，特別涉及一種陰離子交換層析柱的清洗方法。
【背景技術】
[0002] 陰離子交換層析法是大量生產目的蛋白的首選方法，與其它方法相比，它的交換 載量較大，去除雜多糖和DNA的效果好，且易于放大。在生物制藥領域，陰離子交換層析柱 被廣泛應用。在陰離子交換層析柱使用后，填料中會有一些殘留物質，可能會對下次使用造 成污染，引入外來污染物，比如會對下一次使用引入內毒素或者將上一次沒有清洗干凈的 蛋白引入到下次產物中。
[0003] 現有清洗方法主要用水浸泡沖洗，或用緩沖溶液，酸，堿等溶液進行浸泡沖洗，但 因沒有適當的檢測方法對清洗過的填料進行檢測，對清洗效果無法保障。為保證每次使用 后的陰離子交換層析柱清洗干凈，不會對下一次使用造成污染，需要建立規范的陰離子交 換層析柱的清洗流程。
[0004] 本發明經過研究，找到一種簡單易行，適合工業化的清洗方法，即通過七步清洗 法，可以保證內毒素和總有機碳清洗合格。本發明通過固定并優化的清洗方法對陰離子交 換層析柱進行清洗，使得陰離子交換層析柱清洗效果得到了保障，去除了陰離子交換層析 內的內毒素，微生物以及上一次使用殘留的蛋白，確保了總有機碳檢驗合格。

【發明內容】

[0005] 本發明提供了一種陰離子交換層析柱的清洗方法，所述清洗是指對使用過或將要 使用的不潔填料進行清洗，清洗合格后進行下一次的柱層析。
[0006]本發明所述陰離子交換層析柱，其填料為任何一種具有陰離子交換層析功能的填 料，優選：StreamlineDEAE，StreamlineQ?最優選的為StreamlineDEAE。
[0007] 上述填料均可以通過現有技術制備，也可通過購買得到。
[0008] 本發明提供一種陰離子交換層析柱的清洗方法，包括如下步驟：
[0009]步驟1，
[0010] 將不潔的陰離子交換層析柱填料，用水清洗，再用含有氫氧化鈉和氯化鈉的水溶 液清洗；
[0011] 步驟 2，
[0012] 用水洗掉氫氧化鈉和氯化鈉,再用異丙醇清洗,再用乙酸清洗；
[0013]步驟 3，
[0014] 用水清洗,再用含有氫氧化鈉和氯化鈉的水溶液清洗；
[0015]步驟 4，
[0016] 用平衡緩沖液（pH5. 0-8)清洗。
[0017] 根據需要，本發明還包括步驟，5和步驟6的步驟，如下：
[0018]步驟 5，
[0019] 取步驟4得到的清洗液，滴磷酸，觀察有無沉淀產生，如無沉淀，用總有機碳分析 儀測定該清洗液，測定結果低于500ppm，則表示清洗合格。
[0020] 步驟 6，
[0021] 若有沉淀產生，須用水將清洗液稀釋直至滴加磷酸后無沉淀出現后，將稀釋后的 清洗液用總有機碳分析儀測定該清洗液，測定結果乘以稀釋倍數獲得的數據低于500ppm， 則表示清洗合格。
[0022] 本發明所述的陰離子交換層析柱，優選填料為StreamlineDEAE;柱型號： BPG100/500或XK26/20或XK50/20,優選BPG100 ;柱子徑高比：（0? 5-1):1，優選（0?5-0.6): 1。最優選柱子高18cm以內，直徑：10cm。
[0023] 本發明的清洗方法，可以將填料從層析柱上取下后在容器中清洗，也可裝在層析 柱中清洗，優選裝在層析柱中清洗，其中清洗液流速為120-150ml/min，優選120ml/min。本 發明步驟（1)、（2)、（3)中，水用量為3900~4200ml(優選為3900ml)，所述水優選為注射 用水。
[0024] 本發明步驟（1)、（3)中所述的NaOH含NaCl溶液是指用0.5~IMNaOH含1~ 2MNaCl清洗3900~4200ml，優選0. 5MNaOH含IMNaCl清洗3900ml。具體配制如下：分 別稱取160.Og氫氧化鈉和468g氯化鈉，用注射用水將其移入血清瓶或儲液袋中，放入攪拌 子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內溶液標定到8L，繼續攪拌 2分鐘。配制后放置于2~12°C環境的準備間指定區域內備用。
[0025] 氫氧化鈉一直被認為能有效去除蛋白和核酸，同時它還能滅活大多數的病毒、細 菌、酵母、真菌以及內毒素。氫氧化鈉能皂化脂肪并且可溶解蛋白，氫氧化鈉將蛋白和核酸 從層析介質中去除的能力主要取決于介質本身性質、樣品、以及干擾清洗效果的樣品中的 污染物性質。
[0026] 本發明步驟（2)中所述的異丙醇、乙酸清洗，優選用用30~40%異丙醇清洗 3900~4200ml，再用25~30%乙酸清洗3900~4200ml，最佳為30%異丙醇清洗3900ml, 25% 乙酸清洗3900ml。具體配制如下：
[0027] 25%乙酸(冰醋酸）：取乙酸2000ml，用注射用水將其移入血清瓶或儲液袋中，放入 攪拌子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內溶液標定到8L，繼續 攪拌2分鐘。配制后放置于2~12°C環境的準備間指定區域內備用。
[0028] 30%異丙醇：取異丙醇2400ml，用注射用水將其移入血清瓶或儲液袋中，放入攪拌 子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內溶液標定到8L，繼續攪拌 2分鐘。配制后放置于2~12°C環境的準備間指定區域內備用。
[0029] 本發明的異丙醇和乙酸，能夠有效的去除層析柱中的蛋白及不溶于水的脂類化合 物。
[0030] 本發明步驟（4)中所述的緩沖液為磷酸緩沖液，優選平衡緩沖液為0.Olmol/L磷 酸緩沖液，PH6. 0,含 0. 1-0. 2MNaCl。具體為 0.Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1 含 0.IM NaCD0
[0031] 所述0?Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1含0?lmol/LNaCl)的配制：稱取氯化鈉 58. 9g，磷酸二氫鈉12g，磷酸氫二鈉2. 0g，用注射用水將其移入血清瓶或儲液袋中，放入攪 拌子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內溶液標定到10L，繼續 攪拌2分鐘，確定其pH值在6. 0±0. 1范圍內。配制后放置于2~12°C環境的準備間指定 區域內備用。
[0032] 本發明步驟（5)中所述的滴磷酸，是將清洗液加到容器中，加入濃度的磷酸，靜置， 肉眼觀察有無沉淀析出。其目的是初步確認清洗液中含碳量，如果出現沉淀說明含碳量較 高，可能在檢驗過程中會堵塞總有機碳分析儀管路。
[0033] 所述用總有機碳分析儀測定，是用總有機碳分析儀清洗液中的總有機碳濃度本發 明步驟（6)中所述的須用水稀釋清洗液，方法如下：若有沉淀產生，須用水將清洗液稀釋直 至滴加磷酸后無沉淀出現后，將稀釋后的清洗液用總有機碳分析儀測定該清洗液，測定結 果乘以稀釋倍數獲得的數據低于500ppm，則表示清洗合格。
[0034] 本發明相關術語的解釋：
[0035] 1、陰離子交換層析：是蛋白分離的一種技術，主要依賴電荷間的相互作用，利用帶 電分子中電荷微小差異進行蛋白質分離。
[0036] 2、內毒素：是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是 有毒性的。內毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后才釋放出來。
[0037] 3、總有機碳（T0C):是指水體中溶解性和懸浮性有機物含碳的總量。TOC是一個快 速檢定的綜合指標，它以碳的數量表示水中含有機物的總量，單位為ppm或ppb。在國際上 TOC被作為評價水體中有機物污染程度的一項重要參考指標。
[0038] 試驗例一，工藝的選擇
[0039] 本發明的陰離子交換層析柱的清洗方法及參數是經過篩選獲得的，篩選過程如 下：
[0040] 1、清洗步驟的選擇：
[0041]表1
[0042]
[0043] 本發明經過5次清洗液的清洗，內毒素和總有機碳均符合標準。
[0044] 2、清洗液濃度的選擇
[0045] 下表2清洗液按照實施例的順序沖洗，結果如下：0. 5M NaOH含2MNaCl與IM NaOH 含3MNaCl清洗效果類似，出于降低能耗考慮，優選0. 5M NaOH含l-2MNaCl
[0046]表2
[0047]
[0051] 從上表可見，清洗液用體積4200與4500效果相同，出于節省原則，優選清洗液體 積為 3900-4200ml。
[0052] 以下通過比較實驗證明本發明的有益效果：
[0053] 現有技術沖柱子方法與本發明的方法進行比較
[0054]表 4
[0055]
[0056]
[0057] 現有技術沖柱子方法I:
[0058] 將使用過的陰離子交換層析柱用2600ml注射用水清洗，用2600ml0. 5MNaOH含IM NaCl清洗，用2600ml注射用水清洗，用2600ml30%異丙醇清洗