一種抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法
【專利摘要】本發明提供了一種抗體偶聯藥物(ADC)的陽離子交換層析純化方法，所述陽離子交換層析可選用結合-洗脫模式或過載模式進行純化，可將ADC藥物的偶聯比（DAR)控制在目標工藝范圍內，同時起到去除多聚體的作用。這是一種新的ADC制備純化工藝，可降低生產的成本和風險，同時實現對ADC藥物的小分子/抗體的摩爾偶聯比(DAR)和多聚體的控制，有助于開發可控性更強、成本和風險更低的ADC生產工藝，以獲得質量更高的產品，保證用藥安全和治療效果。
【專利說明】一種抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質分離純化【技術領域】，具體而言，本發明涉及一種抗體偶聯藥物 (ADC)的陽離子交換層析純化方法。
[0002] 技術背景
[0003] 抗體-小分子藥物偶聯物（Antibody-drug conjugate, ADC)是新一代抗體革巴 向治療藥物，主要應用于癌癥腫瘤的治療。ADC藥物由小分子細胞毒性藥物（Drug)、抗體 (Antibody)以及連接抗體和化藥的接頭（Linker)三部分組成，小分子毒素通過化學偶聯 的方法結合到抗體蛋白上。抗體會特異地識別并引導小分子藥物到達表達癌癥特異性抗 原的癌細胞靶點，并通過細胞內吞效應進入癌細胞。接頭部分在胞內低pH值環境或溶酶 體蛋白酶的作用下斷裂，釋放出小分子細胞毒素，從而達到特異殺死癌細胞而不損傷正常 組織細胞的作用。因此，ADC藥物同時結合了抗體的靶向專一性和小分子毒素對癌細胞的 高毒性的特點，大大擴展了藥物的有效治療劑量窗口（Therapeutic window)。臨床研究 已證明，ADC抗體藥效高、在血液中相對穩定，能有效地降低小分子細胞毒素(化藥）本身 對循環系統以及健康組織的毒性，是目前國際上抗癌藥物的研發熱點（Rachel S. Zolot， Satarupa Basu, Ryan P. Million. Antibody - drug conjugates. Nature reviews Drug Discovery. 2013， 12: 259-260)。
[0004] 目前國外已有兩個ADC藥物獲批上市銷售。2011年8月19日，FDA批準Seattle Genetics公司開發的Brentuximab Vedotin (商品名Adcetris)上市，用于治療CD30陽性 的霍杰金淋巴瘤（HL)和罕見疾病系統性間變性大細胞淋巴瘤（SALCL)。2013年2月22日， Genentech 公司開發的 ado-trastuzumab emtansine (T-DM1，商品名 Kadcyla)獲 FDA 批準 上市銷售，主要用于治療Her2陽性晚期(轉移性)乳腺癌。另外，國際上還有超過30種ADC 藥物處在臨床開發階段（Asher Milliard. Maturing antibody-drug conjugate pipeline hits 30. Nature reviews Drug Discovery, 2013, 12: 329-332)〇
[0005] 目前ADC藥物常用的偶聯方式包括：賴氨酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯和 定點偶聯（Beck A, Reichert J M. Antibody-drug conjugates: Present and future. Mbs, 2014，6:15-17)。賴氨酸隨機偶聯平臺摶術利用雙功能閉奪聯試劑，對抗體的賴 氨酸殘基進行隨機修飾，再與美登素衍生物DM1、DM4或其它類似物的巰基反應實現偶 聯，已經上市的T-DM1 (Kadcyla)即采用這一技術。輕重鏈間還原件二硫鍵偶聯則誦 過還原抗體鏈間的二硫鍵產生的半胱氨酸殘基，再與含多肽接頭的海兔毒素衍生物甲基 澳瑞他汀E (MMAE)、甲基澳瑞他汀F (MMAF)或其它類似物反應實現偶聯，另一種市售 的ADC藥物Adcetris則采用了這種平臺技術。定點偶聯模式目前還處于早期研發階段 (Siler Panowski, Sunil Bhakta, Helga Raab, Paul Polakis and Jagath R Junutula. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. MAbs, 2014, 6: 34 -45)。
[0006] 對于賴氨酸隨機偶聯技術，由于IgG單克隆抗體上有幾十個賴氨酸殘基可供修 飾，因此雙功能交聯試劑與賴氨酸殘基的連接是非特異的，小分子毒素與抗體結合數量和 位置呈隨機正態分布模式。而對于輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯，如IgGl單抗中有8個鏈間 半胱氨酸可供偶聯。偶聯位點的多樣性導致了 ADC產品的異質性，偶聯反應得到的產品實 際是各種ADC的混合物，因此小分子藥物和抗體的摩爾偶聯比（Drug Antibody Ratio, DAR) 是十分重要的質控參數。DAR值代表每個抗體上平均偶聯的小分子個數，DAR值過低則導 致ADC藥物未能達到預期的生物活性，而DAR值過高則會影響ADC藥物的安全性、穩定性 及代謝特征，甚至藥效也有可能隨著DAR值的增加而降低（Hamblett KJ，Senter PD，Chace DF, et al. Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody drug conjugate. Clin Cancer Res，2004,10: 7063-7070)。對于目前已經上 市的ADC藥物而言，理想的DAR值應該控制在3?4之間，甚至更窄的范圍。另外，由于偶 聯工藝過程常涉及有機溶劑的加入以及攪拌操作，不可避免地導致抗體蛋白產生交聯物和 多聚體，這些與工藝相關的雜質常可能引起免疫原性及其他副作用。
[0007] 鑒于DAR值和多聚體含量均為ADC藥物的關鍵質控參數，因此需要從偶聯和純 化工藝著手，將DAR值控制在目標范圍內，確保批間生產的一致性和穩定性，并盡可能控 制和去除產品中副產物聚集體的含量。修飾偶聯工藝非常復雜，尤其是隨機偶聯工藝。 如要將DAR值控制在很窄的范圍內相當具有難度，對工藝的要求極高。而偶聯工藝失敗 的概率高(主要體現在DAR值的控制方面)，若沒有很好的手段避免DAR值控制失敗的風 險，則會使生產成本大量增加。對現有技術文獻進行檢索后發現，ADC藥物的純化工藝主 要涉及采用G25葡聚糖凝膠層析或切向流過濾（UF/DF)的方式去除未偶聯到抗體上的 小分子接頭和小分子毒素，其層析介質和膜介質均為非離子交換模式（CN 101267841 B; Brun MP, Gauzy-Lazo L. Protocols for lysine conjugation. Methods Mol Biol., 2013, 1045:173-87 ；Stefano JE, Busch M, Hou L, Park A, Gianolio DA. Micro- and mid-scale maleimide-based conjugation of cytotoxic drugs to antibody hinge region thiols for tumor targeting. Methods Mol Biol. , 2013, 1045:145-71 )〇 而陰 離子層析介質在ADC藥物純化的應用發面，也僅涉及采用流穿模式的陰離子層析方法進行 多聚體的去除（CN 103254311 A)。通過純化手段控制DAR值的技術目前是空缺的。另外， 無論隨機偶聯還是定點偶聯技術，均存在修飾偶聯反應過程中蛋白質聚集的問題。若能通 過純化的手段，降低抗體偶聯藥物的副產物，同時提高DAR值的可控性，對于提升ADC產品 質量以及降低工藝風險和成本而言，具有十分重要的現實意義。
[0008]


【發明內容】

[0009] 針對ADC藥物純化方面現有技術的不足和空缺，本發明提供了一種抗體偶聯藥物 (ADC)的陽離子交換層析純化方法，通過所述陽離子純化技術，同時實現對ADC藥物的小分 子/抗體的摩爾偶聯比（DAR)和多聚體的控制，這有助于開發可控性更強、成本和風險更低 的ADC生產工藝，以獲得質量更高的產品，保證藥物的安全性和治療效果。
[0010] 為了實現上述目的，本發明詳細的技術方案如下： 一種抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，利用陽離子交換層析來純化抗體偶聯 藥物，控制小分子/抗體偶聯比（DAR)和多聚體，所述純化方法包括以下步驟： 調節ADC樣品及平衡緩沖液至pH 4-7、電導2-8 mS/cm，選用結合-洗脫模式或過載模 式進行純化。
[0011] 進一步的，所述的過載模式上樣量不低于300 mg/mL介質；所述的過載模式的過 程包括：平衡緩沖液平衡層析介質，然后進行抗體偶聯藥物上樣，待ADC樣品吸附飽和繼而 開始流穿后，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標蛋白流穿液，雜質多聚體以及DAR值 偏高的蛋白質則吸附在層析柱上。
[0012] 進一步的，所述的結合-洗脫模式上樣量不超過層析介質實際動態載量的90% ;所 述的結合-洗脫模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質，然后進行抗體偶聯藥物上樣， 并用洗脫緩沖液（pH 4-7,電導10-30 mS/cm)對結合的ADC抗體進行梯度洗脫，分段收集洗 脫液，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標蛋白洗脫液，而雜質多聚體以及DAR值偏高 的蛋白質則在其后洗脫出來。
[0013] 進一步的，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液選自但不限于醋酸鹽緩沖液、檸檬酸 鹽緩沖液、琥珀酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
[0014] 進一步的，所述的陽離子交換層析介質選自但不限于Eshmuno CPX (Millipore)、 P0R0S HS (AB)、P0R0S XS (AB)、Toyopearl Gigacap S-650M (T0S0H)、Toyopearl SP-650M (T0S0H)、Nuvia HR-S (Bio-Rad)和 SP S印harose (GE)，優選 Eshmuno CPX 和 P0R0S XS 這 兩種新型的高載量陽離子層析介質。
[0015] 進一步的，所述的抗體偶聯藥物由小分子毒素通過接頭與抗體偶聯構成，其中偶 聯比（DAR)為2-5。尤其適用于處理DAR值偏高（彡3. 7)的ADC樣品。
[0016] 進一步的，所述的抗體為單克隆抗體，優選的，所述的單克隆抗體為人源化單克隆 抗體。
[0017] 進一步的，所述的小分子毒素選自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍 生物。
[0018] 進一步的，所述的抗體偶聯藥物的偶聯方式包括但不限于賴氨酸偶聯、輕重鏈間 還原性二硫鍵偶聯和定點偶聯。
[0019] 收集的樣品分別采用紫外（UV)分光光度法進行DAR值監測，采用分子排阻液相色 譜法（SEC-HPLC)進行多聚體含量監測。
[0020] 本發明中，ADC樣品的定義為：將抗體通過接頭與小分子毒素進行共價結合后所 形成的抗體偶聯藥物，涉及賴氨酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯和定點偶聯等不同的 偶聯方式。所述的抗體可為多克隆抗體或單克隆抗體，優選單克隆抗體。小分子毒素可選 自美登素衍生物DM1 (N2' -脫乙酰-N2' -3-巰基-1氧代丙基）-美登素)、DM4 (N2' -脫 乙酰-N2' -4-甲基-4巰基-1氧代戊基）-美登素）及其類似物、海兔毒素衍生物MMAE (Monomethyl Auristatin E，甲基澳瑞他汀 E)、MMAF (Monomethyl Auristatin F，甲基澳 瑞他汀F)及其類似物。優選的小分子毒素為DM1。所述的接頭優選為SMCC (4- (N-馬來 酰亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)。
[0021] 本發明通過pH 4-7、電導2-8 mS/cm范圍內的動態載量D0E實驗確定所述的陽離 子交換層析法的上樣條件。
[0022] 在本發明中，所述的過載陽離子交換層析法采用流穿模式，適用于大規模樣品的 處理，層析載量超過300 mg/mL介質。
[0023] 在本發明中，所述的陽離子交換層析法采用結合-洗脫模式，上樣量不超過層析 介質實際動態載量的90%。對于高載量陽離子層析介質而言，通過控制收集范圍可將DAR值 維持在極窄的目標范圍（3. 5±0. 1)內。對于賴氨酸偶聯的ADC樣品，多聚體的去除率可達 到40%以上，回收率可維持在86%以上；對于半胱氨酸偶聯的ADC樣品，多聚體的去除率可 達到60%以上，回收率也可維持在79%以上。
[0024] 本發明相比現有技術的有益效果為： 1、 本發明提供了一種ADC制備和純化的新思路。ADC藥物的DAR值決定了產品的有效 性和毒性，因此需將其控制在一個穩定的范圍內。另外，作為工藝相關雜質，多聚體的存在 會引起免疫原性，應盡可能使產品中多聚體的含量降至最低。本發明通過一種純化的手段， 即采用陽離子交換層析的方法，對修飾偶聯工藝的關鍵中控指標DAR值實施有效地控制和 糾偏，同時實現多聚體的大比例去除；本發明有別于傳統裸抗體的純化策略，首次將陽離子 交換層析應用于ADC樣品的DAR值控制，擴展了陽離子交換層析方法的應用范圍和用途； 2、 本發明還提供過載模式與結合-洗脫模式這兩種不同的純化方案，在實際研發和生 產過程中，可根據工藝規模、處理量、產品的狀態靈活地選擇最適合的純化方式。如過載模 式尤其適用于大量ADC樣品的純化，因其受純化介質的載量限制較少，而且操作簡便。而結 合-洗脫模式雖然處理量不如過載模式，但可通過控制收集范圍對DAR值和多聚體含量實 現更為精細的控制。綜上所述，本發明可起到降低ADC產品的生產成本和控制風險、提高工 藝可控性和產品質量的作用。
[0025]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為實施例5中三種層析介質P0R0S HS (A)、P0R0S XS (B)和Eshmuno CPX (C)的動態載量（DBC)等高線圖，橫坐標為pH，縱坐標為電導。顏色越深的區域DBC越高， 亦即選用顏色越深的區域所對應的pH和電導，介質對樣品的吸附載量越高。D0E實驗的考 察范圍為pH 4-7,電導2-8 mS/cm。
[0027] 圖2為實施例6中采用層析介質P0R0S HS的過載模式進行不同流速純化ADC樣 品的結果。其中圖A為AKTA譜圖，橫坐標為ADC樣品的上樣量，縱坐標為UV28Qnm處的吸收 值（mAU)，樣品吸附飽和后開始流穿，P1和P2分別為400 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導24 mS/cm)洗脫峰和0. 5 M NaOH洗脫峰。其中圖B為多聚體及DAR值的測定結果，橫坐標為經 純化的ADC樣品的合并收集量(mg)，左縱坐標為收集的樣品合并后的多聚體含量與原液中 多聚體含量的比值（C/Q)，右縱坐標為收集的樣品所對應的合并后DAR值。先流穿出來的 ADC樣品，多聚體含量和DAR值均較低。不同流速下，DAR值曲線均呈上升趨勢，而C/Q曲 線上升的速率不同，低流速下C/Q到達平臺期更緩慢，有利于多聚體的去除。
[0028] 圖3-圖7均為實施例7中的結合-洗脫模式純化結果，其中圖3、圖4、圖5分別為 層析介質P0R0S 50 HS (圖3)、P0R0S XS (圖4)和Eshmuno CPX (圖5)在賴氨酸偶聯ADC 樣品中的應用，圖6、圖7分別為層析介質P0R0S XS (圖6)和Eshmuno CPX (圖7)在半胱 氨酸偶聯ADC樣品中的應用。其中A圖為純化AKTA色譜圖，橫坐標為流出體積（mL)，左縱 坐標為UV 28(tam處的吸收值（mAU)，右縱坐標為溶液的電導值，ADC樣品隨著電導逐漸升高不 斷被洗脫下來。其中B圖為分段收集ADC樣品的多聚體（HMW)和DAR值測定結果，橫坐標 為收集的體積，左縱坐標為收集的樣品中多聚體含量與原液中聚體含量的比值（C/Q)，右 縱坐標為收集的樣品所對應的DAR值。先洗脫出來的樣品多聚體含量低，DAR值也較低；而 多聚體含量高、DAR值較高的組分則在其后洗脫下來，這樣就可達到分離多聚體組分和控制 樣品DAR值的目的。圖C為分子排阻色譜（SEC-HPLC)的色譜圖，橫坐標為蛋白質出峰時間 (min)，縱坐標為UV 28(lnm處的吸收值(mAU)，單體目標蛋白在15-16 min出峰，多聚體在12-14 min出峰，后洗脫出來的樣品多聚體比例明顯升高。
[0029]

【具體實施方式】
[0030] 實施例1 一種抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，利用陽離子交換層析來純化抗體偶聯 藥物，控制小分子/抗體偶聯比（DAR)和多聚體，所述純化方法包括以下步驟： 調節ADC樣品及平衡緩沖液至pH 4-7、電導2-8 mS/cm，選用結合-洗脫模式或過載模 式進行純化。
[0031] 進一步的，所述的過載模式上樣量不低于300 mg/mL介質；所述的過載模式的過 程包括：平衡緩沖液平衡層析介質，然后進行抗體偶聯藥物上樣，待ADC樣品吸附飽和繼而 開始流穿后，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標蛋白流穿液，雜質多聚體以及DAR值 偏高的蛋白質則吸附在層析柱上。
[0032] 進一步的，所述的結合-洗脫模式上樣量不超過層析介質實際動態載量的90% ;所 述的結合-洗脫模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質，然后進行抗體偶聯藥物上樣， 并用洗脫緩沖液（pH 4-7,電導10-30 mS/cm)對結合的ADC抗體進行梯度洗脫，分段收集洗 脫液，收集DAR值和多聚體含量符合要求的目標蛋白洗脫液，而雜質多聚體以及DAR值偏高 的蛋白質則在其后洗脫出來。
[0033] 進一步的，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液選自但不限于醋酸鹽緩沖液、檸檬酸 鹽緩沖液、琥珀酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
[0034] 進一步的，所述的陽離子交換層析介質選自但不限于Eshmuno CPX (Millipore)、 P0R0S HS (AB)、P0R0S XS (AB)、Toyopearl Gigacap S-650M (T0S0H)、Toyopearl SP-650M (T0S0H)、Nuvia HR-S (Bio-Rad)和 SP S印harose (GE)，優選 Eshmuno CPX 和 P0R0S XS 這 兩種新型的高載量陽離子層析介質。
[0035] 進一步的，所述的抗體偶聯藥物由小分子毒素通過接頭與抗體偶聯構成，其中偶 聯比（DAR)為2-5。尤其適用于處理DAR值偏高（彡3. 7)的ADC樣品。
[0036] 進一步的，所述的抗體為單克隆抗體，優選的，所述的單克隆抗體為人源化單克隆 抗體。
[0037] 進一步的，所述的小分子毒素選自但不限于美登素衍生物和海兔毒素衍生物。
[0038] 進一步的，所述的抗體偶聯藥物的偶聯方式包括但不限于賴氨酸偶聯、輕重鏈間 還原性二硫鍵偶聯和定點偶聯。
[0039] 收集的樣品分別采用紫外（UV)分光光度法進行DAR值監測，采用分子排阻液相色 譜法（SEC-HPLC)進行多聚體含量監測。
[0040] 本發明通過pH 4-7、電導2-8 mS/cm范圍內的動態載量DOE實驗確定所述的陽離 子交換層析法的上樣條件。
[0041] 實施例2抗體偶聯藥物（ADC)的制備 賴氨酸偶聯ADC樣品的制備：進行修飾反應前，將抗體(Ab)原液置換至修飾反應緩沖 溶液中。加入雙功能交聯試劑SMCC (接頭)對賴氨酸進行修飾，反應持續2-3小時。修飾反 應結束后，通過G25葡聚糖凝膠層析或切向流過濾（UF/DF)系統除去未與抗體連接的SMCC， 并將修飾后的中間產物Ab-MCC置換到偶聯緩沖液（pH 5-6)中。隨后加入小分子毒素 DM1， 與抗體上的接頭偶聯，反應持續3-15小時，得到備用的賴氨酸偶聯ADC樣品（Ab-DMl )，紫外 分光光度法測得DAR值為3. 7-3. 8。
[0042] 半胱氨酸偶聯ADC樣品的制備：將Ab原液置換至反應緩沖液中（pH 7-8)。加入還 原劑TCEP反應1-2小時，使得抗體的鏈間二硫鍵被打開，形成游離的巰基。隨后加入連有 接頭的小分子毒素 MMAE (MC-VC-PAB-MMAE)，與抗體上被還原的巰基偶聯。反應結束后，力口 入N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC)終止反應。調節pH至5-6,得到備用的半胱氨酸偶聯ADC 樣品（Ab-MMAE)，紫外分光光度法測得DAR值為4. 1-4. 2。
[0043] 實施例3DAR值測定 實施例2制備所得的ADC樣品，采用紫外（UV)分光光度法測定小分子藥物/抗體的偶 聯比。根據抗體和藥物在不同波長處的消光系數不同，由二元一次方程求導藥物抗體偶聯 t匕（DAR)。具體為：將抗體偶聯物稀釋至0. 3~0. 5 mg/mL，在230?330 nm波長內對稀釋后 的ADC樣品進行吸光度掃描。抗體的最大吸收峰在280 nm，小分子DM1的最大吸收峰在252 nm，小分子MMAE的最大吸收峰在248 nm。對于Ab-DMl樣品分別選取252 nm和280 nm處的 吸光度，對于Ab-MMAE樣品則分別選取248 nm和280 nm處的吸光度，按照文獻(于傳飛等. 一種抗體藥物偶聯物中藥物抗體偶聯比的測定.藥學學報，2014，49 (3): 363-367)所 述的方法，計算DAR值以及ADC樣品的濃度。
[0044] 實施例4多聚體檢測 實施例2制備所得的ADC樣品，通過分子排阻色譜法（SEC)測定其多聚體的含量。所 使用的液相色譜柱為TSKG3000SWXL，使用的高效液相系統為Agilent HPLC系統。流動相為 含15%異丙醇的磷酸鹽緩沖液（pH 7)，檢測波長為280 nm。充分平衡色譜柱，待基線穩定 后進樣。進行等度洗脫，流速為0.5 mL/min，柱溫25°C。按照面積歸一法計算ADC樣品中 多聚體和單體所占的比例。
[0045] 實施例5不同的層析介質中ADC樣品的動態載量 將實施例2中制得的ADC樣品置換到65 mM醋酸鈉緩沖液中（pH 5-6,電導5 mS/cm)。 置換后的樣品等分后，分別用1 Μ醋酸或1 M NaOH將ADC樣品的pH調整至4-7,用相應 pH的400 mM醋酸鈉緩沖液或純化水調節電導至2-8 mS/cm。分別將層析介質P0R0S HS、 P0R0S XS和Eshmuno CPX裝填到層析柱中。利用AKTA Purifier 100層析系統，以相應pH 和電導的醋酸鈉緩沖液（10倍柱體積以上）充分平衡層析柱后，以120 cm/hr的流速上樣， 通過UV28(tam處的吸收值監測樣品的流穿情況。待UV28tol曲線上升趨于平緩，結束上樣。流 動相切換成400 mM醋酸鈉緩沖液進行洗脫，最后用0.5 M NaOH溶液清洗層析柱。計算10% 穿透時的動態載量。利用JMP 10軟件，繪制不同的層析介質、不同的pH和電導條件下測得 的ADC樣品動態載量結果的等高線圖，結果如附圖1所示。依此確定陽離子交換層析的上 樣條件，上樣載量控制為不超過層析介質實際動態載量的90%。可以看到，Eshmuno CPX和 POROS XS這兩種新型的陽離子純化介質具有較高的動態載量。
[0046] 實施例6采用過載模式的陽離子交換層析方法純化ADC樣品 將實施例2中制得的ADC樣品置換到90 mM醋酸鈉緩沖液中（pH 5,電導6 mS/cm)。將 層析介質POROS 50HS裝填到層析柱中，利用AKTA Purifier 100層析系統進行過載模式的 陽離子層析實驗。用90 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導6 mS/cm)充分平衡層析柱后上樣，上 樣量為1100-1300 mg/mL介質。為了考察流速對試驗結果的影響，流速分別設定為120 cm/ hr和80 cm/hr。待ADC抗體吸附飽和繼而開始流穿后，按5-7 mL/管收集流穿液。待上樣 完成后，用90 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導6 mS/cm)沖洗平衡至基線，400 mM醋酸鈉緩 沖液（pH 5,電導24 mS/cm)洗脫，最后利用0.5 M NaOH溶液清洗層析柱。分段收集的樣品 分別采用實施例3的紫外（UV)分光光度法以及實施例4的分子排阻液相色譜（SEC-HPLC) 法進行檢測。色譜圖、SEC和DAR值的測定結果參見附圖2。
[0047] 結果顯示，不同流速下收集的目標蛋白C/Q均呈上升趨勢，說明先流穿出來的ADC 樣品多聚體含量低，可以達到去除多聚體的效果。不同流速下C/Q曲線上升的速率不同， 低流速下C/Q到達平臺期更緩慢，有利于多聚體的去除。不同流速下，DAR值曲線均呈上升 趨勢。在過載模式下，我們可以通過控制ADC樣品的上樣量實現DAR值的控制。過載模式 的處理量大,層析載量超過300 mg/mL介質，適用于大規模ADC樣品的純化。而且通過流穿 模式收集樣品，操作相對簡單。
[0048] 實施例7采用結合-洗脫模式的陽離子交換層析方法純化ADC樣品 將實施例2中制得的ADC樣品置換到90 mM醋酸鈉緩沖液中（pH 5,電導6 mS/cm)。 分別裝填三種不同的層析介質（POROS HS、POROS XS和Eshmuno CPX)的層析柱，利用AKTA Purifier 100層析系統進行結合-洗脫模式的陽離子層析實驗。首先用A液：90 mM醋酸鈉 緩沖液（pH 5,電導6 mS/cm)充分平衡層析柱后上樣，上樣量為60 mg/mL介質，流速為120 cm/hr。待上樣完成后，用90 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導6 mS/cm)沖洗至基線。然后用 B液：400 mM醋酸鈉緩沖液（pH 5,電導24 mS/cm)按0 - 100% B液、20 CV的梯度進行線 性洗脫，分段收集洗脫液。最后利用0.5 M NaOH溶液清洗層析柱。分段收集的樣品分別采 用實施例3的紫外（UV)分光光度法以及實施例4的分子排阻液相色譜（SEC-HPLC)法進行 檢測。各層析介質的色譜圖、SEC和DAR值的測定結果分別見附圖3-7及表1-5。
[0049] 如表1-5的結果所示，在結合-洗脫模式的陽離子交換層析中，合并不同階段收 集的樣品，可得到DAR值不同且多聚體去除率各異的樣品。尤其對于POROS XS和Eshmuno CPX這兩種新型的高載量陽離子層析介質而言，通過控制收集范圍可將DAR值維持在較窄 的目標范圍（3. 5±0. 1)內。如表2和表3所不，對于通過賴氨酸偶聯的ADC樣品（Ab-DMl)， 多聚體的去除率可達到40%以上，回收率可保持在86%以上。如表4和表5所示，對于通過 半胱氨酸偶聯的ADC樣品（Ab-MMAE)，多聚體的去除率可達到60%以上，回收率也可保持在 79%以上。
[0050] 本發明能夠有效地去除ADC產品中的多聚體，提高ADC產品的質量；也能夠有效地 控制ADC產品的DAR值，使得ADC產品的生產風險和成本降低、工藝可控性提高。因此，本 發明對于ADC產品的研發和生產具有重要的意義。
[0051] 表1層析介質POROS HS的結合-洗脫模式純化結果(賴氨酸偶聯ADC樣品）

【權利要求】
1. 一種抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，利用陽離子交換層析 來純化抗體偶聯藥物，控制小分子/抗體偶聯比（DAR)和多聚體，所述純化方法包括以下步 驟： 調節ADC樣品及平衡緩沖液至pH 4-7、電導2-8 mS/cm，選用結合-洗脫模式或過載模 式進行純化。
2. 如權利要求1所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的過載模式上樣量不低于300 mg/mL介質； 所述的過載模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質，然后進行抗體偶聯藥物上樣， 待ADC樣品吸附飽和繼而開始流穿后，收集目標蛋白流穿液，雜質多聚體以及DAR值偏高的 蛋白質則吸附在層析柱上。
3. 如權利要求1所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的結合-洗脫模式上樣量不超過層析介質實際動態載量的90% ; 所述的結合-洗脫模式的過程包括：平衡緩沖液平衡層析介質，然后進行抗體偶聯藥 物上樣，并用pH 4-7、電導10-30 mS/cm的洗脫緩沖液對結合的ADC抗體進行梯度洗脫，收 集目標蛋白洗脫液，而雜質多聚體以及DAR值偏高的蛋白質則在其后洗脫出來。
4. 如權利要求1-3任一項所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在 于，所述的平衡緩沖液和洗脫緩沖液選自但不限于醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸 緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
5. 如權利要求1所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所 述的陽離子交換層析介質選自但不限于Eshmuno CPX、POROS HS、POROS XS、Toyopearl Gigacap S-650M、Toyopearl SP_650M、Nuvia HR-S和 SP Sepharose。
6. 如權利要求1所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的抗體偶聯藥物由小分子毒素通過接頭與抗體偶聯構成，其中偶聯比（DAR)為2-5。
7. 如權利要求6所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的抗體為單克隆抗體。
8. 如權利要求7所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的單克隆抗體為人源化單克隆抗體。
9. 如權利要求6所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所述 的小分子毒素選自但不限于美登素及其衍生物和海兔毒素及其衍生物。
10. 如權利要求6-9所述的抗體偶聯藥物的陽離子交換層析純化方法，其特征在于，所 述的抗體偶聯藥物的偶聯方式包括但不限于賴氨酸偶聯、輕重鏈間還原性二硫鍵偶聯和定 點偶聯。
【文檔編號】B01D15/36GK104208719SQ201410492940
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月24日 優先權日:2014年9月24日
【發明者】劉慧芳, 黎曉維, 金春陽, 郜富權, 謝晨穎, 李鋒 申請人:北京天廣實生物技術股份有限公司